Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2021, T. 107, № 4-5, стр. 641-646

ВВЕДЕНИЕ

Ацетилирование гистонов играет важную роль в эпигенетической регуляции синаптической пластичности и памяти у беспозвоночных и позвоночных животных [1, 2]. На ацетилирование гистонов оказывают влияние две группы ферментов – гистонацетилтрансферазы и гистондеацетилазы. В литературе последних лет накопилось много данных о важной роли баланса гистонацетилтрансфераз и гистондеацетилаз, изменения которого могут как нарушать, так и улучшать синаптическую пластичность, память и процессы обучения у взрослых животных [3]. Для изучения роли ацетилирования гистонов в регуляции синаптической пластичности эффективно применение ингибиторов гистондеацетилаз [4, 5], приводящих к усилению ацетилирования гистонов. В ряде работ, посвященных влиянию различных ингибиторов гистондеацетилаз на формирование долговременной синаптической пластичности показано, что ингибитор гистондеацетилаз класса I бутират натрия влияет на долговременные изменения эффективности синаптической передачи на клеточных и поведенческих моделях [6–10]. Было показано, что ингибирование деацетилирования гистонов может приводить к усилению формирования долговременных синаптических изменений и улучшению памяти у беспозвоночных животных [7, 8, 11]. Также получены данные о том, что аппликация бутирата натрия приводит к усилению долговременной потенциации на срезах гиппокампа крыс [6]. Однако влияние ингибирования гистондеацетилаз на формирование долговременной потенциации у виноградной улитки – важного модельного объекта в нейробиологических исследованиях, ранее не было изучено в электрофизиологических экспериментах. В данной работе с помощью ингибитора гистондеацетилаз бутирата натрия исследовалось влияние ацетилирования гистонов на формирование долговременной потенциации у виноградной улитки.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на улитках Helix lucorum taurica L. массой 20–30 г. За 1–2 нед. до эксперимента улиток помещали во влажную среду, где они находились в активном состоянии. Протокол экспериментов утвержден Этической комиссией Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Электрофизиологические эксперименты проводили на изолированной ЦНС улиток. Препарирование и идентификацию нейронов осуществляли по стандартной методике [12]. Перед началом препарирования производили инъекцию холодного изотонического раствора MgCl₂ для обездвиживания и обезболивания животного. Изолированную ЦНС помещали в физиологический раствор Рингера (мМ): 100 NaCl, 4 KCl, 7 CaCl₂, 5 MgCl₂, 10 Trizma, pH 7.6.

Внутриклеточную регистрацию активности премоторных (командных) интернейронов париетальных ганглиев (Pa3 и Pa2) проводили при помощи острых стеклянных микроэлектродов, заполненных ацетатом калия (2 M), сопротивлением 20–30 МОм. Регистрировали возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП), вызванные электрической стимуляцией интестинального нерва, не содержащего отростков регистрируемых нейронов. В каждом эксперименте амплитуду стимула подбирали таким образом, чтобы стимуляция вызывала не потенциалы действия, а ВПСП амплитудой 5–15 мВ.

В начале записи проводили 5 тестовых стимуляций с интервалом между стимулами 10 мин, затем осуществляли тетанизацию интестинального нерва (пачка стимулов частотой 10 Гц, длительность пачки 10 с, 10-кратное увеличение амплитуды тестового стимула). Всего тетанизацию осуществляли 5 раз с интервалом 5 мин. Перед каждой тетанизацией в экспериментальную ванночку добавляли серотонин (10⁻⁵ M), который отмывали через 2 мин после тетанизации. После пятой тетанизации продолжали тестирующую стимуляцию интестинального нерва с исходной амплитудой стимула каждые 10 мин в течение нескольких часов.

Первые 50 мин записи перфузионная система находилась в замкнутом режиме вплоть до момента первой тетанизации. В двух сериях экспериментов с ингибитором гистондеацетилаз в этот временной период в экспериментальной ванночке находился бутират натрия в концентрации 60 мкМ. После первой тетанизации (и первой аппликации серотонина) производился интенсивный “отмыв” препарата, который полностью удалял бутират из ванночки. После последней тетанизации система перфузии переводилась в разомкнутое состояние (отмыв), при этом скорость протока составляла 0.2 мл/мин при объеме ванночки 3 мл.

Достоверность изменений амплитуды синаптических потенциалов оценивали по статистическому критерию Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ритмическая тестирующая стимуляция интестинального нерва с частотой 1 стимул в 10 мин приводила в течение нескольких часов к постепенному уменьшению амплитуд ВПСП в командных нейронах – феномен, хорошо описанный для данного препарата [12] и вызванный, скорее всего, гомосинаптической депрессией (привыканием) (рис. 1, заполненные треугольники). Для статистического анализа изменений амплитуд ответов мы выделили два временных окна в записи: 120–170 мин после первой тетанизации (это временное окно далее в тексте называется “2 ч после тетанизации”) и 210–260 мин после тетанизации (этот период в тексте будет обозначаться как “4 ч после тетанизации”). Пятикратная тетанизирующая стимуляция, совмещенная с аппликацией серотонина, вызывала выраженный рост амплитуд ВПСП (рис. 1, заполненные кружки). Так, через 2 ч после тетанизации усредненная амплитуда ВПСП составляла 101.8 ± 8.8% от исходной (n = 12), в то время как в контрольных экспериментах эффект ослабления ответа приводил к тому, что в той же временной точке амплитуда ВПСП составляла в среднем 48.1 ± 4.1%, n = 21 (p < 0.001). Через 4 ч после тетанизации амплитуда ВПСП тетанизированных входов также превышала средние амплитуды ответов в контрольной группе (71.7 ± 11.8%, n = 12 и 38.3 ± 4.1%, n = 21, p < 0.05). Ингибирование гистондеацетилаз путем добавления бутирата в экспериментальную ванночку за 1 ч до тетанизации приводило к достоверному увеличению амплитуды синаптической потенциации, вызванной сочетанным применением тетанизации нерва и аппликации серотонина (рис. 1, пустые кружки). Через 2 ч после тетанизации средняя амплитуда ВПСП в группе с бутиратом составляла 220.8 ± 59.4% (n = 14) и была достоверно выше средних амплитуд ВПСП в группе тетанизации без бутирата (101.8 ± 8.8%, n = 12, p < 0.01). Через 4 ч после тетанизации амплитуда ответов в группе с бутиратом была также выше, чем в группе тетанизации без бутирата натрия (151 ± 38.7, n = 14 и 71.7 ± 11.8%, n = 12, p < 0.05), что говорит о долговременности эффекта.

