Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2020, T. 106, № 6, стр. 740-755
Зависимое от пола действие пренатального стресса на активность гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы крыс: роль кортикостероидных рецепторов мозга
Н. Э. Ордян 1, *, С. Г. Пивина 1, К. А. Баранова 1, В. В. Ракицкая 1, В. К. Акулова 1, Г. И. Холова 1
1 Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН
Санкт-Петербург, Россия
* E-mail: neo@infran.ru
Поступила в редакцию 11.02.2020
После доработки 15.03.2020
Принята к публикации 03.04.2020
Аннотация
Пренатальный стресс рассматривается в качестве фактора риска развития в последующей жизни таких заболеваний, как психические, сердечно-сосудистые и метаболические расстройства. Дисрегуляция активности гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАС) служит одним из механизмов возникновения этих расстройств. Регуляция ГГАС осуществляется посредством двух типов рецепторов – минералокортикоидных (МР) и глюкокортикоидных рецепторов (ГР) кортико-лимбических структур мозга. Связь между пренатальным стрессом, полом и активностью ГГАС, а также роль центральных МР и ГР в этом взаимодействии исследованы недостаточно. Нами изучено влияние пренатального стресса на активность ГГАС взрослых самцов и самок крыс и экспрессию ГР и МР в гиппокампе и медиальной префронтальной коре (мПФК). Пренатальный стресс моделировали, подвергая беременных самок крыс линии Вистар одночасовой иммобилизации с 15-го по 19-й день беременности. У взрослых потомков изучена базальная активность ГГАС и стрессорный уровень кортикостерона в ответ на 30-минутную иммобилизацию. Экспрессию ГР и МР оценивали методом вестерн-блот и дополнительно в гиппокампе иммуногистохимическим методом. У пренатально стрессированных самцов выявлено пролонгирование стрессорного ответа, а у самок – повышение базальной и стрессорной реактивности и усилении чувствительности ГГАС к сигналам обратной связи. У самцов изменения активности ГГАС сопровождались снижением содержания ГР и МР в гиппокампе и мПФК при неизменном соотношении ГР : МР. У пренатально стрессированных самок наблюдалось усиление экспрессии белка ГР и снижение количества белка МР в гиппокампе и увеличение соотношения ГР : МР в обеих областях мозга. В гиппокампе самцов и самок наибольшие изменения содержания ГР и МР выявлено в СА3 поле и зубчатой извилине. Полученные данные указывают на вклад изменения экспрессии белков ГР и МР гиппокампа и мПФК в зависимую от пола модификацию активности ГГАС в результате пренатального стресса.
Гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система (ГГАС) является ключевой гормональной системой, определяющей способность организма реагировать на повреждающие (стрессорные) события и адаптироваться к ним. Нарушение активности данной гормональной оси служит одной из причин возникновения различных заболеваний, включая нарушения функционирования сердечно-сосудистой системы, ментальные и когнитивные дисфункции [1].
В регуляции как базальной, так и стрессорной активности ГГАС участвуют различные области головного мозга и, главным образом, гиппокамп, медиальная префронтальная кора (мПФК) и амигдала [2, 3]. Первые две мозговые структуры оказывают тормозное воздействие на активность ГГАС, а амигдала – возбуждающее. Гиппокампу и мПФК уделяется наибольшее внимание исследователей в связи с тем, что нарушение торможения ГГАС после стрессорной активации и, соответственно, чрезмерное влияние длительно повышенного уровня глюкокортикоидных гормонов на мозг и организм в целом способствует развитию “болезней адаптации” [4]. Влияние гиппокампа и мПФК на активность ГГАС реализуется через два типа кортикостероидных рецепторов – глюко- (ГР) и минералокортикоидные рецепторы (МР). Поскольку МР имеют более высокое сродство к глюкокортикоидному гормону, их эффекты в основном реализуются при базальных концентрациях гормона в крови, тогда как ГР вовлекаются в регуляцию активности ГГАС в условиях повышения уровня глюкокортикоидов в крови, например, при стрессе и циркадном максимуме активности ГГАС [4]. Тем не менее, исследования последних лет указывают на то, что такое представление о роли ГР и МР в регуляции активности ГГАС является сильно упрощенным. Решающее значение здесь имеет соотношение числа ГР и МР, что было наглядно продемонстрировано для гиппокампа [5, 6]. В отношении мПФК и роли соотношения ГР и МР в регуляции активности ГГАС этой области коры известно меньше.
Не меньший интерес вызывает и проблема гендерных различий реагирования ГГАС на стрессорные воздействия. Многочисленными исследованиями было показано, что женщины/самки более стресс-реактивны, чем мужчины/самцы, и эти различия определяются более высоким уровнем эстрогенов у особей женского пола [7, 8]. Однако о межполовых различиях экспрессии ГР и МР в мозге известно недостаточно.
Активность ГГАС подвергается фенотипической модификации воздействием различных стрессоров в пре- и постнатальном онтогенезе. В результате воздействия на беременную женщину повышенного уровня глюкокортикоидов вследствие стрессирования, депрессии, тревоги или введения экзогенных гормонов наблюдается изменение базальной и стрессорной активности ГГАС у новорожденных и детей ювенильного возраста [9, 10]. Наиболее многочисленны экспериментальные данные о влиянии пренатального стресса на активность ГГАС во взрослой жизни у лабораторных животных [см. обзоры 11, 12]. Определенное внимание уделяется и межполовым различиям в действии пренатального стресса у лабораторных грызунов. Показано преимущественное влияние пренатального стресса на активность ГГАС самцов, которое заключалось в более длительном повышении уровня кортикостерона при стрессе [13, 14].
Влияние пренатального стресса на активность ГГАС взрослых животных преимущественно связывают с изменением экспрессии кортикостероидных рецепторов в гиппокампе [13, 15, 16]. Несмотря на важную роль мПФК в регуляции активности ГГАС, о влиянии пренатального стресса на экспрессию ГР и МР в этой области коры известно меньше, а анализ межполовых различий действия пренатального стресса на кортикостероидные рецепторы мПФК взрослых животных не проводился.
