Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2021, T. 107, № 12, стр. 1455-1489

ВВЕДЕНИЕ: ЭВОЛЮЦИОННЫЕ, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ, СТРУКТУРНЫЕ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АЛЬБУМИНА

Альбумин был, возможно, первым белком, на который обратили внимание врачи древних цивилизаций. Так, Гиппократ в V в. до нашей эры связывал заболевание почек у своих пациентов с наличием у них пенистой мочи, которая, как теперь известно, становится такой из-за присутствия в ней альбумина. Первые зарегистрированные в исторических анналах попытки выделения альбумина из мочи с помощью уксуса были предприняты в 16 в. Парацельсом, но лишь в 1894 г. Гурбер впервые кристаллизовал альбумин из конской сыворотки [1]. Так как поначалу объектом исследования и источником альбумина была сыворотка крови, за альбумином закрепилось определение “сывороточный альбумин”, хотя современные технологии выделения альбумина предполагают использование плазмы крови в качестве его источника [2]. При этом исходная причина частого употребления словосочетания “сывороточный альбумин” – необходимость подчеркнуть его отличие от яичного, молочного и растительных альбуминов.

Сывороточный альбумин принадлежит к суперсемейству альбуминоидов, которое также включает витамин D-связывающий белок (VDP), альфа-фетопротеин и альфа-альбумин (афамин); соответственно семейство генов включает гены этих четырех глобулярных белков [3]. Это семейство встречается только у позвоночных [4], так что сывороточный альбумин имеется не только у млекопитающих, но и у птиц, некоторых видов лягушек, миног и саламандр (исчерпывающий список представлен на сайте albumin.org). В количественном отношении альбумин является доминирующим белком плазмы или сыворотки крови и, наряду с другими представителями семейства, действует как переносчик эндогенных и экзогенных веществ, включая тироксин, жирные кислоты и лекарства, тогда как основным “грузом” VDP является 25-гидроксивитамин D [3]. Все альбуминоиды эволюционно связаны с сывороточным альбумином [5, 6]. Это один из наиболее эволюционно изменчивых белков: у разных видов различия между доменами альбумина составляют 70–80%. Очевидно, это связано с развитием в ходе эволюции его особых связывающих характеристик по отношению к новым лигандам – гормонам, метаболитам, токсинам. В отличие от альбумина, различия в структуре ретинол-связывающего белка составляют в среднем 40%, а в структуре гистонов – менее 10% [7]. Исследование альбуминоидных генов показало, что в наибольшей степени отбор затронул сайты связывания жирных кислот и тироксина, поверхность контакта с неонатальным Fc-рецептором, а также аминокислотные остатки альбумина, образующие карман для связывания простагландинов [3]. Однако, несмотря на то что альбумин является быстро эволюционирующим белком, он обладает двумя консервативными характеристиками: это третичная структура, которая состоит из преимущественно спиральных участков при полном отсутствии каких-либо фрагментов бета-листа, а также паттерн дисульфидных связей, которых в молекуле альбумина семнадцать [8]. Благодаря присутствию у всех позвоночных сывороточный альбумин может служить своеобразным индикатором времени эволюции вида [9]. Так, в результате исследования филогенетического древа альбуминов приматов было установлено, что орангутанги первыми отделились от приматов, следующими были гориллы, позже шимпанзе и, наконец, люди [10].

Предковый ген альбумина претерпел утроение в процессе эволюции около 525 миллионов лет назад [11], когда впервые появились позвоночные. Молекула сывороточного альбумина человека (HSA, Human Serum Albumin) состоит из 585 аминокислотных остатков (а. о.), образующих одну полипептидную цепь с молекулярной массой 66439 Да, однако эти цифры могут варьировать из-за видовых различий, генетических и посттрансляционных модификаций. Архитектура альбумина преимущественно спиральная и состоит из трех доменов с очень похожими формами, которые в совокупности образуют форму сердца. Однако у миноги, так называемого “живого ископаемого”, альбумин состоит из семи доменов [12]. Четыре канонических представителя семейства альбуминоидов человека тандемно расположены в области 4q13.3 [13]. Ген alb HSA состоит из 16961 пар нуклеотидов от предполагаемого “кэп-сайта” до первого сайта присоединения поли(А). Он разделен на 15 экзонов, которые симметрично размещены в трех доменах. Предшественник сывороточного альбумина (препроальбумин) имеет N-концевой пептид, который отщепляется перед тем как белок покидает шероховатый эндоплазматический ретикулум. Продукт (проальбумин) транспортируется в аппарат Гольджи. В секреторных гранулах происходит ограниченный протеолиз и зрелый негликозилированный альбумин секретируется во внеклеточную среду [1]. Синтез белка происходит главным образом в полисомах гепатоцитов; у здорового взрослого человека производится 10–15 г альбумина в день, что составляет почти 10% всего синтеза белка в печени [14]. В плазме остается около 1/3 синтезированного альбумина, тогда как большая часть переходит в межклеточное пространство мышечной ткани и кожи. Синтез альбумина в печени во многом зависит от коллоидно-осмотического давления, экспрессия гена регулируется по принципу обратной связи [15].

Альбумин вырабатывается исключительно гепатоцитами. Для доставки вновь синтезированного альбумина к базолатеральной стороне клеток и последующей секреции альбумина в кровоток необходим рецептор Fc новорожденных (FcRn). FcRn локализован преимущественно внутри клеток и, помимо IgG, может связывать альбумин. Отсутствие экспрессии FcRn в гепатоцитах приводит к повышению уровня альбумина в желчи, его внутриклеточному накоплению и снижению уровня циркулирующего альбумина [16]. Например, в процессе онкогенеза клетки могут терять или подавлять экспрессию FcRn. В этих случаях клетки не смогут перерабатывать альбумин после его интернализации, вместо этого он разлагается, обеспечивая опухоль питательными веществами и способствуя ее росту. Благодаря особенностям структуры и отсутствию прямой связи с иммунными ответами FcRn был классифицирован как неклассический FcγR [17]. IgG и альбумин являются мажорными сывороточными белками, которые обладают относительно длительным периодом полужизни в сыворотке во многом благодаря их взаимодействию с FcRn, что спасает их от внутриклеточной деградации через механизм клеточного рециклинга.

Все представители семейства альбуминов водорастворимы и умеренно растворимы в концентрированных солевых растворах. Ключевые физико-химические свойства сывороточного альбумина – кислый, хорошо растворимый и очень стабильный белок, выдерживающий температуру 60°C в течение 10 ч [1]. HSA имеет в общей сложности 83 положительно заряженных аминокислотных остатка (Arg + Lys) и 98 отрицательно заряженных остатков (Asp + Glu) с теоретическим значением pI 5.12. Отличие альбумина от других белков крови состоит в том, что в норме он не гликозилирован (не гликирован, если иметь в виду исключительно неферментативное гликозилирование), хотя даже небольшой процент гликированного альбумина вносит существенный вклад в патогенез диабета и других заболеваний. Наиболее хорошо изучено гликирование по остаткам лизина. Также известны редокс-модификации альбумина – цистеинилирование, гомоцистеинилирование и сульфинилирование по Cys34 [18]. Молекула альбумина содержит 17 дисульфидных связей и одну свободную тиоловую группу в Cys34, которая определяет участие альбумина в окислительно-восстановительных реакциях. В соответствии с редокс-состоянием Cys34 существует три изоформы HSA: меркаптальбумин (восстановленный альбумин, HMA) и немеркаптальбумином-1 и -2 (варианты окисленного альбумина HNA-1 и HNA-2) [19].

