Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2021, T. 107, № 4-5, стр. 647-660

ВВЕДЕНИЕ

Синаптическая передача в нервно-мышечном соединении опосредуется высвобождением из нервного окончания молекул ацетилхолина (АХ), которые связываются с рецепторами АХ в постсинаптической области сарколеммы, что приводит к возникновению спонтанных или вызванных потенциалов концевой пластинки [1]. Модуляция синаптической передачи может опосредоваться как собственно молекулами АХ [2], так и синаптически активными молекулами, способными выделяться как из двигательной нервной терминали, так и из глиальных клеток. В качестве таких регуляторов могут выступать молекулы аденозин-5'-трифосфата (АТФ) и его производные, глутамат, N-ацетиласпартилглутамат, вещество P (нейропептид из семейства тахикининов), оксид азота (NO) и др. [3–7].

Одним из наиболее активно изучаемых регуляторов нервно-мышечной трансмиссии является АТФ, который выделяется из синаптических везикул вместе с АХ [8]. Не только АТФ, но и его производные (АДФ, АМФ и аденозин) способны оказывать модуляторное действие на синаптическую передачу, активируя широкий спектр пуриновых рецепторов, среди которых выделяют две большие группы: рецепторы аденозина, или P1, и рецепторы P2, которые активируются АТФ, АДФ, уридин-5'-дифосфатом и уридин-5'-трифосфатом [8, 9]. АТФ и аденозин снижают уровень квантового высвобождения АХ, активируя пресинаптические пуриновые рецепторы [10, 11]. Предположительно, вышеупомянутые эффекты связаны с подавлением входа кальция в нервное окончание [10, 12].

АТФ является важным медиатором химически индуцированной ноцицепции и боли, высвобождаясь из поврежденной и/или воспаленной ткани [13]. АТФ сенситизирует каналы первого типа подсемейства TRPV, называемые ваниллоидными каналами (англ. “transient receptor potential cation channels”, TRPV1), активируемые капсаицином или протонами [14, 15]. Помимо протонов, в качестве эндогенных активаторов могут выступать такие воспалительные агенты, как “эндованиллоиды” (анандамид, N-арахидоноил дофамин и др.) [14, 16]. Получены данные, указывающие на присутствие TRPV1-каналов в периферических нервно-мышечных синапсах [17]. Активация этих каналов приводит к снижению количества выделяемых квантов АХ при стимуляции двигательного нерва [18].

Таким образом, механизм снижения выделения АХ из нервного окончания может запускаться активацией как пуриновых рецепторов, так и TRPV1-каналов. В связи с этим встал вопрос о наличии или отсутствии взаимосвязи между сигнальными путями регуляции выделения АХ, которые инициируются пуриновыми и ваниллоидными рецепторами. Также встает вопрос о том, могут ли в механизмах модуляторного действия пуринов и агонистов TRPV1-рецепторов на квантовую секрецию АХ в периферических нервных окончаниях теплокровных быть задействованы цепочки, связанные с изменением пресинаптического уровня кальция. Поиск ответов на эти вопросы и стал целью настоящего исследования.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные процедуры выполняли в соответствии с инструкциями по использованию лабораторных животных Казанского федерального университета и Казанского медицинского университета в соответствии с руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Протокол эксперимента соответствовал требованиям Директивы Совета европейских сообществ 86/609/EEC.

Исследования были проведены на изолированных нервно-мышечных препаратах мыши (линия BALB/c, m. Levator Auris Longus). Нервно-мышечные препараты помещали в ванночку объемом 3 мл, дно которой было покрыто смолой Sylgard (Dow Corning, США). Препараты растягивали на 15% от их исходного размера в покое при помощи микроигл из нержавеющей стали. Через ванночку протекал раствор со скоростью 3 мл/мин. следующего состава (в мМ): 137 NaCl; 5 KCl; 1 MgCl₂; 2 CaCl₂; 1 Na₂HPO₄; 15 NaHCO₃; 11 глюкоза. Раствор аэрировали карбогеном (95% O₂, 5% CO₂), pH раствора составлял 7.2–7.4, температуру в ванночке поддерживали встроенными элементами Пельтье на уровне 20.0 ± 0.3°C.