В связи с этим в данном исследовании изучены последствия стрессирования беременных крыс в последнюю треть беременности на особенности активности ГГАС и экспрессию кортикостероидных рецепторов в гиппокампе и мПФК половозрелых самцов и самок. Активность ГГАС нами изучена в динамике гормонального стрессорного ответа, что позволяет судить о максимальной выраженности стрессорной активации системы и эффективности ее торможения по механизму отрицательной обратной связи. Анализ экспрессии ГР и МР в гиппокампе и мПФК проведен методом вестерн-блот, а в гиппокампе дополнительно иммуноцитохимическим методом, что позволило оценить количество белка соответствующих рецепторов и их распределение внутри мозговой структуры.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на половозрелых самках крыс линии Вистар массой 200–220 г из ЦКП “Биоколлекция” Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, а также на их потомках: самцах массой 230–240 г и самках массой 200–220 г в возрасте 2.5 мес. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и корму (гранулированный комбикорм). Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с принципами Базельской декларации и рекомендациями Комиссии по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.
Моделирование пренатального стресса осуществляли следующим образом. Беременных первородящих самок (n = 9) с 15-го по 19-й день подвергали ежедневному иммобилизационному стрессу в течение 1 ч в узких пластиковых пеналах размером 20 × 7 × 6 см в условиях повышенной освещенности, которую создавали лампой 60 Вт, расположенной на высоте 40 см. Контрольных беременных самок (n = 9) оставляли интактными. Наступление беременности определяли по наличию сперматозоидов в окрашенных азур-эозином вагинальных мазках самок, находящихся в стадии проэструс–эструс. Беременных самок крыс перед родами рассаживали в индивидуальные клетки и далее ежедневно проводили наблюдение с целью определения даты родов. День обнаружения новорожденных крысят считали 0 днем жизни. На следующий день число крысят в пометах выравнивали до 8 животных (4 самца и 4 самки). Пометы, где обнаружено резкое преобладание животных одного пола, из исследования исключали. Полученное от самок потомство содержали совместно с матерью до 30-дневного возраста и далее по 6 особей в клетке.
Потомков обоего пола стрессированных самок (пренатально стрессированные крысы) и контрольных самок делили на три группы. Животных первой группы подвергали иммобилизационному стрессу в течение 30 мин в узких пластиковых пеналах с целью анализа характера стрессорной активности ГГАС. Пробы крови забирали из хвостовой вены до начала иммобилизации (базальная активность) и далее через 30, 60 и 180 мин после начала стрессирования. Пробы крови центрифугировали (1000 g, 20 мин, 4°С) и далее плазму хранили при температуре –20°С до момента определения содержания в ней кортикостерона. Уровень кортикостерона в плазме крови определяли методом ИФА, используя стандартные наборы производства ХЕМА, Россия. Все манипуляции с самками осуществляли в стадию диэструс, которую контролировали по характеру окрашенных вагинальных мазков. Каждая подгруппа пренатально стрессированных и контрольных самцов и самок в данном эксперименте состояла из 10 животных.
Животных второй группы декапитировали, на льду выделяли гиппокамп и мПФК, которые сразу гомогенизировали для последующего анализа экспрессии белка ГР и МР методом вестерн-блот. Ткани мозга гомогенизировали с использованием лизисного буфера, содержащего ингибиторы протеиназ. Подготовленные гомогенаты центрифугировали 1 ч при 4°С при 32 000 g. Общую концентрацию белка в пробах определяли по методу Бредфорда. Индивидуальные пробы, содержащие одинаковое количество белка (15 мкг – гиппокамп и 20 мкг – мПФК) смешивали с буфером Лэмли, после чего белок денатурировали путем нагрева до 95°С в течение 5 мин. От каждого животного независимо брали три фракции из экстрагированного белка. Подготовленные пробы наносили на 7.5%-ный полиакриламидный гель и разгоняли при помощи электрофореза на оборудовании Bio-Rad Laboratories, США. Разделенные в геле белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, Великобритания) с использованием буфера, который содержал 25 мМ Трис, 192 мМ глицина и 20% метанола (pH 8.3). Полученные мембраны инкубировали 1 ч при 37°С в блокирующем растворе 5%-ного молока, приготовленного на основе ТБСT буфера (50 мМ Трис-HCl, 150 мM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0). По окончании процедуры мембраны перекладывали в 1%-ный раствор молока на основе ТБСT буфера, который содержал поликлональные антитела к ГР или МР и моноклональные антитела к β-актину (Santa Cruz Biotechnology, Inc., США) в разведении 1 : 500, и инкубировали в течение ночи при 4°С. По окончании инкубации мембраны трижды промывали в ТБСT буфере и затем повторно инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 1%-ном растворе молока на основе ТБСT буфера с добавлением вторичных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена, в разведении 1 : 2500. Визуализацию белков производили при помощи детектирующих реагентов (ECL detection kit, Sigma-Aldrich Laboratories) согласно инструкции производителя. Оптическую плотность полос для белка ГР, МР и β-актина измеряли в компьютерной программе Image ProPlus (Media Cybernetics Inc., США). Каждая подгруппа пренатально стрессированных и контрольных самцов и самок в данном эксперименте состояла из 4 животных.