Существуют десятки генетических вариантов HSA (полный список представлен на сайте albumin.org). Возможные эффекты некоторых точечных мутаций на лиганд-связывающую способность HSA были исследованы при взаимодействии пяти структурно охарактеризованных генетических вариантов белка с высокоаффинными к альбумину фармпрепаратами варфарином, салицилатом и диазепамом [20]. Данные равновесного диализа позволяют выявить выраженное снижение высокоаффинного связывания всех трех лигандов с HSA Canterbury (313Lys → Asn) и с HSA Parklands (365Asp → His). В случае HSA Verona (570Glu → Lys) изменения аффинности не было выявлено. Сродство к модификации HSA Niigata (269Asp → Gly) было снижено только для салицилата, а к HSA Roma (321Glu → Lys) – для салицилата и диазепама. В половине случаев снижение константы первичной ассоциации достигало одного порядка, что приводило к увеличению несвязанной фракции фармпрепаратов минимум на 500% при терапевтически релевантных молярных соотношениях фармпрепарата и белка. Основной причиной уменьшения связывания лигандов являются конформационные изменения в области 313–365, тогда как изменения заряда молекулы играют второстепенную роль [20].

Альбумин может связывать различные эндогенные и экзогенные лиганды: воду и катионы металлов, жирные кислоты, гормоны, билирубин, металлопорфирины, оксид азота, аспирин, варфарин, ибупрофен, фенилбутазон и др. [21]. Связывание низкомолекулярных лигандов происходит в двух основных сайтах (сайт Sudlow I в субдомене IIA и сайт Sudlow II в субдомене IIIA) и нескольких второстепенных. Когда альбумин взаимодействует с различными веществами, возникают эффекты кооперативности и аллостерической модуляции, которые обычно присущи мультимерным макромолекулам [22, 23]. Альбумин является не только пассивным, но и активным участником фармакокинетических и токсикокинетических процессов. Многочисленные эксперименты показали наличие у альбумина (псевдо)эстеразной, фосфатазной, пероксидазной и других типов ферментативной активности. Более детально ферментативная активность белка рассмотрена в наших предыдущих обзорах [24–26]. Ранее в литературе было высказано предположение, что некоторые простые реакции, катализируемые сывороточным альбумином с кинетикой Михаэлиса–Ментен, включают неспецифическое связывание субстрата и катализ локальными функциональными группами [27]. Большинство ферментов способны катализировать физиологически нерелевантные (вторичные, “неразборчивые”) реакции в дополнение к тем реакциям, которые в результате эволюции стали для них основными; количество “неразборчивых” реакций при детальном рассмотрении вопроса оказалось довольно большим [28, 29], так что является скорее правилом, чем исключением. Однако каталитическая “неразборчивость” альбумина, на наш взгляд, возникла в результате утраты (а не приобретения) некоторых специализированных активностей, например, таких как активность эстераз (гидролаз) с пищеварительными функциями. В механизме “неразборчивости” альбумина определенную роль играет т.н. элиминация Кемпа – прототипная реакция отщепления протона от углерода. Реакция происходит в слое Штерна, на границе раздела между головкой мицеллы или поверхностью белка и водой, так что значительное ускорение реакции может быть достигнуто независимо от пространственного расположения субстрата [30, 31]. Механизм элиминации Кемпа в белковых молекулах связан с присутствием остатков ароматических аминокислот (Trp, Tyr, Phe), обеспечивающих стэкинг-взаимодействие с донорами водородной связи (Lys, Arg, Ser, Tyr, His, молекула воды) [32]. Ранее мы предложили объяснение опосредованного альбумином гидролиза некоторых субстратов существованием каталитических диад (в отличие от каталитических триад в холинэстеразах) His-Tyr или Lys-Tyr, в которых остатки гистидина или лизина функционируют как кислотные остатки и доноры протона, а остаток тирозина является каталитическим основанием [24].

РЕДОКС-МОДУЛЯЦИЯ И РЕДОКС-АКТИВНОСТЬ АЛЬБУМИНА

Редокс-статус тиоловой группы остатка Cys34 обеспечивает гетерогенность изоформ альбумина: меркаптальбумин человека (HMA) имеет свободную форму тиола; смешанный дисульфид с Cys или цистеинилглицином (CysGly), в меньшей степени с гомоцистеином (HCys) или глутатионом (GSH), получил название немеркаптальбумин-1 (HNA-1); альбумин с остатком цистеина, окисленным до сульфиновой или сульфоновой кислоты, получил название HNA-2. У здоровых людей молодого возраста HMA составляет 70–80%, HNA-1 составляет 20–30%, тогда как HNA-2 – от 2 до 5% от общего количества альбумина [33]. Окисленные формы альбумина отличаются по физико-химическим свойствам от восстановленной формы. Так, повышение коллоидного осмотического давления окисленного альбумина было показано в экспериментах in vitro с использованием гипохлорита, а также установлено у пациентов с хронической болезнью почек [34]. Аффинность к эндогенным лигандам билирубину и триптофану, а также к экзогенным фармпрепаратам варфарину и диазепаму снижается пропорционально уровню окисленного альбумина (цистеинилирование по Cys34) [35]. Аффинность к липидам также различается: проатеросклеротические лизофосфатидилхолин и лизофосфатидная кислота имеют более высокое сродство к окисленной изоформе, тогда как антиатеросклеротические производные эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот обладают более высоким сродством к восстановленной изоформе альбумина [36].

Остатки альбумина человека (HSA), подверженные окислению, это в первую очередь Cys34, но также остатки тирозина Tyr84, 138, 140, 161, 263, 319, 332, 334, 353 и 370, остатки метионина Met87 и Met123, остаток триптофана Trp214 [37]. В плазме крови здорового человека около 80% всех тиолов приходятся на остаток Cys34 альбумина [38]. Он способен стехиометрически инактивировать пероксид водорода, пероксинитрит, супероксид-анион и хлорноватистую кислоту, окисляясь при этом до сульфеновой кислоты (HSA-SOH) [39, 40]. При оксидативном стрессе, вызванном активными формами кислорода (АФК), Cys34 образует дисульфид со свободным цистеином или глутатионом; окисление изменяет трехмерную структуру HSA и влияет на связывание многих ксенобиотиков (фармпрепаратов и токсических веществ). В зависимости от характера и степени окисления HSA окисленные производные можно разделить на обратимые (HNA-1) и необратимые (HNA-2). Предполагается, что как HNA-1, так и HNA-2 обусловливают развитие воспалительных процессов, что сопряжено с повышением уровня провоспалительных цитокинов и маркеров повреждения тех или иных тканей и органов [37]. Недавние исследования позволяют предполагать, что окисленные изоформы альбумина являются самостоятельными патогенетическими факторами многих распространенных и социально-значимых заболеваний, а их уровень тесно связан с характером питания человека [19]. Однако во многом остается неясным, в чем состоит специфика ответа разных тканей на воздействие разных форм модифицированного альбумина.

Перечень активностей альбумина, связанных с редокс-модуляцией плазмы крови и межклеточной жидкости, включает активность тиоэстеразы [41, 42], глутатионпероксидазы и цистеинпероксидазы, а также активность пероксидазы в отношении гидропероксидов липидов [43–45]. Следует отметить важную роль двух цистеиновых остатков альбумина, Cys392 и Cys438, которые образуют редокс-чувствительный дисульфид в комплексе альбумина с пальмитоил-КоА [45]. Cys34 является наиболее важной “ловушкой” АФК, хотя и не единственной: шесть остатков метионина также вносят вклад в антиоксидантные свойства альбумина [39, 46]. Остатки Met87 и Met123 обычно окисляются до сульфоксида метионина, особенно при почечной недостаточности и диабете.

Альбумин участвует в транспорте меди [47] – кофактора многих ферментов и участника окислительно-восстановительных реакций и сигнальных путей в организме в норме и при патологии [48]. Основным сайтом связывания катионов Cu(II) является N-концевой участок альбумина человека Asp-Ala-His-Lys (N-концевой сайт, NTS) [49]. Предполагается, что в структуре альбумина есть сайт и для связывания Cu(I). С помощью спектроскопических и вычислительных методов было показано, что в связывании катиона Cu(I) ключевую роль играют имидазольные кольца двух гистидинов [50]. N-концевая область HSA в комплексе с ионами меди обладает супероксиддисмутазной активностью [51]. Кроме того, следует отметить прооксидантные свойства альбумина: связанные с альбумином ионы Cu²⁺ усиливают образование аскорбатного радикала с последующим окислением образовавшихся ионов Cu⁺ молекулярным кислородом и протонами снова до Cu²⁺ [52].

