Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2021, T. 107, № 11, стр. 1385-1394

ВВЕДЕНИЕ

Гипоксический и гиперкапнический дыхательные хеморефлексы являются важнейшими элементами контроля дыхания. Эти рефлексы участвуют в поддержании газового гомеостаза артериальной крови. Хеморефлексы осуществляются при участии хеморецепторов каротидных телец, расположенных в бифуркации сонной артерии, которые возбуждаются при снижении напряжения кислорода, повышении напряжения углекислого газа и уменьшении pH артериальной крови. При гипоксии гломусные клетки каротидных телец деполяризуются в ответ на недостаток кислорода и выделяют нейромедиаторы, которые активируют сенсорные нервные волокна, передающие афферентную информацию в дыхательный центр ствола мозга.

Установлено, что гломусные клетки экспрессируют рецепторы воспалительных цитокинов, включая рецепторы TNF-α (TNF-R1 и TNF-R2), IL-1β (IL-1R1) и рецепторы IL-6 [1–4]. IL-1β и TNF-α являются основными провоспалительными цитокинами, продуцируемыми во время острой фазы иммунного ответа на инфекцию и воспаление. Сообщается, что системный уровень этих цитокинов повышается при многих респираторных заболеваниях, таких как астма, хроническая обструктивная болезнь легких и апноэ во сне [5–7]. Было обнаружено, что системное воспаление вызывает морфологические изменения в каротидном теле сонной артерии [3]. Эти изменения, связанные с повышением уровня провоспалительных цитокинов, снижают чувствительность каротидного тела к гипоксии [4]. Известно, что TNF-α может провоцировать высвобождение гломусными клетками медиатора дофамина [8, 9]. В совокупности, эти данные показывают, что функция каротидных телец при гипоксии может снижаться во время воспаления.

Однако механизмы, с помощью которых провоспалительные цитокины влияют на вентиляцию легких и гипоксическую хеморецепцию, до сих пор не изучены и могут включать множество воспалительных молекул, которые влияют не только на центральные и периферические хеморецепторы, но и на дыхательные нейроны [10]. Влияние цитокинов на дыхательную систему может быть опосредовано несколькими способами: высвобождением простагландинов, норадреналина, рилизинг-фактора кортикотропина, оксида азота (NO) [11–15].

Целью настоящего исследования было изучение влияния провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α на паттерн дыхания и гипоксическую хеморецепцию, а также выяснение роли NO-синтазных путей в реализации респираторных эффектов данных цитокинов.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было выполнено на 48 наркотизированных трахеостомированных спонтанно дышащих крысах самцах линии Вистар массой 270 ± 20 г (ЦКП Биоколлекция Института физиологии им. И.П. Павлова РАН). Все животные находились под общей анестезией (уретан, 1400 мг/кг, интраперитонеально). Эксперименты выполнены с соблюдением основных норм и правил биомедицинской этики (Europian Community Council Directives 86/609/EEC).

Для регистрации объемно-временных параметров внешнего дыхания использовалась пневмотахографическая методика. К трахеостомической канюле подключалась пневмометрическая трубка MLT-1L (AD Instruments, Австралия). По кривой пневмотахограммы измерялась средняя скорость инспираторного потока (Vинсп) и частота дыхательных движений (ЧДД). При интеграции пневмотахографической кривой автоматически получали кривую дыхательных объемов – спирограмму и вычисляли дыхательный объем (ДО). Минутный объем дыхания (МОД) рассчитывали, как произведение ДО на ЧДД. Парциальное давление кислорода и углекислого газа (P_EТO₂ и P_EТСO₂) в конечной порции выдыхаемого воздуха измерялось с помощью респираторного газоанализатора (Gemini, США).

Животные были разделены на 6 экспериментальных групп. Животные первой группы (n = 8) использовались для выяснения собственных респираторных эффектов IL-1β, этим животным вводили только IL-1β (2 мкг/кг, “Беталейкин”, ФГУП ОЧБ ФМБА) в хвостовую вену. Вторая группа (n = 8) была предназначена для выяснения респираторных эффектов TNF-α, этой группе внутривенно вводили TNF-α (40 мкг/кг, Sigma). Третья и четвертая группы (n = 8 каждая) были созданы для выяснения роли нитрергических механизмов, участвующих в реализации респираторных эффектов цитокинов. Животным этих групп за 20 мин до введения IL-1β или TNF-α производилась внутрибрюшинная инъекция неселективного ингибитора NO-синтаз (L-NAME) (10 мг/кг, Sigma). Пятая группа (n = 8) использовалась для выявления возможного собственного влияния L-NAME на вентиляцию легких и гипоксическую хеморецепцию; этой группе вводили только ингибитор, внутрибрюшинно. Помимо этого, была создана группа животных (n = 8), которая являлась контрольной. Этим животным вводили внутривенно 0.25 мл физиологического раствора.