Нерв раздражали прямоугольными стимулами длительностью 0.25 мс супрамаксимальной амплитуды с частотой 0.5 Гц при помощи всасывающего электрода. Во всех экспериментальных сериях сокращения нервно-мышечного препарата блокировали путем добавления в омывающий раствор μ-конотоксина GIIIB 2 мкМ (Peptide Institute Inc., Япония).

В ходе экспериментов методами внутриклеточного отведения потенциала осуществлялась регистрация вызванных и спонтанных (миниатюрных) потенциалов концевой пластинки (ПКП и мПКП). Электроды для измерения потенциалов изготавливались на приборе P-97 Micropipette Puller (Sutter Instrument, США). Сопротивление электродов составляло порядка 30 МОм. Заполнялись электроды 3-х молярным раствором KCl. Регистрация и анализ постсинаптических сигналов осуществлялись с помощью установки для электрофизиологических исследований, включающей в себя: микроскоп BX 51 (Olympus, Япония) с водно-иммерсионным объективом (увеличение 60×, апертура 1.00), двухканальный усилитель биопотенциалов AxoClamp 900A (Axon Instruments, США), стимулятор 2100 (A-M Systems, США), аналого-цифровой преобразователь Digidata 1440A (Axon Instruments, США) с частотой дискретизации 100 кГц, микроманипуляторы MPC-200 (Sutter Instruments, США) и компьютер. Для регистрации мембранного потенциала и непрерывной записи событий во время эксперимента к усилителю также был подключен медленный аналого-цифровой преобразователь MiniDigi 1B (Axon Instruments, США) с частотой дискретизации 1 кГц.

Обработка и регистрация данных производилась в программном пакете pCLAMP 10.4. Величина мембранного потенциала, при котором начинали регистрацию, варьировала в диапазоне 65–75 мВ. Результаты экспериментов, в которых мембранный потенциал покоя изменялся в течение опыта более, чем на 10 мВ не анализировались. В каждом эксперименте в одном синаптическом контакте регистрировали 30–50 вызванных ПКП, после чего, в течение 2-х минут записывали мПКП в контроле и после действия фармакологических агентов. Квантовый состав находили путем деления усредненных амплитуд вызванных ПКП на среднюю амплитуду мПКП. Для коррекции квантового состава на нелинейность суммации использовали поправку Мартина [19].

Для регистрации относительного изменения уровня Са²⁺ в пресинаптической клетке (Са²⁺-транзиента) использовалась фотометрическая система на базе микроскопа Olympus BX 51, оснащенная высокоскоростной чувствительной камерой Red Shirt Imaging Neuro CCD-smq camera (Red Shirt Imaging, США). Регистрация Са²⁺‑транзиента осуществлялась с использованием специфического Са²⁺-чувствительного флуоресцентного красителя Oregon Green 488 Bapta 1 hexapotassium salt (Molecular Probes, США). Загрузку кальциевого красителя (1 мМ) в двигательные моторные окончания осуществляли через культю нерва [20].

Для записи и обработки данных в экспериментах по измерению Са²⁺-транзиента использовались программы Turbo-SM и ImageJ. Данные представлены в виде отношения: (ΔF/F₀ – 1) × 100%, где ΔF – интенсивность флуоресценции во время стимуляции, F₀ – интенсивность флуоресценции в состоянии покоя.