Редокс-активность альбумина может быть дополнена реакцией детоксикации цианидов с образованием тиоцианата, которая катализируется участками субдомена IIIA без участия Tyr411 [53]. Процент окисленного альбумина служит одним из биомаркеров оксидативного стресса, сопровождающего различные заболевания: так, уровень Cys34-цистеинилированного альбумина значительно повышен у пациентов, страдающих сахарным диабетом, заболеваниями печени и почек [35]. При заболевании почек чрезмерное образование АФК способствует окислительному повреждению, воспалению, эндотелиальной дисфункции и фиброзу почечной ткани [54]. У пациентов с сахарным диабетом часто встречается хроническая болезнь почек, так что основной причиной повреждения почек считается гликированный альбумин, хотя сравнительный анализ гликированного и окисленного альбумина не проводился. Отрицательные эффекты альбумина (как модифицированного, так и немодифицированного) на эпителиальные клетки канальцев изучены недостаточно. Предполагается, что окисление альбумина предшествует или происходит на ранних стадиях хронического заболевания почек. Альбумин у здоровых людей частично преодолевает барьер клубочковой фильтрации, но реабсорбируется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза в проксимальных (71%) и дистальных клетках канальцев (26%) [37]. Альбумин связывается с рецептором комплекса мегалин-кубулин и направляется в покрытые клатрином везикулы, далее следует эндоцитоз и происходит закисление эндосом, что вызывает диссоциацию альбумина из комплекса мегалин-кубулин и связывание альбумина с неонатальным рецептором Fc (FcRn). Затем альбумин либо переносится в лизосомы, либо по трансцитозному маршруту возвращается в кровь, в то время как рецепторы подвержены рециклизации. Однако уровень окисленного в плазме альбумина коррелируют со снижением скорости клубочковой фильтрации. Окисленный альбумин оказывает прямое влияние на нейтрофилы, увеличивая уровни липокалина, связанного с желатиназой нейтрофилов, который является общепринятым биомаркером почечного повреждения у пациентов и в различных экспериментальных условиях. Более того, окисленный альбумин у пациентов с заболеванием почек независимо коррелирует с более высокими уровнями в плазме провоспалительных цитокинов TGF-β1, TNF-α, IL-1β и IL-6 [37].

Жирные кислоты, по-видимому, играют важную роль в регуляции антиоксидантных свойств альбумина. Впервые к такому выводу пришли Грызунов с соавт. [52]. Связывание жирных кислот альбумином изменяет конформацию сайтов Sudlow I и II и увеличивает квантовый выход флуоресценции дансиламида (лиганд сайта Sudlow I) и дансилсаркозина (лиганд сайта Sudlow II); кроме того, жирные кислоты увеличивали стерическую доступность тиоловой группы Cys34 и усиливали ее реакционную способность по отношению к 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоте (DTNB). Таким образом, связывание жирных кислот создает предпосылки для одновременной регуляции двух важных функций белка: транспортной и антиоксидантной [52]. Кроме того, альбумин усиливает антиоксидантный статус организма за счет связывания билирубина (лиганд Сайта III [55]) и полиненасыщенных жирных кислот, которые взаимодействуют с остатками Arg117, Lys351 и Lys475 [39].

ГЛИКИРОВАННЫЙ АЛЬБУМИН – БИОМАРКЕР И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ФАКТОР САХАРНОГО ДИАБЕТА. КОНЕЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ГЛИКИРОВАНИЯ И ИХ РЕЦЕПТОРЫ

Сахарный диабет сродни глобальной эпидемии, которая растет тревожными темпами и ассоциируется с увеличением уровня смертности населения. В 2018 г. только в США количество больных диабетом составило 34.2 миллиона человек. Во всем мире их количество составляет 425 миллионов человек, и ожидается, что к 2045 г. эта цифра вырастет до 629 миллионов [56]. Гестационный диабет ежегодно поражает от 2 до 14% беременных женщин в США [57]. У диабетиков имеет место усиление процесса неферментативной конденсации сахаров с нуклеиновыми кислотами, белками и липидами, что в конечном итоге формирует конечные продукты гликирования (КПГ). Гликирование изменяет их структуру и функцию, что приводит к нарушению функции клеток и цитотоксическим эффектам, вследствие чего КПГ получили название гликотоксины. КПГ могут возникать в результате физиологических процессов, когда они не уравновешиваются механизмами детоксикации, или поступать в организм из внешних источников, таких как еда, сигаретный дым и загрязнение воздуха. Их накопление ведет к воспалению и оксидативному стрессу, в основном посредством активации специфических рецепторов КПГ (РКПГ, RAGE, AGER) [58]. Рецептор КПГ был впервые описан в 1992 г., позже были идентифицированы изоформы: AGER-1, 2, 3, а также скавенджер-рецептор CD36 [59, 60]. RAGE и AGER-2 участвуют в инициации воспалительных процессов, тогда как рецепторы AGER-1, -3 и CD36 ответственны за детоксикацию КПГ [58, 61, 62]. RAGE – это рецептор, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов; его лиганд-связывающий домен распознает – помимо КПГ – большое количество молекул, среди которых наиболее важными являются белки S100, белок бокс-1 группы высокой подвижности (HMGB1), β-амилоид и антигенный комплекс макрофагов 1 (Mac-1) [63]. Т.е. RAGE действует как неспецифический рецептор распознавания образов, который может функционировать как экстраклеточный датчик [58]. Гликированные продукты и активация RAGE связаны с патофизиологией многих метаболических заболеваний, таких как сахарный диабет 2-го типа, пищевая аллергия, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, острая почечная недостаточность, болезнь Альцгеймера, синдром поликистозных яичников [64–66]. КПГ способствуют канцерогенезу при хроническом местном воспалении, индуцированном Helicobacter pylori [67].

Сигнальные пути при активации РКПГ включают p21ras, киназы MAP, Rho GTPases, N-концевую киназу Jun (JNK) и JAK/STAT, которые приводят к миграции транскрипционных факторов в ядро и экспрессии генов, регулирующих хемотаксис, активацию клеток и пролиферацию [58]. NF-κB, NFAT, STAT, AP-1, ERK1/2 и белок, связывающий цАМФ-чувствительный элемент, связываются со своими специфическими промоторами для транскрипции генов, кодирующих провоспалительные цитокины (например, IL-1, IL-2 и IL-4), проапоптотические белки (например, p53-Bax, который инициирует каскад каспаз) и поверхностные белки, такие как молекулы адгезии эндотелиальных клеток [68–70]. РКПГ конститутивно экспрессируются во многих тканях, тогда как гиперактивация РКПГ вызывает стимуляцию пути PI3K–PKB–IKK, что приводит к связыванию NF-κB на промоторе РКПГ и автоамплификации экспрессии [58]. Другая петля самоамплификации состоит в том, что КПГ индуцируют оксидативный стресс через активацию РКПГ с последующей гиперактивацией NADPН-оксидазы, генерацией АФК, повышением КПГ и усилением экспрессии РКПГ [71]. Экспрессия РКПГ может увеличиваться не только вследствие воздействия КПГ, но также вследствие воздействия провоспалительных цитокинов [72]. КПГ-активированные эндотелиальные клетки “притягивают” лимфоциты и задерживают апоптоз моноцитов, увеличивая продолжительность воспаления [73].

Модификации белков плазмы, структурных белков и других макромолекул усиливаются при диабете не только вследствие повышенного гликирования (вторичного по отношению к повышенным концентрациям глюкозы), но и вследствие оксидативного стресса, который возникает по ходу заболевания и может быть признаком неосложненного сахарного диабета. Комбинированные эффекты гликирования и окисления могут ускорять развитие сопутствующих патологий при диабете. В то время как сама глюкоза содержит карбонильную группу, которая участвует в начальной реакции гликирования, наиболее важные и реактивные карбонилы образуются в результате реакций окисления, повреждающих либо углеводы (включая саму глюкозу), либо липиды. Образующиеся промежуточные продукты, содержащие карбонил, затем модифицируют белки, давая продукты “гликоксидирования” и “липоокисления” соответственно. Этот общий путь глюкозо- и липид-опосредованного стресса является основой гипотезы карбонильного стресса [74].

