Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2021, T. 107, № 6-7, стр. 785-809

1. ВАРИАНТЫ НАСЛЕДСТВЕННЫХ МИОПАТИЙ И ИХ ДИАГНОСТИКА

Наследственные миопатии определяются как клинически и генетически гетерогенные заболевания скелетной мускулатуры, которые обычно проявляются в раннем детском возрасте в виде мышечной слабости и гипотонии, медленно прогрессирующими с течением времени [6]. Как правило, это редкие заболевания (встречаются у одного из 10 000–20 000 детей [7]), однако в некоторых случаях частота заболевания может достигать 1 : 500 и 1 : 40, как это происходит соответственно в субэтнических группах Амишей с делецией в гене тропонина Т1, вызывающей делецию Glu180 [8], и Ашкеназы с делецией экзона 55 в гене небулина [9], приводящих к немалиновой миопатии.

Понятие наследственной миопатии (congenital myopathy) было введено в 1950-е годы для описания группы скелетных мышечных заболеваний, характеризующихся слабостью мышц [10]. Морфологические изменения в мышечных волокнах в виде нерегулярно расположенных нитеобразных фрагментов были впервые обнаружены при описании немалиновой миопатии (“нема” – от греческого слова нить, [11]). Позже выяснилось, что генетической причиной являлась точечная мутация в гене α-актина [12]. В настоящее время известны мутации в 32-х генах, связанные с развитием различных вариантов наследственной миопатии; количество генетических причин стремительно увеличивается (см. обзор [5]). Назрела явная необходимость разработки четких критериев классификации мутаций и диагностики вариантов миопатий.

Согласно современной классификации, выделяют несколько форм наследственной миопатии: немалиновую, центроядерную, CFTD, стержневую и миопатию с накоплением миозина [5]. Де-факто ряд миопатий включает в себя также кэп-миопатию, ядерно-стержневую болезнь, миопатию зебра-тел, болезнь центрального стержня, мультиминистержневую миопатию, миотубулярную миопатию, дистальный артрогрипоз (иногда рассматриваемый именно как миопатия), актиновую миопатию, миопатию внутриядерного стержня, дистальную миопатию, миофибриллярную миопатию и некоторые другие менее известные заболевания, относимые авторами к разным общим патологическим вариантам. Терминология в клинической практике России пока не устоялась, и перевод названий заболеваний с английского языка на русский в разных источниках зачастую является весьма произвольным. Варианты наследственных миопатий (табл. 1) регистрируются в международном реестре больных с мышечными заболеваниями (CMDIR, см. сайт cmdir.org), в котором также можно получить информацию о проходящих клинических исследованиях.

Современные методы диагностики предполагают прохождение генетического тестирования сразу после составления истории болезни пациента и первичного диагностического обследования. Знание генетической причины заболевания позволяет в некоторой степени спрогнозировать развитие клинических симптомов, как это происходит в случае актинопатий, миозинопатий и рианодин-рецептор-связанных миопатий [5]. Однако в основном такой подход оказывается неэффективным, поскольку обнаружено, что генетические причины одного и того же варианта наследственной миопатии неоднородны. Широкий спектр генетических дефектов может являться причиной схожих клинических фенотипов. Например, причиной немалиновой миопатии могут быть мутации в генах скелетного актина, β- и γ-тропомиозинов, тропонина Т, небулина, кофилина-2, и Келч-подобного и BTB(POZ)-домен-содержащего белка 13, что предполагает единый патологический механизм нарушения функционирования тонких нитей саркомера. Также одна и та же генетическая мутация может быть связана с несколькими различными заболеваниями скелетных мышц или с неуточненным вариантом миопатии [14–16].