Животных третьей группы декапитировали, мозг быстро извлекали из черепной коробки и помещали в 4%-ный раствор параформальдегида в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.3) на 1 ч, а затем на 48 ч при 4°C. Далее материал после стандартной обработки (промывка, обезвоживание, проведение через порции ксилола) заливали в парафин. Изготавливали серии срезов мозга во фронтальной плоскости толщиной 6 мкм. С помощью метода немеченых антител (авидин-биотинового) и иммунопероксидазной реакции проводили выявление иммунореактивного вещества. После стандартных процедур депарафинизации, регидратации и демаскировки антигена (кипячение срезов в 0.01 М цитратном буфере, pH 6.0 под давлением в течение 1 мин), срезы в течение ночи при 4°C инкубировали с первичными поликлональными антителами к ГР или МР (Santa Cruz Biotechnology Inc., США; 1 : 100). Далее на срезы наносили универсальную систему авидин-биотинового комплекса (ABC,Vector Laboratories, Inc, США) и оставляли инкубироваться 30 мин при комнатной температуре. После инкубации с АВС-комплексом стекла промывали в фосфатном буфере 3 раза по 5 мин. Для визуализации реакции связывания антитела с антигеном использовали диаминобензидиновый кит (DAB Substrate kit,Vector Laboratories, Inc, США). Количественную оценку иммунореактивности производили с использованием системы анализа изображения, включающей световой микроскоп Olympus CX31 (Япония), цветную цифровую камеру VideoZavr Standard VZ-C31Sr и программное обеспечение Видеозавр Мультиметр 2.3 (АТМ-практика, Санкт-Петербург). Оценивали среднюю оптическую плотность окраски в иммунопозитивных нейронах гиппокампа. Подсчет производился на 4–5 срезах от каждого животного, анализировали количество клеток на одинаковой площади среза для каждой исследуемой области гиппокампа (поля СА1, СА3 и зубчатая извилина). На основании оценки оптической плотности иммунопозитивные клетки разделяли на 3 класса: слабо- (0.05–0.1 ед. оптической плотности), средне- (0.1–0.25 ед. оптической плотности) и сильноиммунореактивные (0.25–0.5 ед. оптической плотности) клетки. Каждая подгруппа пренатально стрессированных и контрольных самцов и самок в данном эксперименте состояла из 4 животных.
Результаты вестерн-блот и иммуноцитохимического анализа обрабатывали с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни. Анализ динамики стрессорной реактивности ГГАС проводили и помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA, пакета программ STATISTICA 8.0) с последующими парными post-hoc сравнениями (тест Тьюкки) значений уровня кортикостерона в каждой временной точке у отдельных групп животных. Статистически значимыми считали различия при p < 0.05. Данные представлены в виде M ± m.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Двухфакторный дисперсионный анализ показал достоверное влияние пола животных на динамику стрессорного выброса кортикостерона (F(3,79) = 40.3, p < 0.0001). Кривая стрессорной гормональной реактивности ГГАС самок отличалась от самцов не только более высоким максимальным значением стрессорного уровня кортикостерона, но и более быстрым торможением системы после стрессорной активации. У самцов через 60 мин после начала 30-минутной иммобилизации уровень кортикостерона сохранялся повышенным (рис. 1А), тогда как у самок он существенно снижался по сравнению с 30-мин временным интервалом (рис. 1B). Самки отличались от самцов более высоким значение базального уровня кортикостерона.
Рис. 1.
Эффекты пренатального стресса на уровень кортикостерона (nmol/l) в плазме крови в ответ на 30-минутный иммобилизационный стресс у взрослых самцов (А) и самок (В) крыс. n = 10 в группе для каждого пола. Сплошная линия – пренатально стрессированные крысы; прерывистая линия – контрольные крысы. 0 min – базальный уровень кортикостерона; 30 min – иммобилизация; 60 min – уровень кортикостерона спустя 1 ч; 180 min – спустя 3 ч. * Достоверные отличия от контрольных крыс (p < 0.05), ** – p < 0.001. # Достоверные различия между контрольными самцами и самками (p < 0,05). Fig. 1. Effects of prenatal stress on plasma corticosterone (nmol/l) response to an acute 30 min restraint stress in adult male (A) and female (B) rats. n = 10 per group for each sex. Solid line – prenatally stressed rats; broken line – control rats. 0 min – basal level of corticosterone; 30 min – restraint; 60 min – level of corticosterone 1 hr later, and 180 min – 3 hr later. * Significant difference from the control rats (p < 0.05), ** –p < 0.001. # Significant difference between control male and female rats (p < 0.05).
Обнаружено также статистически значимое влияние фактора пренатального стресса на характер стрессорного ответа самцов (F(3,79) = 9.3, p < 0.001) и самок (F(3,79) = 5.2, p < 0.04). Сравнение значений уровня кортикостерона в крови в каждой временной точке у самцов показало, что у пренатально стрессированных животных повышен уровень КС через 60 мин после начала стрессирования по сравнению с контрольными самцами (рис. 1А). Более высокий уровень кортикостерона у пренатально стрессированных самцов наблюдали и через 180 мин от начала стрессирования, тогда как у контрольных животных содержание гормона в крови в этой временной точке снижалось до базального уровня. Эти данные свидетельствуют о снижении чувствительности ГГАС пренатально стрессированных самцов к сигналам отрицательной обратной связи. У пренатально стрессированных самок помимо повышенной стрессорной реактивности ГГАС (более высокий уровень кортикостерона в 30-минутной точке) обнаружено и усиленное торможение системы после стрессорной активации, о чем свидетельствовал сниженный уровень кортикостерона уже через 60 мин от начала стрессирования (рис. 1B). Кроме того, у пренатально стрессированных самок обнаружено статистически значимое повышение базального уровня кортикостерона по сравнению с контрольным самками (183 ± 22.3 и 109 ± 19.1, p < 0.05 соответственно).
Анализ количества белка ГР и МР методом вестерн-блот показал снижение количества обоих типов кортикостероидных рецепторов в гиппокампе пренатально стрессированных самцов (рис. 2А), повышение количества белка ГР и снижение количества белка МР у пренатально стрессированных самок (рис. 2B). В мПФК пренатально стрессированных самцов (рис. 3А) уровень иммунореактивных белков для МР и ГР также был снижен по сравнению с контрольными самцами. При этом у пренатально стрессированных самок количество белка ГР было статистически значимо повышено (рис. 3B). Образцы блотов для каждой группы животных и каждой исследованной структуры мозга представлены на рис. 4.