КПГ даже в здоровом организме образуются эндогенно, но недавние исследования показали, что диета является важным экзогенным источником КПГ [75, 76]. Поскольку мишенями гликирования являются свободные аминогруппы, потенциально любой белок может быть модифицирован, и каждая ткань может накапливать гликотоксины. С точки зрения длительности накопления КПГ, долгоживущие белки являются наиболее важными для изучения: это компоненты внеклеточного матрикса (коллаген, ламинин и эластин), белок хрусталика α-кристаллин, хрящ, гемоглобин [58, 68]. Например, в настоящее время стандартными биомаркерами для мониторинга диабета являются глюкоза и гликированный гемоглобин A1c (HbA1c), но HbA1c является репрезентативным показателем для гликемических данных за 2–3 предшествующих месяца и не является адекватным для мониторинга терапии, тогда как уровень глюкозы может существенно меняться даже в течение дня и при гестационном диабете легкой и средней степени тяжести, что может дезориентировать пациента и даже врача [57]. Кроме того, в определенных условиях измерение HbA1c ненадежно, в частности для пациентов с модифицированными эритроцитами или почечной недостаточностью [77, 78]. Таким образом, существует потребность в промежуточном биомаркере, который можно эффективно использовать для мониторинга гликемического статуса пациентов. Таким биомаркером может служить альбумин, который имеет относительно короткий период полуобновления (20–21 день). Альбумин, количество которого существенно превышает количество других белков плазмы крови, подвержен гликированию в первую очередь и позволяет прогнозировать риск развития диабета даже в случае эугликемии [79]. Одним из главных реагентов, обнаруженных in vivo в аддуктах с альбумином, является карбоксиметил-лизин (CML). Из других следует отметить глиоксаль (GO), метилглиоксаль (MG) и 3-дезоксиглюкозон (3-DG) [58, 80].

Как уже было упомянуто, альбумин синтезируется и попадает в кровоток в виде негликозилированного белка, но со временем в плазме крови даже здорового человека происходит гликирование определенной части молекул альбумина, что может влиять на его структурные и функциональные характеристики [81, 82]. По некоторым оценкам в нормогликемической крови от 10 до 18% циркулирующих белков гликируются in vivo, тогда как у диабетиков он достигает 40% [57, 83]. Сравнительный анализ способности различных сахаров взаимодействовать с бычьим альбумином (BSA) in vitro показал, что d-галактоза более реакционноспособна по сравнению с d-глюкозой или d-лактозой, хотя только конъюгаты альбумина с лактозой распознавались специфическими лектинами [84]. К настоящему времени идентифицировано более 60 сайтов гликирования альбумина человека. Наиболее доступными для конъюгации оказались лизины Lys256 и Lys420, хотя наиболее реактивным у HSА считается Lys525 [85, 86]. Помимо лизина, наиболее реакционноспособными аминокислотными остатками являются аргинин и гистидин [58]. Окисленный альбумин легче гликируется, причем даже при физиологической концентрации глюкозы (5 мМ) [83]. Накопление КПГ изменяет структуру и функцию белков, превращая их в потенциальные мишени иммунной системы, результатом чего может стать продукция аутоантител против КПГ. Альбумин не стал исключением: в крови пациентов с атеросклеротическим повреждением сосудов и признаками сахарного диабета были обнаружены антитела против альбумина [87]. Более того, аутоантитела IgG и IgA к HSA могут иметь диагностическое значение при аутоиммунных буллезных дерматозах (AБД), притом что кожные аутоантигены все еще не идентифицированы [88]. Сигнальный путь фосфо-p38, связанный с повреждением ДНК, является потенциальной мишенью для лечения больных с AБД-позитивными сывороточными аутоантителами к HSA.

Гликированный альбумин используется как в целях диагностики, так и для экспериментального исследования системных эффектов КПГ, многие из которых опосредованы NF-κB – универсальным фактором транскрипции, контролирующим экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла [89]. Как уже отмечалось, в настоящее время в качестве маркеров диабета общепризнанными являются глюкоза плазмы крови и HbA1c. Альтернативой HbA1c в качестве маркера сахарного диабета стал фруктозамин, играющий все более важную роль в диагностике этого заболевания и являющийся мерой гликирования циркулирующих белков, главным из которых с точки зрения доступности и оценки масштаба наблюдаемых изменений является альбумин [56]. Альбумин плазмы крови напрямую подвергается воздействию циркулирующей глюкозы, так что он постепенно вытесняет HbA1c при гликемическом мониторинге пациентов с сахарным диабетом [77]. Однако точность определения степени гипергликемии по фруктозамину относительно невысока не только потому, что разные белки по-разному взаимодействуют с глюкозой и другими сахарами, но еще и потому, что свой вклад в погрешность метода вносят билирубин, мочевая кислота и ряд других низкомолекулярных соединений. Среди других недостатков теста называют отсутствие общепринятого стандарта и даже невысокую его доступность [90]. Нельзя сказать, что разнообразные методики определения гликированного альбумина отличаются простотой и доступностью: отметим здесь ионообменную высокоэффективную жидкостную хроматографию, боронатную аффинную хроматографию, иммуноанализы (радиоиммуноанализ и иммуноферментный анализ), колориметрический метод с тиобарбитуровой кислотой, ферментативные методы с использованием протеиназы и кетаминоксидазы. Тем не менее, в последние годы наибольшую популярность получил ферментативный метод “Lucica GA-LR” (Asahi Kasei Pharma Corporation, Япония), имеющий высокую воспроизводимость, точность и хорошую корреляцию с A1c [90]. Разработана тест-система на индикаторной полоске для измерения доли гликированного альбумина от общего сывороточного альбумина. Для проведения колориметрических измерений использовались аптамеры с наночастицами золота. Как гликированный, так и негликированный альбумин можно измерять в соответствующих физиологических диапазонах концентраций – от 50 до 300 мкМ с пределом обнаружения (LoD) 6.5 мкМ для гликированного альбумина и от 500 до 750 мкМ с LoD 21 мкМ для негликированного альбумина [57].

Смысл измерения гликированного альбумина в клинической практике состоит в его универсальности и как медиатора воспаления, и как маркера гипергликемии. Более глубокое понимание роли гликированного альбумина может привести к принятию его в качестве независимого маркера воспалительного процесса [91]. Гликированный альбумин позволяет прогнозировать риск смерти у диализных пациентов с сахарным диабетом [77], а в сочетании с hsCRP максимально повышает точность прогнозирования сердечно-сосудистых заболеваний, особенно сопряженных с гипертрофией левого желудочка у пациентов с диабетической хронической болезнью почек [78]. Особо следует отметить, что гликированный альбумин может трансформироваться в амилоидные фибриллы, богатые β-слоями [92].

Как и в случае влияния окисления Cys34 на связывающую активность сайтов Sudlow, данные о влиянии гликирования на антиоксидантные свойства альбумина противоречивы [39, 93–95], что может быть связано с межвидовыми различиями, природой и концентрацией участвующих в реакции углеводов (глюкоза, метилглиоксаль), условиями инкубации с моносахаридами. Особый интерес представляют различия между альбумином человека и быка: гликирование HSA резко снижает его антиоксидантную активность, тогда как гликирование BSA несколько усиливает его антиоксидантные свойства. Эти данные коррелируют с результатами вычислительных экспериментов, направленных на изучение влияния редокс-статуса HSA и BSA на их связывающую и эстеразную активность по отношению к параоксону [26, 96]. С точки зрения эволюционной и сравнительной биохимии/физиологии представляется важным следующий факт: концентрация глюкозы в плазме крови птиц в 1.5–2 раза выше, чем у млекопитающих аналогичной массы (т.н. доброкачественная гипергликемия), однако птичий альбумин (на примере CSA, Chicken Serum Albumin) гликируется в меньшей степени, чем BSA, даже когда в эксперименте in vitro альбумины подвергали воздействию увеличивающихся концентраций глюкозы вплоть до 500 мМ [97]. Анализ белковых структур позволяет предположить, что относительная устойчивость CSA к гликированию может быть связана с меньшим количеством остатков лизина и вариациями в укладке белка, которые защищают остатки лизина от взаимодействия с глюкозой плазмы. Сравнительный анализ реконструированных последовательностей альбумина свидетельствует о том, что у предка птиц в молекуле альбумина было на 6–8 меньше остатков лизина по сравнению с альбумином млекопитающих [97]. Доброкачественная гипергликемия – общая физиологическая особенность птиц, и развитие механизмов устойчивости к гликированию альбумина, по-видимому, неразрывно было связано с их эволюцией. Полагают, что развитие доброкачественной гипергликемии у птиц совпало с радикальной перестройкой генома, в результате которой произошла потеря важных генов, в том числе гена, кодирующего GLUT4 – переносчика, ответственного за инсулинозависимый транспорт глюкозы в чувствительных к инсулину клетках других позвоночных. Эта потеря, по-видимому, привела к ремоделированию инсулин-зависимого сигнального пути в тканях птиц [98].