Рис. 1.

Влияние бутирата натрия на формирование долговременной потенциации амплитуды комплексного ВПСП в премоторных (командных) гигантских нейронах париетальных ганглиев виноградной улитки, вызванной тетанизацией синаптического входа. Амплитуда ВПСП при первой тестовой стимуляции была принята за единицу. Серыми прямоугольниками обозначено время, когда бутират натрия присутствовал в экспериментальной ванночке и эпохи усреднения ВПСП, использованные для статистического анализа, и обозначаемые в тексте как “2 ч после тетанизации” и “4 ч после тетанизации”. На графике представлены средние значения ± SEM.

Для выяснения возможного влияния бутирата натрия на амплитуду ВПСП в командных нейронах была поставлена специальная контрольная серия экспериментов, в которых бутират также присутствовал в экспериментальной ванночке первые 50 мин записи, после которых препарат интенсивно отмывался и система перфузии переводилась в открытый режим, как и в остальных сериях экспериментов, но тетанизации при этом не проводилось. Выяснилось, что само по себе добавление бутирата не вызывало изменения амплитуды ВПСП во временном окне “2 ч после тетанизации”. Средняя амплитуда ответов в этот временной период составляла 48.1 ± 4.1%, n = 21 в контроле и 56.8 ± 6.1, n =1 1, для группы “контроль с бутиратом”. Однако через 4 ч в группе “контроль с бутиратом” начинался небольшой, но достоверный рост амплитуды ВПСП. Так, в группе “контроль без бутирата” средняя амплитуда ВПСП в эпоху анализа “4 ч после тетанизации” составляла 38.3 ± 4.1%, n = 21, в то время как в группе “контроль с бутиратом” усредненная амплитуда синаптических ответов была достоверно выше и равнялась 60.4 ± 9.5%, n = 14, p < 0.05.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Прежде всего необходимо отметить, что исследованные в настоящей работе синаптические входы и идентифицированные нейроны прямо относятся к сети оборонительного поведения виноградной улитки. Роль гигантских FMRFamid-содержащих нейронов париетальных ганглиев хорошо описана [13], поэтому изменение эффективности синаптических входов к данным нейронам имеет прямое функциональное значение для регуляции оборонительного поведения животного.

На поведенческом уровне на этом животном проделана большая работа по выяснению возможности влияния двух различных ингибиторов гистондеацетилаз (бутирата натрия и трихостатина А) на оборонительное поведение и показаны достоверные эффекты увеличения величины оборонительных реакций улитки не только во время реконсолидации обстановочной памяти, но и восстановление памяти при ее нарушении двумя разными способами [2]. Существенным является тот факт, что введение ингибиторов гистондеацетилаз в этой работе без тестирования (реактивации) памяти не приводило к выраженным поведенческим эффектам при тестировании в течение нескольких дней, что предполагает регулирующее влияние ингибиторов гистондеацетилаз именно на молекулярную систему формирования и поддержания памяти. В настоящей работе эффекты ингибитора гистондеацетилаз без потенциации наблюдались только через несколько часов и были сравнительно слабо выраженными.

Полученные данные можно интерпретировать как нейросетевое объяснение поведенческих результатов на этих животных. С точки зрения возможной роли эпигенетических процессов в регуляции пластичности и памяти, можно сказать, что не только интибиторы гистондеацетилаз, но и другие регулирующие факторы координированно влияют на уровень экспрессии генов. По-видимому, влияние этих факторов без сильных внешних стимулов (потенциация, подкрепление при обучении и т.д.) заторможено специальными системами “молекулярных тормозов” и только в условиях сильных внешних воздействий эпигенетическими регуляторами открывается “окно возможностей” для долговременных изменений [3]. Существенно отметить, что деацетилирование гистонов приводит к изменениям плотности упаковки хроматина, которые большей частью обратимы, и по сути только открывают возможность (“окно”) для долговременных изменений экспрессии генов, которые в основном осуществляются путем метилирования ДНК [3, 14]. Полученные в настоящей работе данные позволяют считать, что обратимые посттрансляционные модификации гистонов служат основой для пластических изменений в функциональных сетях нейронов. В то же время именно метилирование ДНК и метил-зависимые способы регуляции трехмерной организации хроматина могут служить стабильной молекулярной основой для долговременного хранения пластических изменений и памяти [3, 14].