Рис. 2.
Экспрессия белка глюкокортикоидных рецепторов (GR) и белка минералокортикоидных рецепторов (MR) в гиппокампе, выявленная методом вестерн-блот у взрослых самцов (A) и самок (B) крыс. n = 4 в группе для каждого пола. Пустые столбики – контрольные крысы; темные столбики – пренатально стрессированные крысы. * Достоверные отличия от контрольных крыс (p < 0.05). # Достоверные различия между контрольными самцами и самками (p < 0.05). Fig. 2. Glucocorticoid receptor (GR) and mineralocorticoid receptor (MR) protein expression in hippocampus detected by western blot in adult male (A) and female (B) rats. n = 4 per group for each sex. Open bars – control rats; black bars – prenatally stressed rats. * Significant difference from the control rats (p < 0.05). # Significant difference between control male and female rats (p < 0.05).
Рис. 3.
Экспрессия белка глюкокортикоидных рецепторов (GR) и белка минералокортикоидных (MR) рецепторов в медиальной префрональной коре, выявленная методом вестерн блот у взрослых самцов (A) и самок (B) крыс. n = 4 в группе для каждого пола. Пустые столбики – контрольные крысы; темные столбики – пренатально стрессированные крысы. * Достоверные отличия от контрольных крыс (p < 0.05). # Достоверные различия между контрольными самцами и самками ( p < 0.05). Fig. 3. Glucocorticoid receptor (GR) and mineralocorticoid receptor (MR) protein expression in medial prefrontal cortex detected by western blot in adult male (A) and female (B) rats. n = 4 per group for each sex. Open bars – control rats; black bars – prenatally stressed rats. * Significant difference from the control rats (p < 0.05).
Рис. 4.
Образцы вестерн-блотов для глюкокортикоидных рецепторов (GR), минералокортикоидных (MR) рецепторов и β-актина контрольных и пренатально стрессированных самцов и самок крыс гиппокампа и медиальной префронтальной коры (mPFC). Fig. 4. Representative images of glucocorticoid receptor (GR), mineralocorticoid receptor (MR) and β-actin western-blots in control and prenatal stressed male and female samples of hippocampus and medial prefrontal cortex (mPFC).
Кроме того, проведен анализ изменения соотношения МР и ГР в гиппокампе и мПФК контрольных и пренатально стрессированных животных. В гиппокампе самцов мы не выявили различий в этом показателе. Соотношение ГР : МР у пренатально стрессированных самцов составил 1.4 ± 0.15, а у контрольных самцов –1.25 ± 0.14. В мПФК соотношение двух типов кортикостероидных рецепторов также не различалось у пренатально стрессированных (1.4 ± 0.14) и контрольных (1.5 ± 0.2) самцов. У контрольных самок соотношение ГР : МР в гиппокампе (1.4 ± 0.13) и мПФК (1.7 ± 0.2) было таким же, как и у контрольных самцов. Пренатальный стресс у самок значимо увеличил соотношение ГР : МР как в гиппокампе (3.2 ± 0.35, p < 0.05), так и в мПФК (3.3 ± 0.4, p < 0.05).
Иммуногистохимический анализ распределения белков ГР и МР в областях гиппокампа показал снижение содержания ГР в полях СА1 и СА3, а также в зубчатой извилине пренатально стрессированных самцов по сравнению с контрольными самцами (табл. 1). Кроме того, в поле СА3 и в зубчатой извилине этих самцов статистически значимо снижалось количество клеток, экспрессирующих ГР. Обнаружено также снижение содержания МР в поле СА3 и зубчатой извилине пренатально стрессированных самцов. У пренатально стрессированных самок, напротив, количество ГР повышалась в поле СА3 и зубчатой извилине не только за счет увеличения числа клеток, экспрессирующих ГР, но и за счет роста числа сильно- и среднеиммунопозитивных для ГР клеток (табл. 2). Кроме того в поле СА3 и зубчатой извилине пренатально стрессированных самок было снижено число среднеиммунопозитивных клеток для МР. Следует отметить, что пренатальный стресс наименьшее влияние оказал на экспрессию ГР и МР в поле СА1 как у самок, так и у самцов. Образцы срезов с выявлением иммунопозитивных для ГР клеток поля СА3 гиппокампа и зубчатой извилины самцов и самок крыс представлены на рис. 5.
Таблица 1.
Количество иммунопозитивных клеток к глюко- (GR) и минералокортикоидным (MR) рецепторам в гиппокампе самцов крыс после пренатального стресса (ПС) Table 1. The quantity of GR- and MR-immunoreactive cells in the hippocampus of prenatally stressed (PS) male rats
| Лиганд Ligand |
Локализация Localization |
Контрольные крысы, n = 4 Control rats, n = 4 |
ПС крысы, n = 4 PS rats, n = 4 |
|
|---|---|---|---|---|
| GR | СА1 | Всего Total | 81.8 ± 9.7 | 71.75 ± 8.1 |
| 1 тип 1 type | 1.5 ± 0.6 | 0 ± 0 | ||
| 2 тип 2 type | 15.8 ± 4.2 | 0.25 ± 0.2* | ||
| 3 тип 3 type | 64.5 ± 5.5 | 71.5 ± 8.0 | ||
| CA3 | Всего Total | 178.5 ± 18.5 | 117.2 ± 21.1* | |
| 1 тип 1 type | 10.25 ± 2.8 | 9.0 ± 3.1 | ||
| 2 тип 2 type | 48.5 ± 8.1 | 17.0 ± 5.3* | ||
| 3 тип 3 type | 119.7 ± 12.5 | 91.2 ± 18.5 | ||
| Dentate gyrus | Всего Total | 223.8 ± 25.3 | 152.8 ± 14.8* | |
| 1 тип 1 type | 5.6 ± 1.55 | 0 ± 0 | ||
| 2 тип 2 type | 25.8 ± 4.22 | 5.4 ± 3.2* | ||
| 3 тип 3 type | 194.4 ± 10.4 | 147.4 ± 7.8* | ||
| MR | СА1 | Всего Total | 91.4 ± 10.21 | 84.2 ± 10.14 |
| 1 тип 1 type | 1.0 ± 0.47 | 0.3 ± 0.2 | ||
| 2 тип 2 type | 8.25 ± 2.7 | 9.6 ± 1.2 | ||
| 3 тип 3 type | 82.1 ± 9.4 | 74.3 ± 12.13 | ||
| CA3 | Всего Total | 176 ± 21.1 | 118 ± 18.9* | |
| 1 тип 1 type | 8 ± 2.4 | 10 ± 3.2 | ||
| 2 тип 2 type | 51 ± 14.3 | 15 ± 8.6* | ||
| 3 тип 3 type | 117 ± 15.2 | 93 ± 16.7 | ||
| Dentate gyrus | Всего Total | 231.1 ± 23.4 | 154.0 ± 20.1* | |
| 1 тип 1 type | 3.1 ± 0.5 | 1.7 ± 0.33 | ||
| 2 тип 2 type | 21.8 ± 7.4 | 9.4 ± 4.4 | ||
| 3 тип 3 type | 216.3 ± 22.4 | 132.9 ± 20.6* |
Таблица 2.