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АЛЬБУМИНА С ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ: ГЛИКОКАЛИКС, ТРАНСЦИТОЗ И ГЛИКОПРОТЕИН CD36

КПГ вызывают множественные метаболические нарушения в стенке сосудов и могут привести к эндотелиальной дисфункции. Поскольку значительная часть КПГ представлена гликированным альбумином, необходимо рассмотреть особенности взаимодействия альбумина с эндотелием сосудов. Альбумин взаимодействует с эндотелиальными клетками (ЭК) посредством экстраклеточных молекулярных представителей, среди которых имеются рецепторы, но большая их часть объединена в гликокаликс – динамичную и неоднородную по своему составу “прослойку” между мембранами ЭК, с одной стороны, и компонентами крови (плазма и форменные элементы), с другой стороны. Эндотелиальный гликокаликс – это связанный с мембранами ЭК слой гликопротеинов, который в организме человека удерживает от 700 до 1000 мл практически не циркулирующего объема плазмы. Этот внутрисосудистый слой поддерживает собственное коллоидно-осмотическое (онкотическое) давление (КOД) благодаря содержащимся в нем белков плазмы (в первую очередь альбумина), которые удерживаются внутри эндотелиального гликокаликса (Endothelial Glycocalyx Layer, EGL). Следовательно, он имеет более высокое КОД, чем циркулирующая плазма [99]. По некоторым оценкам, EGL обеспечивает примерно 60% внутрисосудистого КОД [100]. Структурно EGL представляет собой отрицательно заряженный гелеобразный слой, включающий в себя олигосахаридные и полисахаридные цепи гликозаминогликанов (гепарансульфат, хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератансульфат, гиалуронан), которые ковалентно связаны с гликопротеинами и протеогликанами – как мембранными (антитромбин III, интегрины, селектины, синдеканы, глипиканы), так и растворимыми (перлекан, бигликан, версикан, декорин, мимекан). EGL имеет толщину от 0.1 до 4.5 мкм, в зависимости от локализации и размера сосуда, и служит своеобразным резервуаром белков и полисахаридов, таких как антитромбин III и гепарансульфат [99].

Неповрежденный EGL поддерживает разделение между циркулирующей плазмой и эндотелием сосудов, создавая “зону исключения”, которая не позволяет форменным элементам крови контактировать с поверхностью ЭК. В присутствии неповрежденного EGL вода и электролиты свободно проходят сначала через этот слой, а затем и за пределы ЭК через межклеточные щели. Эта “зона исключения” также препятствует контакту с эндотелием высокомолекулярных коллоидов массой >70 кДа. Альбумин является практически единственным белком плазмы, который легко перемещается между плазмой крови и EGL благодаря избирательной проницаемости EGL для природных коллоидов с молекулярной массой <70 кДа [101].

Молекулярный радиус альбумина препятствует его прохождению между соседними клетками интактного эндотелиального монослоя, что ограничивает параклеточную диффузию молекулами размером менее 3–5 нм [102–104]. Однако обнаружение альбумина в интерстициальной и лимфатической жидкостях – до 40–60% от уровня в плазме – указывает на то, что белок способен покидать просвет микрососудов даже при отсутствии воспаления [105, 106]. В работе Palade и соавт. [107] было показано, что альбумин, введенный в кровоток животных, позже обнаруживался во внутриклеточных пузырьках капиллярного эндотелия; в некоторых случаях эти пузырьки высвобождали альбумин в интерстиций, хотя при этом никогда не наблюдался разрыв межэндотелиальных контактов. Такой везикулярный транспорт известен как трансцитоз и опосредуется кавеолами; нокдаун или дефицит кавеолина-1, без которого кавеолы не могут существовать, предотвращает трансцитоз альбумина [108, 109]. Таким образом, в физиологических условиях трансцитоз альбумина является основным путем переноса альбумина из кровотока в интерстиций [107]. Учитывая важную роль альбумина в качестве транспортного средства лекарственных и токсических веществ, актуальность изучения кинетики и механизмов трансцитоза альбумина в кровеносных сосудах трудно переоценить [110]. О регуляции транспорта трансэндотелиального переноса альбумина известно мало, что отчасти обусловлено техническими трудностями при его изучении. Так, при измерении проницаемости эндотелия культивируемыми клетками было сложно отличить вклад параклеточной утечки от истинного трансцитоза [111]. Более серьезная причина слабого исследования трансцитоза альбумина эндотелиальными клетками связана с неопределенностью физиологического значения этого процесса. Мыши с дефицитом кавеолина-1 не имеют кавеол и демонстрируют пониженную эндотелиальную интернализацию альбумина, но у этих животных наблюдается компенсаторное повышение параклеточного транспорта [112]. Эта модель подчеркивает важность транспортировки альбумина за пределы сосудистого русла, но не дает ответ о физиологической функции трансцитоза. Учитывая многочисленные сайты связывания жирных кислот [113], можно предположить, что трансцитоз альбумина важен для регулируемого переноса циркулирующих жирных кислот в различные ткани. В связи с этим представляется важным давно установленный феномен: дефицит альбумина коррелирует с повышенным уровнем циркулирующего холестерина и фосфолипидов [114, 115].

Большая часть работ, связанных с изучением трансцитоза, была проведена на эндотелии легких, клетки которого связывают альбумин через гликопротеин 60 (gp60) в кавеолах и осуществляют его перенос при участии тирозиновых киназ [116, 117]. Трансцитоз альбумина в легких стимулируется тромбином, этот процесс сопряжен с повышением активности кислой сфингомиелиназы, которая способствует синтезу церамида, кавеолина-1 и его рекрутированию на липидные рафты мембраны; стимуляция трансцитоза альбумина провоспалительными медиаторами может способствовать утечке альвеолярного белка при повреждении легких [118]. Однако в легких большое значение имеет и другой механизм трансцитоза – низкоаффинное поглощение альбумина в жидкой фазе по типу пиноцитоза [119]. Пиноцитоз представляет из себя процесс неселективного поглощения клеткой жидкой фазы из окружающей среды, содержащей растворимые вещества, за счет отшнуровывания внутрь небольших пузырьков (эндосом), которые сливаются с лизосомами [120].

Долгое время практически ничего не было известно о трансцитозе альбумина в других тканях. Учитывая выраженную гетерогенность эндотелия сосудов в разных органах [121], можно было предположить, что существуют разные механизмы трансцитоза альбумина. Это предположение нашло свое подтверждение в недавней работе Raheel и соавт.: согласно их данным, трансцитоз альбумина в коже – в отличие от легких – имеет кинетику насыщения, что свидетельствует о рецептор-опосредованном процессе [122]. Было установлено, что для трансцитоза альбумина через эндотелий микрососудов дермы необходимым и достаточным условием является экспрессия гликопротеина CD36, который известен как рецептор-скавенджер (“мусорщик”) 3B класса (SR-B3), гликопротеин IV мембраны тромбоцитов (GPIV), гликопротеин IIIb (GPIIIb), рецептор тромбоспондина, рецептор коллагена, транслоказа жирных кислот (FAT) и даже как рецептор врожденного иммунитета [123]. При связывании лиганда CD36 запускает сигнальный каскад, который опосредует широкий спектр провоспалительных ответов. Например, амилоид-β1-40 (Aβ), взаимодействуя с CD36, активирует генерацию супероксид-анионов NADPН-оксидазой [124]. При остром повреждении легких ключевую роль в дисфункции эндотелиального барьера играют повышенный уровень АФК и внутриклеточного кальция: индуцированное H₂O₂ увеличение [Са²⁺]_i в ЭК микрососудов легких сопряжено с активацией TRPV4 (катионные ваниллоидные каналы 4-го типа с транзиторным рецепторным потенциалом), причем CD36 играет важную роль в H₂O₂-опосредованном повреждении легких через CD36-зависимое закрепление киназы Fyn (из Src-семейства) на клеточной мембране для облегчения фосфорилирования TRPV4 [125].