Одним из наиболее информативных способов диагностики является гистологический анализ биоптата мышечной ткани и обнаружение ультраструктурных особенностей. Результаты биопсии скелетных мышц, пораженных при наследственной миопатии, показывают различные гистологические изменения, включая немалиновые тельца, кэп-структуры, различные стержни, волокна с центральными ядрами, гипотрофию волокон с определенным процентом диспропорции, области фокального уменьшения окислительного окрашивания (“cores”), жировую инфильтрацию, и другие аномалии. Внутриклеточные включения отличаются по локализации внутри саркомера и по своему составу. Так, немалиновые тельца представляют собой четкие палочковидные включения в саркоплазме, состоящие из актина, миотилина, небулина, тропомиозина, γ-филамина, кофилина, телетонина и α-актинина [17]. Кэп-структуры – четко очерченные шапочковидные включения непосредственно под сарколеммой мышечного волокна, в состав которых входит актин, миотилин, кластеры небулина и десмина, тропомиозин, тропонин Т и SERCA [18]. В некоторых случаях определение типа внутриклеточных включений в мышечной биопсии вызывает противоречия между авторами [19]. Гистологические критерии пересекаются друг с другом. Признак CFTD – гипотрофия волокон 1 типа – часто встречается у пациентов с немалиновой миопатией и кэп-миопатией [17]. Тем не менее, в клинической практике CFTD выделяют в отдельную группу заболеваний. Описаны случаи обнаружения в саркомере как немалиновых телец, так и кэп-структур одновременно [20]. Видимо, по этой причине кэп-миопатию зачастую рассматривают как подтип немалиновой миопатии [3, 5, 17].

Молекулярные механизмы появления аномальных белковых агрегатов в саркомере остаются все еще неизвестными. Есть основания предполагать, что изменения в структуре мышечных волокон вызваны некими компенсаторными процессами в мышечном волокне, которые запускаются вследствие изменения структурных и функциональных свойств мышечных белков. Это предположение подтверждается фактом, что внутриклеточные включения появляются в мышечном волокне после развития других клинических доказательств заболевания. Возможно, мутантные актин-связывающие белки покидают тонкие нити и инициируют образование белковых агрегатов – немалиновых телец, кэп-структур, стержней, а также изменения структуры саркомера. Также высказано предположение, что возникновение немалиновых телец может быть последствием метаболического стресса вследствие истощения запасов АТФ.

Таким образом, границы между различными миопатиями весьма условны, а разработанные критерии недостаточны для точной диагностики варианта миопатии. Классификация мутаций и диагностика варианта миопатии затруднена ввиду неоднородности генетических и клинических критериев заболеваний и перекрывания этих критериев внутри самой группы наследственных миопатий и за ее пределами с нейромышечными заболеваниями, а также противоречивостью гистологического анализа образцов биопсии мышечной ткани пациентов. Вместе с тем, постановка правильного диагноза критически важна для возможности прогнозирования заболевания и для принятия решения о стратегии лечения. По-видимому, идеальная система диагностики должна быть основана не только на генетических, гистопатологических и клинических признаках, но и на информации о первичных нарушениях сократительной функции саркомера вследствие мутаций на молекулярном уровне.

Следует отметить, что до сих пор не выявлены те характерные особенности, которые лежат в основе патогенеза различных вариантов наследственной миопатии. Согласно современным представлениям, сократительная функция скелетных мышц при наследственных миопатиях может нарушаться в результате дисфункции белков саркомера, таких как актин, тропомиозин, небулин, тропонин T, тропонин И, миозин (тяжелые и легкие цепи), кофилин, миопалладин, лейомодин, динамин и некоторых других, и последующих компенсаторных процессов в мышцах. Действительно, ряд мутантных мышечных белков принимает непосредственное участие в поддержании структуры саркомера и мышечном сокращении. Вследствие мутаций в генах этих белков либо происходит неправильная сборка актиновой нити, либо расстраивается динамическое взаимодействие миозиновых и актиновых нитей друг с другом. Функция других же мутантных белков связана с регуляцией уровня Ca²⁺ в саркоплазматическом ретикулуме и клеточным ответом на окислительный стресс.