Эксперименты осуществляли по следующему протоколу: записывали контрольные сигналы, после чего апплицировали вещество с помощью системы общей перфузии в течение 20 мин и регистрировали сигналы под действием вещества. Применяли следующие вещества: капсаицин (1 мкМ, 10 мкМ), SB 366791 (5 мкМ) и АТФ (100 мкМ). В экспериментах с капсаицином и SB 366791 вещества предварительно растворяли в DMSO. В экспериментах, проведенных с этими агентами, в контрольный раствор добавляли такую же концентрацию DMSO, которая присутствовала в растворе с апплицируемым веществом. В конечном итоге концентрация DMSO в растворе не превышала 0.01%.

Экспериментальные данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего. В электрофизиологических экспериментах n – количество синапсов, соответствующее количеству нервно-мышечных препаратов. В экспериментах по регистрации кальциевого транзиента n – количество синапсов в нервно-мышечных препаратах от 4–6 животных. Для статистической обработки результатов использовали двухсторонний критерий Стьюдента. Проверку выборки на нормальное распределение проводили с помощью критерия Андерсона–Дарлинга. В экспериментах с тремя группами данных применяли поправку Бонферрони на мно́жественную проверку гипотез. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На начальном этапе исследования оценивали влияние активации ваниллоидных и пуриновых рецепторов на процесс спонтанной квантовой секреции АХ. Частота мПКП в контроле в синапсах m. LAL составила 1.2 ± 0.1 имп/с (n = 15). На рис. 1 представлены фрагменты нативных записей миниатюрных потенциалов концевой пластинки и гистограммы распределения амплитуд мПКП в контроле и под действием капсаицина. Капсаицин в концентрациях 1 и 10 мкМ приводил к снижению частоты на 13.3 ± 0.7% (p < 0.05, n = 7) и 13.2 ± 4.6% (p < 0.05, n = 4) соответственно (рис. 1, 2). Так как не наблюдалось выраженного дозозависимого эффекта капсаицина на частоту (и, как показано ниже, на квантовый состав ПКП) в дальнейшем использовали агонист в концентрации 1 мкМ.

Рис. 1.

Миниатюрные потенциалы концевой пластинки (mEPPs), зарегистрированные в нервно-мышечных синапсах m. LAL в контроле (Control), под действием капсаицина (CAP) и АТФ (ATP). Представлены данные в рамках двух репрезентативных экспериментов: верхняя панель эксперимент с капсаицином, нижняя с АТФ. Слева – фрагменты нативных записей мПКП; в центре – гистограммы распределения амплитуд мПКП; справа – гистограммы распределения межимпульсных интервалов мПКП. Кривые на гистограммах – функции плотности вероятности для распределений Гаусса и Пуассона (черные – контроль, серые – после аппликации вещества).

Рис. 2.

Влияние агониста TRPV1-каналов капсаицина (CAP; 1 и 10 мкМ), блокатора TRPV1-каналов SB 366791 (SB; 5 мкМ) и АТФ (ATP; 100 мкМ) на частоту мПКП (Frequency mEPP), выраженную в процентах от контрольного значения. В экспериментах с SB 366791 и АТФ капсаицин использовали в концентрации 1 мкМ. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. n = 4–8, *p < 0.05 по сравнению с контролем.

Конкурентный антагонист TRPV1-каналов SB 366791 в концентрации 5 мкМ не оказывал влияния на спонтанную секрецию АХ, и частота мПКП составляла 94.6 ± 6.3% относительно контроля (p > 0.05, n = 8; рис. 2), в то же время на фоне SB 366791 эффект капсаицина полностью отсутствовал (109.0 ± 7.7%; p > 0.05, n = 8; рис. 2). Следовательно, снижение уровня спонтанного выделения АХ под действием капсаицина опосредовано активацией TRPV1-каналов.

Ранее неоднократно было показано, что АТФ угнетающе влияет на процесс спонтанной нейросекреции АХ [10, 21, 22]. В наших экспериментах АТФ в концентрации 100 мкМ приводил к снижению частоты мПКП на 18.2 ± 6.5% (p < 0.05, n = 6; рис. 1, 2).