Гликопротеин CD36 экспрессирован на поверхности не только эндотелиальных клеток микрососудов, но и тромбоцитов, моноцитов, гладкомышечных клеток, кардиомиоцитов и ряда других клеток, однако отсутствует в лимфатических сосудах дермы [126]. Несмотря на широкое распространение, CD36 долгое время оставался довольно загадочным белком. Постепенно было установлено, что CD36 может влиять на клеточные ответы за счет взаимодействия с различными лигандами, в частности, с тромбоспондином-1, окисленными LDL и длинноцепочечными жирными кислотами [127, 128]. В настоящее время CD36 считается главным мембранным белком, участвующим в гомеостазе липидов организма. CD36 действует согласованно с мембранным и цитоплазматическим белками, связывающими жирные кислоты. Скорость поглощения жирных кислот зависит от присутствия CD36 на поверхности клетки, которое регулируется субклеточной везикулярной рециркуляцией CD36 от эндосом к плазматической мембране [129]. Однако неэтерифицированные жирные кислоты не могут свободно циркулировать в плазме, они связаны с альбумином [130], у которого имеется семь сайтов связывания жирных кислот [131]. Взаимодействие с CD36 сопряжено с активацией киназ Src-семейства и митоген-активируемых протеинкиназ, а также с участием Rho-ГТФаз и транскрипционных факторов NF-κB [132]. Требует ли связывание и трансцитоз альбумина участия этих или других сигнальных путей, еще предстоит выяснить.

У мышей, избирательно дефицитных по эндотелиальному CD36, отмечен пониженный уровень подкожного жира, притом что уровень циркулирующих липидов был сопоставим с таковым у контрольных животных, и представители обеих групп имели близкую массу тела [122]. Это согласуется с дефектом транспорта или метаболизма липидов на границе между эндотелием и кожей. В соответствии с этой гипотезой, анальбуминемические крысы демонстрируют выраженную гиперхолестеринемию [133], а пациенты с врожденным дефицитом альбумина демонстрируют повышенные концентрации холестерина и фосфолипидов в сыворотке крови, которые временно возвращаются к норме после внутривенных инфузий альбумина [114, 115]. Дефицит CD36 или мутации в нем ранее не связывали с фенотипом кожи [134], но это объясняется тем, что в предыдущих исследованиях изучали эффект дефицита CD36 во всем организме, а не делеции, специфичной для ЭК. После открытия роли CD36 в коже возникает вопрос о роли CD36 в эндотелии микрососудов легких. Хотя он и не опосредует трансцитоз альбумина, имеются сведения о том, что эндотелиальный CD36 легких участвует в реакции на вдыхаемые загрязнители [135] или на инфекцию [136].

Однако CD36 не является исключительным посредником воздействия жирных кислот на клетки эндотелия. В отсутствие или недостатке альбумина воспаление может возникать в результате их взаимодействия с Toll-подобными рецепторами, а не как следствие поглощения через CD36 [137]. Так, пальмитат, не связанный с альбумином, активирует воспалительные пути в ЭК микрососудов, усиливает в них генерацию и/или экспрессию IL-6, IL-8, TLR2 (Toll-подобный рецептор 2) и молекул межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), нарушает транспорт инсулина и способствует трансмиграции моноцитов. Ингибирование CD36 не влияет на индуцированную пальмитатом экспрессию молекул адгезии; в то же время подавление передачи сигналинга через TLR4 к NF-κB снижает индуцированную пальмитатом экспрессию ICAM-1 [137]. Такие варианты переключения сигналинга важны для понимания важности альбумина как в предотвращении, так и в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЛИКИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА С ЭНДОТЕЛИЕМ

У больных диабетом уровень гликированного альбумина составляет более 70 мкМ, он является одним из инициаторов апоптоза ЭК [138]. Вероятность образования атеросклеротических бляшек в каротидной артерии у больных диабетом 2-го типа коррелирует с повышенным уровнем гликированного альбумина и пониженным уровнем эндотелиальных прогениторов (CD34+/133+/309+) [139]. Интересно, что по мере формирования бляшек уровень гликированного альбумина снижался, равно как и соотношение гликированного альбумина к гликированному гемоглобину. Частично это объясняется тем, что при диабете ЭК аорты переключаются на биосинтетический фенотип с повышенным количеством кавеол и усиленным (примерно на 20%) трансцитозом гликированного альбумина. В культуре ЭК 25 мМ глюкозы вызывает примерно 2.6-кратное увеличение pSTAT-3 и pERK1 и примерно 1.8-кратное увеличение pERK2; воздействие гликированного альбумина (5 мкМ) вызывает примерно 4.3-кратное увеличение pERK1/2 по сравнению с 5 мМ глюкозы [140].

Гликированный альбумин индуцирует экспрессию прокоагулянтных и воспалительных факторов эндотелиальными клетками [141, 142]. В то же время имеются данные о том, что повышенный уровень фактора Виллебранда у диабетиков обусловлен не гликированным альбумином, а влиянием манноза-специфических лектинов на углеводородные детерминанты ЭК [143]. Правда, гликированный альбумин тестировали при невысоких его концентрациях в культуре ЭК пупочной вены человека (HUVEC) (25–100 мкг/мл), тогда как физиологически гораздо более активные лектины (конканавалин А, ConA и агглютинин зародышей пшеницы, WGA) тестировали в концентрациях ненамного меньших (4–16 мкг/мл).

При сахарном диабете многие морфофунциональные отклонения клеток опосредуются ауто- и паракринным TGF-β, который индуцируется высоким уровнем глюкозы в окружающей среде и гликозилированными белками. Для большинства типов клеток TGF-β является индуктором апоптоза, который опосредуется рецептором TGF-β типа I, Alk5. Напротив, ранняя диабетическая микроангиопатия характеризуется усилением пролиферации ЭК. ЭК уникальны тем, что экспрессируют второй рецептор TGF-β типа I, Alk1, а также корецептор эндоглин, который увеличивает сродство лиганда к Alk1. В дифференцированных ЭК здоровых субъектов конститутивно экспрессируются Alk1 и эндоглин. Однако инкубация ЭК с высоким содержанием глюкозы и гликированного альбумина в среде индуцирует экспрессию Alk5 и увеличивает секрецию TGF-β в 3 раза, не влияя на уровни Alk1 или эндоглина. “Диабетическая” среда ускоряет пролиферацию клеток, по крайней мере частично, за счет TGF-β/Alk1–smad1/5 и, вероятно, с участием VEGF, а также промиграционных MMP2 ниже Alk1. Кроме того, частично увеличивается активность каспазы-3, что указывает на усиление апоптоза с использованием пути TGF-β/Alk5–smad2/3. Эти данные свидетельствуют о плейотропии TGF-β в ЭК, включая пролиферативные эффекты (через Alk1–smad1/5) и проапоптотические сигналы (через Alk5–smad2/3) [144]. Из других провоспалительных цитокинов, синтез которых индуцирует гликозилированный альбумин, следует отметить TNF-alpha [145]. Экспрессия IL-6 эндотелиальными клетками также повышается при воздействии гликированного альбумина, но это повышение можно предотвратить ангиотензином 1–7, продуктом активности АПФ-2 [146].