При изучении молекулярных механизмов мышечной дисфункции было обнаружено, что мутации в тропомиозине, тропонине и других компонентах саркомера могут приводить к изменению чувствительности сократительной системы к концентрации ионов Са²⁺ и развитию первичной миопатии. Некоторые из известных миопатий на ранних стадиях развития демонстрируют ослабление сократительной способности и уменьшение чувствительности мышечных волокон к ионам Са²⁺ (гипосократительный фенотип) [21]. Другие миопатии сопровождаются усилением сократимости мышечной ткани и повышением ее чувствительности к ионам Са²⁺ (гиперсократительный фенотип). Таким образом, одним из критериев классификации мутаций на молекулярном уровне может являться изменение Са²⁺-чувствительности тонких нитей саркомера. Причиной увеличения Са²⁺-чувствительности тонкой нити может являться либо изменение взаимодействия между миозином и актином, либо нарушение передачи Са²⁺-сигнала с тропонин-тропомиозинового комплекса на актин. В обоих случаях миозиновые головки в некоторой степени теряют способность “выключать” актиновые мономеры в условиях деактивации (т.е. переводить мономеры в конформационное состояние, при котором они больше не активируют АТФазу миозина). Очевидно, что нельзя рассматривать изменение Са²⁺-чувствительности в качестве единственного критерия для классификации мутаций.

Другими словами, необходимо описать весь патологический механизм действия мутации, что позволит не только классифицировать мутации, но и определить мишени для терапевтического воздействия. В случае, если при изменении Са²⁺-чувствительности нарушена функция тропонина, мишенью для восстановления сократимости может служить именно механизм активации тропонина. Так, например, эффективность использования активатора тропонина CK-2066260 в скелетных мышцах была успешно показана в мышечных волокнах модельных мышей с немалиновой миопатией, связанной с мутациями гена небулина [22]. Нецелесообразно будет использовать активатор тропонина, если поломка не затрагивает функцию тропонина активировать актиновые нити, как это происходит при некоторых мутациях гена тропомиозина.

2. МУТАЦИИ В ГЕНАХ ТРОПОМИОЗИНА ПРИ МИОПАТИЯХ

Тропомиозин в комплексе с тропонином играет ключевую роль в регуляции сокращения поперечнополосатых мышц, связанной с тонкими нитями, запуская генерацию силы и, что не менее важно, обеспечивая расслабление мышцы [23]. В основе этой регуляции лежит как стерическое закрытие и открытие сайтов связывания миозина на актине Са²⁺-зависимым образом [24], так и аллостерические механизмы – конформационные перестройки актина, тропомиозина и тропонина [25]. Тропонин служит сенсором концентрации Са²⁺ в саркоплазме, тогда как передачу Са²⁺-активирующего сигнала на актиновые нити обеспечивают димеры тропомиозина, которые связываются друг с другом по принципу “голова к хвосту” и обвиваются вокруг Ф-актина с двух сторон в виде длинных тяжей. Динамическое смещение тропомиозина относительно сайтов связывания миозина на актине от внешних к внутренним доменам актиновых мономеров в тонкой нити возможно благодаря электростатической природе взаимодействия и гибкости актина и тропомиозина. Гибкость и персистентная длина актина и тропомиозина изменяются во время генерации силы, вызывая азимутальный сдвиг тяжей тропомиозина [26, 27]. Считается, что тропомиозин может занимать три равновесных позиции на актине – блокирующую, закрытую и открытую [28]. При низких концентрациях Ca²⁺ мономеры актина переходят в выключенное состояние, в котором они не способны активировать АТФазу миозина. Тропомиозин находится у внешних доменов актина в позиции, блокирующей связывание миозина. Блокирующая позиция тропомиозина считается энергетически наиболее выгодной, поскольку обусловлена минимальным значением энергии электростатического взаимодействия, что позволяет установлению между тропомиозином и актином наибольшего количества электростатических взаимодействий (около 30, [29]). Повышение концентрации Ca²⁺ в саркоплазме вызывает изменение конформации тропонина и запускает каскад конформационных перестроек, приводящих к уменьшению персистентной длины актина и увеличению персистентной длины тропомиозина, изменению пространственного расположения тропомиозина, “включению” актиновых мономеров (переходу в состояние, при котором актин активирует гидролиз АТФ в миозине) и взаимодействию миозина с актином, сначала слабому, а затем сильному, стереоспецифическому. Тропомиозин смещается при активации нити от внешних доменов актина к внутренним. Включенные мономеры актина стимулируют высвобождение АДФ и неорганического фосфата из активного центра миозина, значительные конформационные перестройки в миозине и генерацию силы. Связывание АТФ с миозином ослабляет взаимодействие миозина с актином, обеспечивая расслабление. Тропомиозин возвращается в блокирующую позицию, ингибирует связывание миозина с актином, и цикл возобновляется.