Поскольку АТФ способен модулировать работу TRPV1-каналов [14], то необходимо было оценить возможность реализации угнетающего действия нуклеозидтрифосфата посредством активации ваниллоидных рецепторов. На фоне антагониста TRPV1-каналов SB 366791 в концентрации 5 мкМ угнетающий эффект АТФ реализовывался в полном объеме, и частота мПКП снижалась на 25.5 ± 6.8% (p < 0.05, n = 7; рис. 2). В то же время на фоне активации TRPV1-каналов капсаицином действие АТФ на спонтанную квантовую секрецию устранялось, и частота мПКП соответствовала уровню, зарегистрированному в присутствии только капсаицина (101.0 ± 9.4%; p > 0.05, n = 8; рис. 2). Во всех экспериментах с добавлением АТФ наблюдалось увеличение времени спада мПКП, которое в среднем составляло 3.0 ± 0.2 мс (n = 7) в контроле. При аппликации только нуклеозидтрифосфата время спада увеличивалось на 28.3 ± 11.0% (p < 0.05, n = 6); в экспериментах, где АТФ добавляли на фоне антагониста TRPV1-каналов, данный параметр увеличивался на 57.7 ± 16.3% (p < 0.05, n = 7). В экспериментальной серии, когда апплицировали АТФ после капсаицина, время спада возрастало на 65.0 ± 7.9% (p < 0.5, n = 8). Во всех других сериях (капсаицин 1 мкМ; капсаицин 10 мкМ; SB 366791; капсаицин 1 мкМ на фоне SB 366791) изменений во времени спада мПКП не наблюдалось (p > 0.05 во всех случаях).

Поскольку при активации TRPV1-рецепторов угнетающее влияние АТФ на частоту мПКП полностью отсутствует, то есть основания полагать наличие определенной взаимосвязи между сигнальными путями регуляции спонтанного выделения АХ, которые инициируются пуриновыми и ваниллоидными рецепторами. Возможность наличия такой взаимосвязи регуляторных механизмов была проверена далее в экспериментах с регистрацией вызванной квантовой секреции АХ.

Среднее значение квантового состава в контроле для препарата m. LAL составило 34.4 ± 2.5% (n =25). Под действием капсаицина (1 мкМ) квантовый состав ПКП снижался на 16.0 ± 3.6% (p < 0.05, n = 7; рис. 3). Повышение концентрации капсаицина до 10 мкМ не приводило к увеличению угнетающего эффекта, квантовый состав снижался на 15.4 ± 5.7% (p < 0.05, n = 4; рис. 3). В присутствии антагониста TRPV1-каналов SB 366791 (5 мкМ) квантовый состав ПКП не изменялся (102.2 ± 4.1%; p > 0.05, n = 8; рис. 4), однако ингибирующий эффект капсаицина устранялся полностью (101.1 ± 2.1%; p > 0.05, n = 8; рис. 4).

Рис. 3.

Угнетающее влияние капсаицина (CAP) в концентрациях 1 мкМ (n = 7) и 10 мкМ (n = 4) на вызванное стимуляцией нерва выделение АХ. Панель (a) – нативные записи вызванных и миниатюрных потенциалов концевой пластинки (усредненные по 50 сигналам) в отдельно взятом эксперименте в контроле и после аппликации капсаицина. Панель (b) – относительное изменение величины квантового состава потенциалов концевой пластинки (QC), выраженное в процентах от контрольного значения (по всем экспериментам в серии). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. *p < 0.05 по сравнению с контролем.

Рис. 4.