Гликированный альбумин усиливает экспрессию RAGE на фоне напряжения сдвига (shear stress) [147] и повышает экспрессию адгезионных молекул VCAM-1, ICAM-1 и E-селектина [148]. Экспрессия адгезионных белков ЭК (в частности Е‑селектина или CD62E) повышается именно при воздействии гликированного альбумина, такого эффекта нет при действии разнородной смеси КПГ, которые образуются в результате неферментативного гликирования и окисления белков, липидов и нуклеиновых кислот [149]. Гликированный альбумин пациентов с сердечной недостаточностью и высоким уровнем гликирования также увеличивал экспрессию молекул адгезии в в клетках HUVEC и усиливал адгезию мононуклеарных клеток периферической крови к ЭК [150]. Как известно, мононуклеары являются мощными генераторами АФК, но что особенно важно, повышение экспрессии адгезионных молекул опосредовано генерацией АФК NADPH-оксидазой ЭК и сигнальным путем с участием киназ PKB-IKK и JNK, транскрипционных факторов NF-kB и AP-1. Методом ПЦР-ОТ установлено, что генерация АФК максимально выражена через 4 ч после начала воздействия гликозилированного альбумина и сопровождается повышением экспрессии мРНК Nox4 и p22phox [151]. Активация NOX2 эндотелия также вносит вклад в дисфункцию гломерулярного аппарата инсулин-зависимых мышей, снижая экспрессию гломерулярного гликокаликса и обусловливая морфофункциональные изменения подоцитов и мезангиальных клеток; в конечном счете, это способствует развитию диабетической нефропатии, одним из признаков которой является альбуминурия [152]. Помимо NOX4, другим источником АФК при действии гликозилированного альбумина на ЭК является разобщенная eNOS [153]. Гликированный альбумин может как усиливать, так и ослаблять активность NO-синтазы, причем оба варианта ответа отмечены при развитии апоптоза ЭК под действием гликированного альбумина [138, 154, 155]. Это соответствует представлениям о том, что при диабете ключевую роль в повреждении эндотелия играет оксидативный стресс, а степень гликирования альбумина влияет на его интенсивность через возможную связь между NADPН-оксидазами, митохондриями и другими источниками АФК [156]. Недавно было показано, что одним из важных посредников КПГ-индуцированной диабетической дисфункции эндотелия является пероксидазин (PXDN), представитель семейства пероксидаз, катализирующий превращение пероксида водорода в гипохлористую кислоту. Полагают, что источником АФК при воздействии КПГ является NOX2, а действие HOCl приводит к ослаблению фосфорилирования eNOS по Ser1177 и снижению синтеза NO [157]. Еще одним участником антиоксидантной защиты ЭК и мишенью гликозилированного альбумина является внутриклеточная параоксоназа-2 (PON2). Гликозилированный альбумин, а также N-карбоксиметиллизин (КМЛ, наиболее известный представитель КПГ) подавляют экспрессию и активность PON2 в клетках эндотелия [158]. Кроме того, воздействие гликированного альбумина и КМЛ на эндотелий приводит к повышению уровня маркеров стресса эндоплазматического ретикулума GRP78 и IRE1α, а также к усилению экспрессии провоспалительных цитокинов MCP-1, IL-6, IL-8, белков адгезии ICAM1 и VCAM1. В то же время усиление экспрессии PON2 приводит к снижению уровня АФК и облегчает эндотелиальную дисфункцию, вызванную КПГ [158].

РОЛЬ МОДИФИЦИРОВАННОГО АЛЬБУМИНА В ПАТОГЕНЕЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Несмотря на доступность мажорных белков вообще и альбумина в частности, сведений о механизмах модификации альбумина и о механизмах влияния модифицированного альбумина на клетки, ткани и здоровье в целом недостаточно, а имеющиеся данные часто противоречивы. Специфика патогенеза того или иного органа обусловлена тем, что при повреждении эндотелия выход альбумина за пределы сосудистого русла выходит из-под контроля, что приводит к изменению биологической активности клеток паренхимы. Кроме того, клетки крови также могут служить мишенью КПГ и гликированного альбумина, что, как правило, усугубляет состояние ЭК и обусловливает нарушение гематотканевых барьеров. Так, гликозилированный альбумин усиливает тромбогенный потенциал тромбоцитов вследствие повышения количества и чувствительности рецепторов [159].

Патогенная роль КПГ и гликированного альбумина наиболее хорошо изучена при ожирении, диабетической полинейропатии и нефропатии [58, 160, 161]. Коронавирус SARS-CoV-2, ставший причиной пандемии COVID-19, стимулировал исследования взаимосвязи между восприимчивостью к инфекции и наличием других заболеваний в анамнезе, в том числе перечисленных выше, одним из патогенных факторов которых является гликированный альбумин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ИНТЕГРАТИВНЫЕ КАЧЕСТВА АЛЬБУМИНА В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ

Уровень альбумина в плазме или сыворотке крови многие годы служил классическим маркером статуса питания, особенно в отношении белковой пищи, при этом уровень менее 35 г/л определяется как гипоальбуминемия. В последнее время низкий уровень альбумина все чаще рассматривается как фактор риска и предиктор заболеваемости/смертности независимо от пола, возраста, сопутствующих заболеваний и всякого рода полиморфизмов [192–194]. С точки зрения диагностики, уровень альбумина в плазме крови и в моче характеризует не просто уровень одного из белков, а, по сути, интегративные его характеристики с точки зрения оценки состояния всего организма, поскольку отражает белок-синтезирующую функцию печени (отсюда его роль в качестве отрицательного острофазного белка [195]) и функциональное состояние эндотелия сосудов, определяющее целостность гематотканевых барьеров. Взаимосвязь между целостностью эндотелия и уровнем альбумина в моче – наиболее изученное явление в медицинской практике, указывающее в первую очередь на патологию почек, но также и на состояние других компонентов крови и сердечно-сосудистой системы [196–198]. В ряду этих компонентов эндотелий сосудов мозга представляет наибольший интерес, поскольку по ту сторону барьера находится “святая святых” – паренхима мозга, функциональные единицы которой оказались чрезвычайно уязвимы к действию альбумина благодаря наличию на астроцитах рецептора, еще недавно считавшегося специфичным к TGF-β, одному из минорных белков-цитокинов, регулирующих дифференцировку и апоптоз клеток [190, 191]. В период начала или даже расцвета исследований цитокиновой регуляции такое трудно было даже представить: общий рецептор к белкам, разница концентраций которых в сыворотке крови составляет более 9 (!) порядков. Разница в аффинности к рецептору компенсируется потенциальным превосходством в количестве молекул альбумина, которые могут получить доступ к рецепторам астроцитов при нарушении целостности ГЭБ. В связи с этим огромный интерес представляют цитотоксические характеристики редокс-модифицированного и гликированного альбумина не только по отношению к ЭК кровеносных сосудов, но и по отношению к цитокиновым рецепторам астроцитов.

Масштабный поиск новых диагностических показателей с использованием современных технологий метаболомики позволил выделить из огромного перечня всего четыре простых показателя плазмы крови, которые позволяют с высокой точностью оценить состояние здоровья человека и прогнозировать вероятность летального исхода для пациентов независимо от их возраста, пола и характера имеющихся или перенесенных заболеваний; среди этих четырех показателей уровень альбумина по степени вклада в интегральную оценку, и прогноз оказался на втором месте после орозомукоида (альфа-1-кислый гликопротеин) [193]. Аналогичный результат получен при исследовании пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии: использование простого соотношения положительных (С-реактивный белок) и отрицательных (альбумин) острофазных белков может значительно повысить точность оценки риска смертельного исхода [199]. Близкое по своей структуре соотношение, но с маркерами повреждения мышечных волокон в числителе (креатинкиназа или миоглобин) существенно повышает корреляцию биохимических показателей с показателями функциональными и физиологическими (инструментальными) [200]. Соотношение альбумин/креатинин в моче является одним из наиболее чувствительных индикаторов клубочковой почечной дисфункции и гипертонии у пациентов с нейробластомой высокого риска, получавших миелоаблативные схемы терапии [201]. А уже в период пандемии коронавирусной инфекции было установлено, что существует обратная корреляция между смертностью от COVID-19 и концентрацией альбумина в крови [202]. Авторы исследования предположили, что эта ассоциация может быть связана с антикоагулянтными и антиоксидантными свойствами альбумина.