В разных типах мышц тропомиозин представлен несколькими изоформами. В геноме человека 4 различных гена TPM1, TPM2, TPM3 и TPM4 отвечают за экспрессию тропомиозинов α, β, γ и δ соответственно. Очевидно, что в сердечной мышце доминирует α-изоформа тропомиозина. В медленных скелетных мышцах (типа 1) тропомиозин присутствует в виде γβ-гетеродимеров и γγ-гомодимеров. В быстрых скелетных мышцах (типа 2) экспрессируются α- и β-изоформы, формирующие αβ-гетеродимеры и αα-гомодимеры. Более высокий уровень экспрессии β-изоформы обнаружен в мышечных волокнах, обладающих высокой окислительной способностью (типа 1 и 2A), по сравнению с гликолитическими мышечными волокнами (типа 2B). Изоформа δ-тропомиозина в мышечной ткани экспрессируется слабо, и, вероятно, не входит в состав тонких нитей саркомера [30].

Структура тропомиозина хорошо изучена. Практически на всем своем протяжении каждая из субъединиц димера этого белка имеет α-спиральную структуру. Две субъединицы тропомиозина закручены в суперспираль благодаря повторяющейся последовательности аминокислотных остатков с неполярными (гидрофобными) и сильно заряженными остатками [31]. Гидрофобные аминокислотные остатки упакованы в гидрофобное ядро. Сильно заряженные поверхностные остатки участвуют в образовании солевых мостиков между двумя субъединицами димера, которые стабилизируют молекулу, а также взаимодействуют с белками-партнерами. Тропомиозин условно разделен на 7 областей псевдо-повторов, которые в свою очередь разделены на α- и β-области [32]. Считается, что 7 α-областей тропомиозина связываются с 7 мономерами актина. Структура тропомиозина, его гибкость и поверхностный заряд могут изменяться при аминокислотных заменах, делециях, дупликациях, обнаруженных при нескольких вариантах миопатии.

Идентифицировано несколько десятков мутаций в генах TPM2 и TPM3, кодирующих скелетный мышечный тропомиозин (табл. 2). Большинство мутаций, обнаруженных при миопатиях, приводит к заменам аминокислотных остатков в α-областях первых пяти псевдо-повторов тропомиозина. Известен целый ряд мутаций в тропомиозине, относимых сразу к нескольким различным мышечным заболеваниям или к не определенному варианту миопатии. Подавляющая часть мутаций тропомиозина все еще недостаточно охарактеризована.

3. КОНФОРМАЦИОННЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ БЕЛКОВ МЫШЕЧНОГО ВОЛОКНА, СОДЕРЖАЩЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ ТРОПОМИОЗИНА

Известно, что конформационные перестройки актин-миозинового комплекса играют ключевую роль в мышечном сокращении. С помощью метода поляризационной микрофлуориметрии в мышечном волокне показано, что в цикле гидролиза АТФ прослеживается типичная и повторяющаяся картина конформационных перестроек актина и миозина и изменения локализации тропомиозина. При сильном связывании миозина с актином в молекуле актина происходят характерные изменения конформации, сопровождаемые изменением расположения субдомена 1 актина и наклоном моторного домена миозина или по крайней мере SH1-спирали. При высокой концентрации Са²⁺ тропонин-тропомиозиновый комплекс увеличивает количество включенных мономеров актина, таким образом активируя образование сильного связывания головок миозина с актином. В противоположность этому, при низкой концентрации Са²⁺ тропонин и тропомиозин ингибируют сильное связывание миозина с актином, выключая мономеры актина. При моделировании ряда последовательных стадий АТФазного цикла оказалось, что изменения в ориентации и подвижности субдомена 1 актина и SH1-спирали миозина коррелируют между собой по характеру и степени выраженности. Согласованность этих изменений, очевидно, определяет эффективность работы актомиозинового мотора. Персистентная длина актина и тропомиозина изменяется во время генерации силы, как правило, противоположным образом [27, 47], что, вероятно, является одной из причин азимутального сдвига тяжей тропомиозина, который происходит при изменении концентрации Са²⁺ и генерации силы поперечными миозиновыми мостиками. Охарактеризованные конформационные перестройки актина, миозина и тропомиозина в АТФазном цикле свидетельствуют об аллостерической природе регуляторного процесса мышечного сокращения и могут быть использованы в качестве контрольных изменений для выяснения механизмов мышечной дисфункции в присутствии в мышечном волокне тропомиозина с дефектами, обнаруженными при наследственных миопатиях.