Отсутствие влияния блокатора TRPV1-каналов SB 366791 (SB; 5 мкМ, n = 8), а также эффекта капсаицина (CAP; 1мкМ, n = 8) в присутствии этого блокатора на вызванное стимуляцией нерва выделение АХ. Панель (a) – нативные записи вызванных и мПКП (усредненные по 50 сигналам) в отдельно взятом эксперименте в контроле и после аппликации фармакологических агентов. Панель (b) – относительное изменение величины квантового состава ПКП (QC), выраженное в процентах от контрольного значения (по всем экспериментам в серии). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Далее, как и в экспериментах со спонтанной квантовой секрецией, оценивали возможность взаимосвязи между пуринергическим и ваниллоидным сигнальными путями регуляции вызванного освобождения АХ.

АТФ в концентрации 100 мкМ снижал квантовый состав ПКП на 14.9 ± 3.3% (p < 0.05, n = 6; рис. 5). Данный угнетающий эффект АТФ на фоне антагониста TRPV1-каналов SB 366791 в концентрации 5 мкМ сохранялся, и квантовый состав снижался на 22.5 ± 2.0% (p < 0.05, n = 7; рис. 5). Далее было установлено, что АТФ на фоне активации TRPV1-каналов капсаицином не способен оказывать своего угнетающего влияния на вызванную квантовую секрецию АХ (квантовый состав составил 99.8 ± 4.8%; p > 0.05, n = 7; рис. 5).

Рис. 5.

Угнетающее влияние АТФ (ATP; 100 мкМ) на вызванное стимуляцией нерва выделение АХ; отсутствие эффекта АТФ после предварительной аппликации агониста TRPV1-каналов капсаицина (CAP; 1 мкМ) и проявление угнетающего действия АТФ после блокады TRPV1-каналов SB 366791 (SB; 5 мкМ). Панели а, b и c – нативные записи вызванных и мПКП (усредненные по 50 сигналам) в отдельно взятом эксперименте в контроле и после аппликации фармакологических агентов. Панель d –относительное изменение величины квантового состава ПКП (QC), выраженное в процентах от контрольного значения (по всем экспериментам в серии). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. n = 6–7, *p < 0.05 по сравнению с контролем.

Рис. 6.

Отсутствие влияния агониста TRPV1-каналов капсаицина (CAP; 1 мкМ, n = 9), блокатора данных каналов SB 366791 (SB; 5 мкМ, n = 18) и АТФ (ATP; 100 мкМ, n = 12) на Ca²⁺-транзиент в нервном окончании при стимуляции двигательного нерва. Панели а, b и c – изменения интенсивности флуоресценции (∆F/F₀) в контроле и после аппликации фармакологических агентов (представлены нативные записи, усредненные по 8 сигналам и зарегистрированные в отдельно взятых экспериментах). Панель d – средние значения и ошибки, выраженные в процентах от контрольного значения амплитуды Са²⁺-транзиента (по всем экспериментам в серии). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Как и в экспериментах с регистрацией мПКП, у вызванных ПКП также наблюдалось увеличение времени спада сигнала во всех случаях (p < 0.05), когда апплицировали АТФ (только АТФ, АТФ на фоне капсаицина, АТФ на фоне SB 366791). Эти данные предполагают наличие постсинаптического действия нуклеозидтрифосфата, не связанного напрямую с механизмом действия АТФ на процесс нейросекреции АХ.

Поскольку количество квантов АХ, выделившихся в ответ на стимуляцию двигательного нерва, сильно зависит от уровня входящего в нервную терминаль Са²⁺ [23], то было сделано предположение, что в основе механизмов действия АТФ и капсаицина может лежать изменение входа Са²⁺. Проверка этого предположения весьма интересна, так как TRPV1-рецепторы представляют собой потенциал независимые кальциевые каналы [24].

При регистрации Са²⁺-транзиента в нервной терминали, амплитуда которого коррелирует с входом Са²⁺ в нервное окончание и изменением квантового освобождения медиатора [25], были получены следующие результаты.