Количество иммунопозитивных клеток к глюко- (GR) и минералокортикоидным (MR) рецепторам в гиппокампе пренатально стрессированных (ПС) самок крыс Table 2. The quantity of GR- and MR-immunoreactive cells in the hippocampus of prenatally stressed (PS) female rats
| Лиганд Ligand | Локализация Localization |
Контрольные крысы, n = 4 Control rats, n = 4 |
ПС крысы, n = 4 PS rats, n = 4 |
|
|---|---|---|---|---|
| GR | СА1 | Всего Total | 75.4 ± 5.4 | 88.4 ± 7.2 |
| 1 тип 1 type | 0 ± 0 | 0.5 ± 0.06 | ||
| 2 тип 2 type | 6.9 ± 2.0 | 12.5 ± 4.8 | ||
| 3 тип 3 type | 68.4 ± 5.9 | 75.4 ± 10.9 | ||
| CA3 | Всего Total | 103.5 ± 12.2 | 140.5 ± 8.9* | |
| 1 тип 1 type | 7.5 ± 2.1 | 14.8 ± 2.8* | ||
| 2 тип 2 type | 14.7 ± 2.3 | 22.7 ± 4.2* | ||
| 3 тип 3 type | 81.25 ± 8.6 | 106.5 ± 8.8 | ||
| Dentate gyrus | Всего Total | 232.8 ± 10.7 | 304.6 ± 17.8* | |
| 1 тип 1 type | 2.5 ± 0.5 | 10.5 ± 2.2* | ||
| 2 тип 2 type | 12.8 ± 0.5 | 68.0 ± 12.1* | ||
| 3 тип 3 type | 217.0 ± 10.2 | 210.1 ± 19.9 | ||
| MR | СА1 | Всего Total | 67.1 ± 7.2 | 56.5 ± 6.1 |
| 1 тип 1 type | 0 ± 0 | 0 ± 0 | ||
| 2 тип 2 type | 5.57 ± 0.8 | 6.1 ± 0.8 | ||
| 3 тип 3 type | 61.6 ± 5.3 | 50.4 ± 7.5 | ||
| CA3 | Всего Total | 116.5 ± 7.3 | 120.6 ± 8.1 | |
| 1 тип 1 type | 5.7 ± 3.8 | 8.1 ± 2.6 | ||
| 2 тип 2 type | 30.2 ± 7.5 | 15.6 ± 3.6* | ||
| 3 тип 3 type | 87.2 ± 12.1 | 96.9 ± 7.9 | ||
| Dentate gyrus | Всего Total | 239.6 ± 10.5 | 199.6 ± 9.9 | |
| 1 тип 1 type | 19.9 ± 3.8 | 0 ± 0 | ||
| 2 тип 2 type | 24.9 ± 6.6 | 15.7 ± 4.6* | ||
| 3 тип 3 type | 194.8 ± 8.3 | 183.9 ± 8.9 |
Рис. 5.
Экспрессия белка глюкокортикоидных рецепторов в гиппокампе пренатально стрессированных и контрольных животных, выявленная иммуногистохимическим методом. А – самцы; B – самки. Контрольные крысы (а – СА3, с – dentate gyrus). Пренатально стрессированные крысы (b – СА3, d – dentate gyrus). Fig. 5. The protein expression of glucocorticoid receptor in the hippocampus of prenatal stressed and control rats detecting by immunohistochemistry technique. A – male; B – female. Control rats (a – CA3, c – dentate gyrus). Prenatal stressed rats (b – СА3, d – dentate gyrus).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проведенные исследования показали зависимое от пола животных влияние пренатального стресса на характер гормонального стрессорного ответа ГГАС. Если у самцов эффекты пренатального стресса касались преимущественно чувствительности ГГАС к сигналу отрицательной обратной связи, которая была ослаблена у этих животных, то у самок напротив, торможение ГГАС после стрессорной активации было ускорено, что сопровождалось значительным ростом стрессорной реактивности этой гормональной оси.