Чувствительность к гипоксическому стимулу исследовали классическим методом возвратного дыхания, адаптированным нами для использования на мелких лабораторных животных. Дыхание производилось в замкнутом контуре, заполненном азотно-кислородной гипоксической газовой смесью (80% N₂, 15% О₂, 5% СО₂). СО₂ добавлялся в дыхательную смесь в концентрации, соответствующей нормальному содержанию СО₂ в организме для предотвращения гипокапнии, развивающейся при гипоксической гипервентиляции.

Изокапния поддерживалась за счет удаления с помощью адсорбента (натронная известь) из выдыхаемого воздуха, поступающего в мешок (объем 50 мл) для возвратного дыхания, углекислого газа, образующегося в организме. По мере потребления кислорода при дыхании из мешка происходило постепенное убывание содержания О₂ в дыхательной смеси, нарастала стимуляция периферических хеморецепторов и происходило соответствующее увеличение легочной вентиляции. Содержание СО₂ в дыхательной смеси не изменялось. Продолжительность проведения пробы с возвратным дыханием составляла 4 мин. Вентиляционный ответ на гипоксию тестировался в диапазоне снижения парциального давления кислорода в выдыхаемом воздухе от 80 до 40 мм рт. ст., т.к. в этом диапазоне зависимость величины вентиляции от интенсивности гипоксического стимула практически линейна.

Для количественной оценки вентиляционного ответа на гипоксию производилось вычисление приростов ДО, МОД и V_инсп при снижении парциального давления кислорода в конечной порции выдыхаемого воздуха на 1 мм рт. ст. Кроме того, производилось графическое построение зависимости роста вентиляции и ее составляющих от содержания О₂ в выдыхаемом воздухе. Гипоксический вентиляционный ответ тестировался до введения препаратов, а затем на 20-ой, 40-ой, 60-ой и 90-ой мин после их введения (рис. 1).

Рис. 1.

Схема эксперимента. Эксперимент длился 120 мин, на тридцатой минуте вводили IL-1β или TNF-α. L-NAME вводили на десятой минуте эксперимента (т.е. за 20 мин до введения цитокина). Треугольники – моменты измерения дыхательной реакции при гипоксии. Стрелки – моменты введения препаратов.

Для статистической обработки экспериментальных данных использовался программный пакет STATISTICA 7.0. Все значения представлены как среднее ± стандартная ошибка. Для проверки нормальности распределения данных применялись критерии Колмогорова–Смирнова и Шапиро–Уилка. Значения до и после введения препаратов оценивали с помощью парного теста Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Достоверными считали различия при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Паттерн дыхания. Эксперименты показали, что экзогенное повышение системного уровня как IL-1β, так и TNF-α оказывает активирующее влияние на систему внешнего дыхания, вызывая увеличение средней скорости инспираторного потока, дыхательного объема и минутного объема дыхания (табл. 1, 2). Достоверные изменения минутного объема дыхания отмечались уже на 20-ой мин после введения цитокинов, средней скорости инспираторного потока и дыхательного объема – на 40-ой мин. Значимое увеличение частоты дыхательных движений наблюдалось лишь через 90 мин после введения IL-1β или TNF-α. При проведении серии контрольных экспериментов с внутривенным введением физиологического раствора, а также с внутрибрюшинным введением раствора L-NAME не было выявлено достоверных изменений дыхательных параметров.

После предварительной обработки L-NAME влияние IL-1β и TNF-α на паттерн дыхания было ослаблено. Достоверное увеличение минутного объема дыхания наблюдалось только через 60 мин после повышения системного уровня данных цитокинов (табл. 1, 2). Величина прироста этого параметра составляла 25 и 50% при введении IL-1β и TNF-α соответственно. При действии IL-1β и TNF-α на фоне предварительного введения L-NAME прирост минутного объема дыхания через 60 мин после введения цитокинов составлял 16 и 10%.

Вентиляционный ответ на гипоксию. При возвратном дыхании гипоксической газовой смесью наблюдалась значительная корреляция между увеличением минутной вентиляции, дыхательного объема, средней скорости нспираторного потока и снижением P_ETO₂ как до, так и после внутривенных инъекций IL-1β или TNF-α. Однако внутривенное введение как IL-1β, так и TNF-α вызывало уменьшение угла наклона линий тренда, усредняющих вентиляционные кривые, зарегистрированные в нескольких экспериментах. Линии тренда становились более пологими, что свидетельствует о снижении вентиляционной чувствительности к гипоксической стимуляции (рис. 2a, b; 3a, b).