Грамотное применение методов регрессионного анализа позволяет повысить чувствительность и специфичность диагностики диабетических осложнений за счет использования “внутренних” показателей альбумина, таких как соотношение его восстановленной и окисленной форм [203]. Отношение окисленного альбумина к общему альбумину может увеличиваться при заболеваниях печени, диабете, сердечно-сосудистых заболеваниях, что приводит к бактериальным или вирусным инфекциям. И опять же в период пандемии было установлено, что вследствие индукции цитокинового шторма уровень окисленного альбумина в крови пациентов с COVID-19 может быть положительным предиктором смертности [181].

Однако альбумин может служить не только биомаркером тяжести различных патологий, но и средством терапии. Вследствие своей важнейшей физиологической роли, альбумин человека пользуется наибольшим спросом среди других биофармацевтических препаратов. В настоящее время годовая потребность в HSA во всем мире оценивается примерно в 500 тонн [204]. Инъекции 5%-ного раствора альбумина (изоонкотический раствор) назначают при необходимости увеличения внутрисосудистого объема, инъекции 20–25%-ного раствора альбумина (гиперонкотический раствор) назначают для восстановления коллоидно-осмотического (онкотического) давления и сохранения баланса жидкости между внутрисосудистым и внесосудистыми компартментами [205]. Клиническими показаниями к применению 4–5%-ного раствора альбумина являются гиповолемический шок, острая печеночная недостаточность, проведение искусственного кровообращения [206]. Показания к применению 20–25%-ного раствора – гипоальбуминемия, сепсис или септический шок, цирроз печени с асцитом [207]. В то же время следует иметь в виду, что рутинная коррекция гипоальбуминемии у тяжелобольных не рекомендуется, а ее использование при сепсисе и септическом шоке остается дискуссионным. Постоянная инфузия раствора с 4% альбумина пациентам отделения интенсивной терапии снижает риск внутрибольничных инфекций [208]. Согласно полученным данным, альбумин восстанавливает окисленную форму вазостатина-1 и тем самым восстанавливает его антимикробные свойства. Альбумин можно использовать для доставки сераорганических соединений к клеткам меланомы с целью ингибирования синтеза меланина [209]. Способность альбумина связывать воду может быть использована при лечении отравлений органофосфатами. Уменьшение гликокаликса приводит к снижению онкотического давления и гиповолемии, так что соответствующая компенсация могла бы стать одним из терапевтических факторов при остром отравлении органофосфатами с целью снижения риска гибели и предотвращения отставленной патологии. Действительно, описаны случаи успешного использования свежезамороженной плазмы при лечении так называемого “промежуточного синдрома”, одного из возможных последствий отравления фосфорорганическими соединениями [210].

В то же время, введение альбумина в некоторых ситуациях может оказаться опасным. Состояния, при которых использование альбумина противопоказано из-за риска острой перегрузки кровообращения, – сердечная и почечная недостаточность, острый или хронический панкреатит, отек легких или тяжелая анемия. Также не рекомендуется применение альбумина при таких состояниях как асцит, реагирующий на диуретики, негеморрагический шок, гипоальбуминемия без возникновения отеков или острой гипотензии, недоедание, открытые раны, острая нормоволемическая гемодилюция в хирургии, потеря белка вследствие энтеропатии или мальабсорбции. Кроме того, использование альбумина может оказаться опасным для жизни пациентов с церебральной ишемией и черепно-мозговой травмой [205, 211].

Наиболее простым и естественным с физиологической точки зрения способом влияния на уровень и свойства альбумина является т.н. “функциональное питание”, т.е. использование в пищу таких продуктов и применение таких способов их обработки, которые бы в максимальной степени сохраняли количество и полезные качества содержащихся в них нутрицевтиков, которые, в свою очередь, оказывали бы позитивное влияние и на микрофлору кишечника, и на функциональное состояние печени, где происходит частичный метаболизм нутрицевтиков и синтез альбумина, а также на состояние альбумина в плазме крови, т.к. многие полифенолы и другие нутрицевтики связываются и транспортируются в системном кровотоке преимущественно альбумином [212], изменяя его конформацию и конкурируя с другими лигандами, среди которых конечно же могут быть жирные кислоты и КПГ. Связь между гликированным альбумином и другими КПГ, поступающими с пищей, с одной стороны, и микробиотой кишечника, с другой стороны, относительно недавно стала предметом исследования [213]. Справедливо обозначена необходимость в разработке стандартизированных методов определения нормы потребления КПГ. Многочисленные исследования показали, что полифенолы в значительной степени определяют численность, состав и состояние кишечных бактерий, которые, в свою очередь, модулируют неврологические заболевания [214]. Полифенолы обладают не только качествами антиоксидантов, но также способностью защиты белков от гликирования (антигликативная способность). Потребление полифенолов с пищей обусловливает повышение в периферической крови концентрации фенольных кислот, из которых мажорной (доминирующей) является 3-гидроксифенилуксусная (до 338 мкМ), тогда как концентрации других фенольных кислот находятся в диапазоне от 13 нМ до 200 мкМ. В эксперименте in vitro было показано, что предварительная инкубация BSA с разными фенольными кислотами и последующим гликоксидированием альбумина (глюкоза 5–10 мМ в сочетании с 10 нМ H₂O₂) существенно снижает концентрацию фруктозамина [215]. Среди распространенных полифенолов, способных снижать степень гликирования альбумина, – хризин и лютеолин, структурно близкие агликоны флавонов, содержащиеся в брокколи, перце чили, сельдерее, розмарине и меде [80]. Известны антиканцерогенные и кардиозащитные свойства лютеолина и хризина, в частности, благодаря их способности нейтрализовать АФК, подавлять экспрессию циклооксигеназы-2 и образование простагландина E2 [216]. Богатый полифенолами экстракт лекарственного растения Doratoxylon apetalum оказался эффективным антиоксидантом для защиты ЭК, уменьшая в них уровень АФК – пероксида водорода и супероксида [215]. Помимо полифенолов, экстракт чеснока также ингибирует образование КПГ, в том числе гликированного альбумина [217].

Полагают, что обусловленное старением сопряжение оксидативного и карбонильного стресса (gluco-oxidative stress) с образованием КПГ генерирует неоэпитопы на белках крови, способствуя выработке аутоантител у пожилых людей, особенно у курильщиков. Использование натуральных продуктов с нутрицевтиками-антиоксидантами снижает проявление возрастных патофизиологических изменений. Механизм защитного действия полифенолов до конца не раскрыт, но предполагается, что полифенолы нековалентно взаимодействуют с остатками ароматических аминокислот альбумина; такое гидрофобное взаимодействие способствует ремоделированию зрелых КПГ-модифицированных амилоидных фибрилл и трансформируют вторичную структуру в спиральную или беспорядочную спиралевидную конформацию [92]. Хризин и лютеолин препятствуют формированию альбуминовых фибрилл. Результаты докинга показали, что оба флавоноида нековалентно взаимодействуют с различными аминокислотными остатками субдомена IIA, среди которых склонные к гликированию лизины и аргинины, и дополнительно стабилизируют структуру HSA, что объясняет механизм их действия как антигликирующих и антифибриллирующих агентов [80]. Предполагается, что полифенольные соединения обладают плейотропным действием и препятствуют гликированию на разных уровнях: посредством регуляции метаболизма глюкозы, хелатирования металлов, улавливания промежуточных дикарбонильных соединений, влияния на инсулинорезистентность клеток, наконец, посредством активации сигнального пути рецептора инсулиноподобного фактора роста [218].

Таким образом, выявленные в последние годы характеристики альбумина свидетельствуют о том, что этот мажорный белок плазмы крови, которому еще недавно отводили “скромную” роль осмотически активного компонента, по сути является молекулярным “стержнем”, связующим звеном между различными тканями и органами, свидетельствующим о здоровье всего организма и во многом определяющим это здоровье. Современная диагностика, патогенез различных заболеваний и разработка средств терапии в настоящее время немыслимы без комплексного учета физико-химических, эволюционно-генетических и физиолого-биохимических характеристик альбумина.