Разнонаправленные эффекты пренатального стресса у самцов и самок обнаружены также в отношении экспрессии белка ГР в гиппокампе и мПФК. У пренатально стрессированных самцов наблюдали снижение уровня иммунореактивного белка для ГР в полях гиппокампа и зубчатой извилине на фоне снижения общего числа клеток, экспрессирующих ГР. Этот эффект пренатального стресса был более выражен в поле СА3 и зубчатой извилине. В этих же областях гиппокампа пренатально стрессированных самцов наблюдается и снижение экспрессии белка МР. Сходные данные были получены в исследованиях других авторов, которые показали, что у самцов, родившихся от стрессированных в последнюю треть беременности матерей, нарушена регуляция ГГАС по механизму отрицательной обратной связи и снижено количество мРНК ГР и МР в поле СА3 гиппокампа [15]. Эти авторы не обнаружили статистически значимого снижения мРНК ГР и МР в зубчатой извилине, что, вероятно, связано с различиями в количестве мРНК и белка соответствующих рецепторов. Тем не менее, зубчатой извилине, наряду с СА3 полем гиппокампа, принадлежит ведущая роль в торможении ГГАС после стрессорной активации [17, 18]. Более того, в исследованиях, выполненных на мышах, имеющих повышенный или нормальный уровень МР и ГР в гиппокампе, показано, что только при сниженном уровне ГР и нормальном, но не повышенном уровне МР наблюдается усиление реактивности ГГАС и пролонгированный гормональный стрессорный ответ на 40-минутную иммобилизацию. Можно полагать, что снижение экспрессии в гиппокампе не только ГР, но и МР также способствует нарушению регуляции ГГАС по механизму отрицательной обратной связи. Подтверждением этому служит тот факт, что введение антидепрессантов не только нормализует функции ГГАС, но и повышает уровень мРНК ГР и МР в гиппокампе [19–21]. Сниженный уровень экспрессии белков ГР и МР у пренатально стрессированных самцов мы также обнаружили в мПФК, что также может обуславливать снижение чувствительности их ГГАС к сигналам отрицательной обратной связи [22]. Неслучайно пренатально стрессированных самцов рассматривают как модель депрессии, поскольку у этих животных воспроизводятся многие гормональные и поведенческие дисфункции, характерные для клинической картины этой психопатологии [23].
Следует отметить, что в настоящее время не только ГР, но и МР гиппокампа и мПФК уделяется значительное внимание в связи с данными о вовлеченности данных рецепторов в патогенез депрессии [24, 25]. Исследование мозга больных депрессией post-mortem выявило значительное снижение количества МР рецепторов в гиппокампе (поле СА3) [26, 27]. С дисфункцией МР связывают нарушение базальной активности ГГАС у пациентов с депрессией [28]. В исследованиях, проведенных на трансгенных животных, показано, что недостаточность МР в мозге повышает не только базальный уровень активности ГГАС, но и стрессорный ответ этой гормональной оси на иммобилизацию [29]. Несмотря на снижение экспрессии белка МР рецепторов в гиппокампе пренатально стрессированных самцов, мы не обнаружили повышение базальной активности ГГАС у этих животных. Мы полагаем, что подобное отсутствие изменения базального уровня кортикостерона связано с отсутствием отличий от контрольных животных в соотношении ГР : МР в гиппокампе. В подтверждении такого заключения можно привести данные, полученные при анализе соотношения МР и ГР в гиппокампе у самцов крыс, подвергнутых хроническому непредсказуемому стрессу и последующему введению антидепрессантов. Хронический непредсказуемый стресс, используемый в исследованиях как модель депрессии, повышал базальный уровень кортикостерона у животных и снижал соотношение ГР : МР, а введение антидепрессантов нормализовало не только уровень кортикостерона, но и соотношение кортикостероидных рецепторов [27].
Эффекты пренатального стресса на активность ГГАС у самок существенно отличались от самцов. Помимо повышенной стрессорной реактивности и базального уровня кортикостерона, чувствительность к сигналам отрицательной обратной связи была усилена. Более быстрое торможение стрессорной активности ГГАС пренатально стрессированных самок, вероятнее всего, определяется повышением экспрессии белка ГР в дорзальном гиппокампе и мПФК, ответственных за эффективное торможение активности этой гормональной оси при стрессе. Остается открытым вопрос о повышенной стрессорной реактивности пренатально стрессированных самок по сравнению с контрольными животными. Тот факт, что самки отличаются повышенной стрессорной реактивностью ГГАС хорошо известно. Также было показано, что самки характеризуются повышенной экспрессией ГР и увеличенным соотношением ГР : МР в гиппокампе по сравнению с самцами [30], что обнаружено и в нашем исследовании. При этом межполовых различий в экспрессии белка МР гиппокампа выявлено не было. Следует отметить, что снижение экспрессии белка ГР в гиппокампе, префронтальной коре и амигдале у нокаутных самок мышей не меняло базальный и стресс-индуцированный уровень кортикостерона, тогда как у самцов способствовало пролонгированию гормонального стрессорного ответа [31]. Эти данные свидетельствуют о том, что в изменении базальной и стрессорной активности ГГАС самок вовлечены механизмы, напрямую не связанные с центральными ГР.
Повышенную стресс-реактивность самок связывают преимущественно с эстрадиолом [32]. Причем эстрадиол, взаимодействуя с двумя подтипами рецепторов α и β, может как снижать, так и увеличивать стресс-индуцированный уровень кортикостерона. Показано, что через активацию α-рецепторов эстрадиол повышает стрессорную реактивность ГГАС, а посредством активации β-рецепторов снижает секрецию кортикостерона в ответ на иммобилизационный стресс [33–35].
В пользу вовлеченности эстрадиол-зависимых механизмов повышения активности ГГАС у пренатально стрессированных самок свидетельствует факт обнаружения сниженной экспрессии β-рецепторов эстрадиола и повышенной экспрессии α-рецепторов в отдельных областях гипоталамуса, включая паравентрикулярное ядро, медиальную амигдалу и BNST в результате пренатального стресса [36]. Изменение экспрессии β- рецепторов эстрадиола в мозге пренатально стрессированных самок авторы этих результатов связывают со снижением уровня 17β-эстрадиола в крови этих животных. Действительно, показано, что эстрадиол, циркулирующий в крови, оказывает стимулирующее влияние на экспрессию β-рецепторов эстрадиола [37.] Следует отметить, что в своих исследованиях мы также обнаружили снижение уровня 17β-эстрадиола в крови пренатально стрессированных самок [38].