Аппликация как агониста (капсаицин, 1 мкМ), так и блокатора (SB 366791, 5 мкМ) TRPV1-рецепторов никак не повлияла на амплитуду Са²⁺-транзиента (106.7 ± 1.8%; p > 0.05, n = 9 и 101.4 ± 1.3%; p > 0.05, n = 18 соответственно; рис. 6 ). При исследовании механизма действия АТФ также не было обнаружено значимого изменения в Са²⁺-транзиенте, амплитуда которого составила 97.6 ± 2.5% (p > 0.05, n = 12; рис. 6 ).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании впервые был обнаружен феномен угнетающего влияния капсаицина на процесс спонтанной квантовой секреции АХ из двигательных нервных окончаний и доказано участие TRPV1-рецепторов в этом регуляторном процессе. Впервые в нервно-мышечном синапсе описан эффект применения соединения SB 366791, специфического конкурентного антагониста TRPV1, который устраняет эффект капсаицина в более низкой концентрации, чем используемый в ряде работ капсазепин. Впервые показано, что предварительная активация TRPV1-каналов полностью препятствует развитию угнетающего действия АТФ как на спонтанную, так и на вызванную секрецию АХ. Впервые показано, что при инициации исследуемых регуляторных механизмов значимых изменений пресинаптического уровня кальция (Са²⁺-транзиента) при стимуляции нерва не происходит.

Феномен пуринергической модуляции выделения АХ из двигательной нервной терминали позвоночных установлен достаточно давно [8], относительно хорошо исследован [10, 21, 22], и продолжает изучаться по настоящий момент [26]. Полученные в нашей работе данные об угнетающем влиянии АТФ на процессы спонтанной и вызванной квантовой секреции в нервно-мышечном синапсе m. LAL полностью согласуются с данными литературы [21, 22]. Более того, нами получены доказательства наличия и постсинаптического действия АТФ, заключающееся в увеличении времени спада сигналов (как мПКП, так и ПКП). Ранее было доказано, что в основе данного механизма действия АТФ на временные параметры постсинаптических сигналов лежит активация экстрасинаптических P2Y1-рецепторов и ингибирование хлорных каналов мембраны мышечного волокна [27].

Возможность участия ваниллоидных рецепторов в регуляции нервно-мышечной нейротрансмиссии у млекопитающих была обнаружена сравнительно недавно и все еще остается слабо изученным феноменом [17, 18]. Так, на препарате диафрагмы мыши было впервые показано угнетающее влияние капсаицина на процесс вызванной нейросекреции АХ, однако какого-либо эффекта агониста ваниллоидных рецепторов на процесс спонтанного квантового выделения медиатора обнаружено не было [18]. В наших же экспериментах получены результаты, подтверждающие наличие данного механизма, угнетающего вызванное высвобождение квантов АХ из нервного окончания. В то же время впервые обнаружено, что капсаицин способен снижать и уровень спонтанного выделения АХ, причем данный эффект агониста полностью устранялся селективным конкурентным антагонистом TRPV1-каналов SB 366791.

Обнаружение факта снижения спонтанной секреции АХ при активации TRPV1-каналов в препарате m. LAL, в отличие от препарата диафрагмы, свидетельствует о наличии некоторых функциональных особенностей синаптических контактов в разных препаратах. Вероятно, эти особенности и накладывают свой отпечаток на то, что выраженность эффектов АТФ на процессы как спонтанной, так и вызванной секреции АХ несколько ниже, чем в синапсах диафрагмы [21, 22].

Схожесть во влиянии АТФ и капсаицина (угнетение обеими фармакологическими агентами процессов как спонтанной, так и вызванной секреции АХ) может свидетельствовать о возможном наличии общего звена в путях пуринергической и TRPV1-опосредованной регуляции процессов нейросекреции АХ. В настоящем исследовании получены данные, демонстрирующие, что эффект АТФ как на спонтанную, так и на вызванную секрецию АХ отсутствует при предварительной аппликации агониста TRPV1-рецепторов, но сохраняется при блокаде последних селективным антагонистом. Эти результаты позволяют нам заключить: в механизмах, запускаемых активацией как TRPV1-рецепторов, так и пуринорецепторов, имеет место наличие одного общего звена, которое отвечает за снижение количества выделяемых квантов АХ.