Рис. 2.

Вентиляционный ответ на гипоксию до (сплошная линия) и через 40 мин после (пунктирная линия) внутривенного введения IL-1β (a, b) и IL-1β на фоне действия L-NAME (c, d).

Рис. 3.

Вентиляционный ответ на гипоксию до (сплошная линия) и через 40 мин после (пунктирная линия) внутривенного введения TNF-α (a, b) и TNF-α на фоне действия L-NAME (c, d).

Проведение количественных расчетов подтвердило достоверность снижения прироста респираторных параметров в ответ на гипоксическую стимуляцию на фоне действия IL-1β. Максимальное снижение приростов дыхательных параметров наблюдалось на 40-ой мин действия цитокина. Так, расчет величины прироста параметров при снижении Р_ETО₂ на 1 мм рт. ст. показал, что через 40 мин после введения IL-1β прирост МОД уменьшался с 3.34 ± 0.23 до 2.02 ± 0.19 мл/мин/мм рт. ст. (–41%, p < 0.05), ДО – с 0.031 ± 0.005 в контроле до 0.022 ± 0.004 мл/мм рт. ст. (–29%, p < 0.05) и скорости инспираторного потока с 0.114 ± 0.017 до 0.06 ± 0.012 мл/с/мм рт. ст. (–47%, p < 0.05) по сравнению с фоновыми величинами (рис. 4а).

Рис. 4.

Динамика вентиляционного ответа на гипоксию на протяжении всего эксперимента, т.е. на исходном уровне и через 20, 40, 60 и 90 мин после введения IL-1β (a) или TNF-α (b), до (сплошная линия) и после (пунктирная линия) предварительного введения L-NAME. * p < 0.05 – достоверные отличия от фоновых значений, # p < 0.05 – достоверные отличия от IL-1β или TNF-α. Представлены средние значения ± SEM.

Максимальное снижение чувствительности респираторной системы к гипоксии было обнаружено и через 40 мин после введения TNF-α. Количественные расчеты показали, что МОД снизился с 6.06 ± 0.91 до 3.48 ± 0.38 мл/мин/мм рт. ст. (–40%) через 40 мин после введения TNF-α (p < 0.05). ДО и V_инсп. снизились с 0.06 ± 0.01 до 0.04 ± 0.01 мл/мм рт. ст. (–27%, p < 0.05) и с 0.23 ± 0.02 в контроле до 0.15 ± ± 0.01 мл/с/мм рт. ст. (–27%, p < 0.05) через 40 мин после введения TNF-α соответственно (рис. 4b). В то же время, внутривенное введение физиологического раствора не изменило вентиляционный ответ на гипоксию.

В совокупности полученные данные показывают, что повышенный уровень провоспалительных цитокинов в крови снижает чувствительность дыхательной системы к гипоксии и подавляет гипоксический хеморецепторный контроль дыхания.

Повышение системного уровня как IL-1β, так и TNF-α на фоне действия ингибитора NO-синтаз – L-NAME не вызывало ослабления вентиляционного ответа на гипоксию: угол наклона линий тренда, характеризующий зависимость дыхательных параметров (МОД, ДО, V_инсп) от величины гипоксической стимуляции, не изменялся после введения цитокинов (рис. 2c, d; 3c, d).

Количественная оценка реакции на гипоксию после введения цитокинов на фоне ингибирования активности NO-синтаз также показала, что в течение всего эксперимента достоверного снижения приростов МОД, ДО и V_инсп в ответ на гипоксическую стимуляцию, относительно их фоновых значений, не наблюдалось. Сохранялась лишь слабо выраженная тенденция к ослаблению вентиляционного ответа на гипоксию (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В нормальных условиях уровень цитокинов в организме очень низкий. Однако при системном воспалении, стрессе, гипоксии, обструктивной болезни легких наблюдается значительный рост уровня провоспалительных цитокинов. Известно, что внутривенное введение липополисахарида вызывает повышение уровня TNF в крови с 750 до 5000 нг/мл [16].