Интересно отметить, что сходный профиль активности ГГАС (повышенная реактивность и чувствительность к сигналам отрицательной обратной связи) характерна для больных посттравматическим стрессовым расстройством, что сопровождается повышением уровня ГР [39]. В экспериментах на лабораторных животных также было обнаружено повышение экспрессии ГР в гиппокампе и префронтальной коре при моделировании посттравматического стрессового расстройства [40, 41]. И хотя такое усиление экспрессии ГР в мозге при стрессовым расстройством в основном связывают с нарушением эмоциональной памяти о психотравматизирующих событиях [42], нельзя исключать, что изменение экспрессии центральных ГР при посттравматическом стрессовым расстройством также может являться одним из механизмов повышенной стресс-реактивности.
Таким образом, проведенные исследования показали, что эффекты пренатального стресса на активность ГГАС имеют зависимые от пола животных особенности и проявляются у взрослых самцов в пролонгировании гормонального стрессорного ответа, а у самок в повышенной стрессорной реактивности и усилении чувствительности ГГАС к сигналам отрицательной обратной связи. У пренатально стрессированных самцов изменения активности ГГАС сопровождаются снижением экспрессии белков ГР и МР в гиппокампе и мПФК при неизменном соотношении ГР : МР. В свою очередь у пренатально стрессированных самок наблюдается усиление экспрессии белка ГР и снижение экспрессии белка МР в гиппокампе и увеличение соотношения ГР : МР в исследованных структурах мозга. В гиппокампе как самцов, так и самок наибольшие изменения экспрессии ГР и МР в результате пренатального стресса выявлено в СА3 поле и зубчатой извилине. Полученные данные о половом диморфизме эффектов пренатального стресса на активность ГГАС и количество ГР и МР в областях мозга, ответственных за базальную активность этой гормональной оси и ее своевременное торможение после стрессорной активации, важно для разработки методов коррекции последствий пренатального стресса в последующей жизни.
Список литературы
deKloet E.R., Joels M., Holsboer F. Stress and the brain: from adaptation to disease. Nat. Rev. Neurosci. 6: 463–475. 2005.
McEwen B.S. The Ever-Changing Brain: Cellular and Molecular Mechanisms. Dev. Neurobiol. 72(6): 878–890. 2012.
McEwen B.S., Morrison J.H. Brain On Stress: Vulnerability and Plasticity of the Prefrontal Cortex Over the Life Course. Neuron. 79(1): 16–29. 2013.
deKloet E.R., Derijk R. Signaling pathways in brain involved in predisposition and pathogenesis of stress-related disease: genetic and kinetic factors affecting the MR/GR balance. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1032: 14–34. 2004.
Harris A.P., Holmes M.C., de Kloet E.R., Chapman K.E., Seckl J.R. Mineralocorticoid and glucocorticoid receptor balance in control of HPA axis and behavior. Psychoneuroedocrinology. 38: 648-658. 2013.
Koning A.C., Buurstede J.C., van Weert L.T., Meijer O.C. Glucocorticoid and Mineralocorticoid Receptors in the Brain: A Transcriptional Perspective. J. Endocr. Soc. 3(10): 1917–1930. 2019.
Young E.A., Korszun A., Figueiredo H.F., Solomon M.B., Herman J.P. Sex differences in HPA axis regulation. In:. Rocker J.B., Berkley K.J., Geary N., Hampson E., Herman J.P., Young E.A. (Eds). Sex differences in the brain from genes to behavior. New York. Oxford Univer. Press Inc. 95–105. 2006.
Kudielka B.M., Kirschbaum C. Sex differences in HPA axis responses to stress: review. Biol. Psychol. 69: 113–132. 2005.
Nath A., Murthy G.V.S., Babu G.R., Di Renzo G.C. Effect of prenatal exposure to maternal cortisol and psychological distress on infant development in Bengaluru, southern India: a prospective cohort study. BMC Psychiatry. 17(1): 255. 2017.
Davis E.P., Glynn L.V., Waffarn F., Sandman C.A. Prenatal maternal stress programs infant stress regulation. J. Child. Psychol. Psychiatry. 52(2): 119–129. 2011.
Bale T.L. Epigenetic and transgenerational reprogramming of brain development. Nat. Rev. Neurosci. 16: 332–344. 2015.
Harris A., Seckl J. Glucocorticoids, prenatal stress and the programming of disease. Horm. Behav. 59: 279–289. 2011.
Darnaudéry M., Maccari S. Epigenetic programming of the stress response in male and female rats by prenatal restraint stress. Brain Res. Rew. 57: 571–585. 2008.
Baker S., Rees S., Chebli M., LeMarec N., Hutaa V., Bielajewa C. Effects of gestational stress: 2. Evaluation of male and female adult offspring. Brain Res. 1302: 194–204. 2009.
Darnaudery M., Maccaru S. Epigenetic programming of the stress response of male and female rats by prenatal restrain stress. Brain Res. Rew. 57: 571–585. 2008.
Galeeva A., Pelto-Huikko M., Pivina S., Ordyan N. Postnatal ontogeny of the glucocorticoid receptor in the hippocampus. Hormones of the Limbic system. Vitamins and Hormones. 82: 367–389. 2010.
Radley J.J. Toward a limbic cortical inhibitory network: implications for hypothalamic-pituitary-adrenal responses following chronic stress. Front. Behav. Neurosci. 29; 6: 7. 2012.
Herman J.P. Neural regulation of the stress response: glucocorticoid feedback mechanisms. Braz. J. Med. Biol. Res. 45(4): 292–298. 2012.
Reul J.M., Stec I., Soder M., Holsboer F. Chronic treatment of rats with the antidepressant amitriptyline attenuates the activity of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical system. Endocrinolology. 133(1): 312–320. 1993.