В качестве такой мишени могли бы выступить молекулы, тем или иным образом влияющие на метаболизм кальция в нервном окончании. Это могут быть как потенциал-чувствительные кальциевые каналы [12, 28], так и внутриклеточные кальциевые депо [29]. Методика регистрации Са²⁺-транзиента в нервном окончании как раз и позволяет нам фиксировать изменения интегрального внутриклеточного кальция. Ранее на нейронах крысы было установлено, что активация Р2Y-рецепторов приводит к уменьшению входа ионов кальция через потенциал-зависимые кальциевые каналы N типа [30]. О снижении входа кальция в нервное окончание под действием АТФ свидетельствуют и данные, полученные на нервно-мышечном синапсе лягушки [10, 12]. В свою очередь, TRPV1-каналы проявляют довольно большую селективность к Са²⁺ и участвуют в регуляции содержания Са²⁺ в цитозоле клетки [24, 31]. Кроме того, было высказано предположение, что кальций, входящий через TRPV1-каналы в двигательном нервном окончании, способен изменять уровень мембранного PIP2 и приводить, таким образом, к уменьшению уровня выделения АХ [18]. В наших же экспериментах какого-либо изменения интегрального кальция обнаружено не было ни при аппликации АТФ, ни при добавлении капсаицина. Исходя из эти данных, можно предположить, что эффекты активации TRPV1-рецепторов обусловлены увеличением базового уровня кальция, а не кальция, входящего при стимуляции двигательного нерва. Входящий через TRPV1-каналы кальций, в свою очередь, может приводить к активации кальций-зависимых белков, таких как кальмодулин и кальцинейрин, которые, как было установлено ранее, участвуют в механизмах снижения уровня выделения АХ [21, 32, 33]. В то же время подавляющий нейротрансмиссию эффект АТФ можно объяснить активацией метаботропных P2Y-рецепторов, которые, по-видимому, не вносят значительного вклада в изменение входа Са²⁺ через потенциал-чувствительные кальциевые каналы и выделение Са²⁺ из депо. При этом имеет место активация той же конечной мишени, регулирующей процесс экзоцитоза синаптических везикул, что и при активации TRPV1-каналов. И в данном случае, в качестве такой мишени может выступать кальмодулин, поскольку показано, что при ингибировании этого белка опосредованный активацией P2Y-рецепторов угнетающий эффект АТФ на выделение АХ полностью отсутствует [20].

Возможное физиологическое значение механизмов регуляции, запускаемых при активации пуриновых и ваниллоидных рецепторов, наиболее вероятно заключается в модуляции процесса нейросекреции АХ по принципу обратной отрицательной связи. Поскольку при квантовом выделении АХ в синаптической щели увеличивается концентрация как АТФ [8], так и протонов [34], то увеличивается и вероятность активации как пуринорецепторов, так и TRPV-каналов. Как следствие этого – снижение уровня выделения последующих порций медиатора. Кроме того, недавно было установлено, что TRPV1-рецепторы участвуют в реализации симпатической регуляции выброса АХ в периферических нервных окончаниях мыши [35].

Таким образом, в нервно-мышечном синапсе млекопитающих, наряду с ранее установленным пуринергическим путем регуляции АХ, имеет место и механизм модуляции нейросекреции, опосредованный активацией TRPV1-каналов. Запуск этих механизмов приводит к угнетению процессов как спонтанного, так и вызванного выделения квантов АХ из двигательного нервного окончания. При этом продемонстрировано, что оба этих механизма регуляции не сопровождаются изменением Ca²⁺-транзиента в нервном окончании и имеют общее звено. На роль такого звена может претендовать белок кальмодулин, однако это еще необходимо проверить экспериментально в будущем.