Проведенное нами исследование показало, что при спокойном дыхании воздухом экзогенное повышение уровня IL-1β и TNF-α вызывает увеличение минутной вентиляции, дыхательного объема и средней скорости инспираторного потока. Подобное влияние провоспалительных цитокинов на вентиляцию легких было показано и в более ранних исследованиях. Было обнаружено, что вводимый внутривенно эндотоксин, который приводит к высвобождению провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и TNF-α), вызывает усиление вентиляции легких [17]. В предыдущих исследованиях мы показали, что повышение церебрального уровня IL-1β приводит к значительному увеличению объемно-временных параметров дыхания в условиях нормоксии, но в то же время ослабляет гиперкапнический и гипоксический вентиляционные ответы [15, 18]. Результаты, представленные в данной статье, показывают, что внутривенное введение IL-1β и TNF-α имеет такие же респираторные эффекты: усиление вентиляции легких и ослабление респираторной чувствительности к гипоксии.

На основании полученных нами данных мы полагаем, что повышение системного уровня провоспалительных цитокинов снижает чувствительность периферических артериальных хеморецепторов к изменению газового состава крови. Этот вывод подтверждается результатами, полученными в других исследованиях. Установлено, что IL-1β и TNF-α могут распознаваться мембранными рецепторами, расположенными в гломусных клетках каротидных телец, а также могут способствовать выделению гломусными клетками медиатора дофамина [8, 9]. В экспериментах, проведенных in vitro, установлено, что в каротидном теле TNF-α может увеличивать базовую частоту хемосенсорных разрядов нерва, иннервирующего каротидные тела, но в тоже время – уменьшать хемосенсорные разряды, вызванные гипоксией [8]. В нашей работе, в экспериментах in vivo, было показано, что внутривенная инъекция как IL-1β, так и TNF-α увеличивает минутную вентиляцию легких при спокойном дыхании воздухом, и в то же время снижает вентиляционный ответ респираторной системы на гипоксию. Принимая во внимание представленные данные литературы, можно предположить, что обнаруженные нами респираторные эффекты провоспалительных цитокинов связаны с тем, что повышение их уровня в циркулирующей крови изменяет хемосенсорную активность каротидного тела.

Результаты представленного исследования показывают также, что респираторные эффекты провоспалительных цитокинов опосредуются активацией NO-синтазных путей. Наличие NO-синтаз было обнаружено в нервных волокнах, окружающих гломусные клетки каротидных тел, а также в самих гломусных клетках [19]. При взаимодействии цитокинов с соответствующими мембранными рецепторами в этих клетках может усиливаться синтез конститутивных форм NO-синтазы и образование молекул NO, которые оказывают как аутокринное, так и паракринное действие. Внутриклеточный механизм действия NO заключается в активизации циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), способного влиять на проводимость ионных каналов и, таким образом, изменять функциональное состояние клеточной мембраны.

Установлено, что оксид азота в физиологических концентрациях является тормозным модулятором хемосенсорных разрядов каротидных тел. Уменьшение эндогенной продукции NO вносит вклад в усиление хемосенсорных разрядов каротидных тел [20, 21]. Известно, что NO модулирует хеморецепторные процессы посредством различных механизмов, опосредовано через изменения тонуса сосудов в каротидных телах и доставки кислорода, и напрямую через модуляцию возбудимости гломусных клеток и сенсорных нейронов. При этом эффект NO имеет двойственное дозозависимое влияние на хеморецепцию каротидных тел. В гипоксических условиях NO является преимущественно тормозным модулятором каротидной хеморецепции, тогда как при нормоксии NO усиливает хемосенсорные разряды [20, 21]. Этот факт объясняет обнаруженный нами двойственный респираторный эффект IL-1β и TNF-α: увеличение базовой вентиляции при нормоксии, но уменьшение гипоксического вентиляционного ответа.

Полученные нами данные, указывающие на восстановление вентиляционного гипоксического ответа после ингибирования NO-синтаз, находят объяснения и в других исследованиях, которые показывают, что уменьшенная эндогенная продукция NO усиливает хеморецепторную активность каротидных тел. Так, например, было установлено, что у кроликов с сердечной недостаточностью и усиленным ответом на гипоксию наблюдается уменьшенная эндогенная активность NO-синтаз в каротидных телах по сравнению с нормальными животными. При этом было показано, что внедрение этим животным аденовируса, экспрессирующего NO-синтазы, уменьшало базовые разряды хеморецепторов каротидных тел и ослабляло ответ на гипоксию [22]. В экспериментах in vitro на перфузированных каротидных телах кошек при регистрации активности синусного нерва было показано, что обе конститутивные изоформы NO-синтазы – нейрональная (nNOS) и эндотелиальная (еNOS) – вносят вклад в действие NO на хеморецепторную активность [23].

Таким образом, результаты проведенных нами исследований и анализ данных литературы указывают на участие ключевых воспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α в модуляции паттерна дыхания и гипоксического хеморефлекса посредством активации NO-синтаз и усиления синтеза NO в гломусных клетках каротидных тел.