Przegalinski E., Budziszewska B. The effect of long-term treatment with antidepressant drugs on the hippocampal mineralocorticoid and glucocorticoid receptors in rats. Neurosci. Lett. 161(2): 215–218.1993.
Seckl J.R., Fink G. Antidepressants increase glucocorticoid and mineralocorticoid receptor mRNA in the rat hippocampus in vivo. Neuroendocrinology. 55: 621–626. 1992.
McKlveen J.M., Myers B., Flak J.N., Bundzikova J., SolomonM.B., Seroogy K.B., Herman J.P. Role of Prefrontal Cortex Glucocorticoid Receptors in Stress and Emotion. Biol. Psychiatry. 74(9): 672–679. 2013.
Maccaria S., Morley-Fletchera S. Effects of prenatal restraint stress on the hypothalamus–pituitary–adrenal axis and related behavioral and neurobiological alterations. Psychoneuroendocrinology. 32(1): 10–15. 2007.
Chen J., Wang. Z, Zhang S., Zuo W., Chen N. Does mineralocorticoid receptor play a vital role in the development of depressive disorder? Life Sci. 152: 76–81. 2016.
Hinkelmann K., Hellmann-Regen J., Wingenfeld K., Kuehl L.K., Mews M., Fleischer J., Heuser I., Otte C. Mineralocorticoid receptor function in depressed patients and healthy individuals. Progr. Neuropsychopharmacol. Biol. Psych. 71: 183–188. 2016.
Medina A., Seasholtz A.F., Sharma V., Burke S., Bunney W.Jr., Myers R.M., Schatzberg A., Akil H., Watson S. J. Glucocorticoid and mineralocorticoid receptor expression in the human hippocampus in major depressive disorder. J. Psychiatr. Res.47(3): 307–314. 2013.
Lopez J.F., Chalmers D.T., Little K.Y., Watson S.J. Regulation of serotonin1A, glucocorticoid, and mineralocorticoid receptor in rat and human hippocampus: implications for the neurobiology of depression. Biol. Psychiatry. 43(8): 547–573. 1998.
Otte C., Wingenfeld K., Kuehl L.K., Kaczmarczyk M., Richter S., Quante A., Regen F., Bajbouj M., Zimmermann-Viehoff F., Wiedemann K., Hinkelmann K. Mineralocorticoid receptor stimulation improves cognitive function and decreases cortisol secretion in depressed patients and healthy individuals. Neuropsychopharmacology. 40(2): 386–393. 2015.
Horst J.P.T., Van der M.M.H., Arp M., Berger S., de Kloet E.R., Oitzl M.S. Stress or nostress: mineralocorticoid receptors in the forebrain regulate behavioral adaptation. Neurobiol. Learn Mem. 98(1): 33–40. 2012.
Brydges N.M., Jin R., Seckl J., Holmes M.C., Drake A.J., Holl S. Juvenile stress enhances anxiety and alters corticosteroid receptor expression in adulthood. Brain Behav. 4(1): 4–13. 2013.
Solomon M.B., Furay A.R., Jones K., Packard A.E.B., Packard B.A., Wulsin A.C., Herman J.P. Deletion of forebrain glucocorticoid receptors impairs neuroendocrine stress responses and induces depression-like behavior in males but not females. Neuroscience. 203: 135–143. 2012.
Oyola M.G., Handa R.J. Hypothalamic–pituitary–adrenal and hypothalamic–pituitary– gonadal axes: sex differences in regulation of stress responsivity. Stress. 20(5): 476–494. 2017.
Lund T.D., Hinds L.R., Handa R.J. The androgen 5alpha-dihydrotestosterone and its metabolite 5alpha-androstan-3beta, 17beta-diol inhibits the hypothalamic-pituitary-adrenal response to stress by acting through estrogen receptor beta-expressing neurons in the hypothalamus. J. Neurosci. 26: 1448–1456. 2006.
Lund T.D., Munson D.J., Haldy M.E., Handa R.J. Androgen inhibits, while oestrogen enhances, restraint-induced activation of neuropeptide neurons in the paraventricular nucleus of hypothalamus. J. Neuroendocrinol. 16: 272–278. 2004.
Weiser M.J., Foradori C.D., Handa R.J. Estrogen receptor beta activation prevents glucocorticoid receptor-dependent effects of the central nucleus of the amygdala on behavior and neuroendocrine function. Brain Res. 1336: 78–88. 2010.
He F., Wang Z., Guo G. Postnatal separation prevents the development of prenatal stress-induced anxiety in association with changes in oestrogen receptor and oxytocin immunoreactivity in female mandarin vole (Microtusmandarinus) offspring. Behav. Neurosci. 47(1): 95–108. 2018.
Giguere V., Tremblay A., Tremblay G.B. Estrogen receptor β: re-evaluation of estrogen an d antiestrogen signaling. Steroids. 63: 335–339.1998.
Shamolina T.S., Pivina S.G., Ordyan N.E. Changes in the activity of hypophyseal-adrenocortical and reproductive systems in prenatally stressed female rats during aging. Neurosci. Behav. Physiol. 40(9): 1017–1022. 2010.
Yehuda R. Post-traumatic stress disorder. N. Engl. J. Med. 346(2): 108–114. 2002.
Daskalakis N.P., Cohen H., Cai G., Buxbaum J.D., Yehuda R. Expression profiling associates blood and brain glucocorticoid receptor signaling with trauma-related individual differences in both sexes. PNAS. 111(37): 13529–13534. 2014.
George S.A., Rodriguez-Santiago M., Riley J., Rodriguez E., Liberzon I. The effect of chronic phenytoin administration on single prolonged stress induced extinction retention deficits and glucocorticoid upregulation in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 232: 47–56. 2015.
Finsterwald C., Alberini C.M. Stress and glucocorticoid receptor-dependent mechanisms in long-term memory: from adaptive responses to psychopathologies. Neurobiol. Learn Mem. 112: 17–29. 2014.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова
Пн.-пт.: 10.00-19.00