Мутантные формы β- и γ-тропомиозина, появляющиеся в мышцах при наследственной миопатии, способны изменять характер актин-миозинового взаимодействия в АТФазном цикле и локализацию тропомиозина на актине и вызывать первичные нарушения сократительной функции. Показано, что мутантные тропомиозины в той или иной мере сохраняют способность встраиваться в мышечное волокно (несмотря на сниженное сродство некоторых тропомиозинов к актину в растворе), ингибировать и активировать АТФазную активность актомиозина и передавать Са²⁺-сигнал с комплекса тропонина на актиновые нити. Оказалось, что мутантные формы тропомиозина, вызывающие повышение Са²⁺-чувствительности (Arg90Pro, Glu139del, Gln147Pro, Glu150Ala, Glu173Ala, Glu240Lys и Arg244Gly), обладают высокой гибкостью тропомиозинового тяжа. Высокая гибкость, по-видимому, затрудняет блокирование тропомиозином сайтов связывания миозина на актине, поскольку в таких случаях наблюдается “замораживание” тропомиозина ближе к открытой позиции (благоприятной для образования сильного связывания между актином и миозином). Действительно, в присутствии перечисленных замен количество головок миозина, сильно связанных с актином (поперечных миозиновых мостиков в конформациях, соответствующих стадиям АМ и АМ · ADP), существенно увеличивается при моделировании практически всех стадий АТФазного цикла. В присутствии мутантных форм тропомиозина Arg90Pro, Glu139del, Gln147Pro, Glu150Ala и Glu173Ala относительное количество включенных мономеров актина уменьшается при низких концентрациях Са²⁺ так же, как и для контрольного тропомиозина, т.е. мономеры актина выключаются тропонин-тропомиозиновым комплексом.

Некоторые мутации, которые повышают Са²⁺-чувствительность, при высоких концентрациях Са²⁺ снижают или не изменяют количество головок миозина в сильной форме связывания с актином, а при низких концентрациях Са²⁺ повышают количество таких головок (Glu139del, Gln147Pro, Ala155Thr, Lys168Glu). Кроме того, в присутствии замен Gln147Pro и Ala155Thr в тропомиозине происходит ингибирование способности тропонина выключать мономеры актина при низких концентрациях Са²⁺ [35, 50], что также может быть причиной появления высокой Са²⁺-чувствительности тонких нитей.

Реже мутантные формы тропомиозина уменьшают Са²⁺-чувствительность тонких нитей (замены Glu41Lys, Glu117Lys), или незначительно влияют на нее (замены Arg167His, Arg91Gly). Оказалось, что в присутствии Glu41Lys-мутантной формы β-тропомиозина, ассоциированной с немалиновой миопатией, типичным является увеличение количества сильно связанных с актином головок миозина при низких концентрациях Са²⁺ без заметного изменения количества таких головок при высоких концентрациях. Мутантный тропомиозин занимает позицию ближе к блокирующей, что приводит к ингибированию включения мономеров актина и образования сильной формы связывания между актином и миозином при высоких концентрациях Са²⁺ [57]. Замены Glu117Lys в β-тропомиозине и Arg167His в α- и γ-тропомиозинах вызывают похожий эффект [58, 59]. Интересно отметить, что в присутствии замены в соседнем аминокислотном остатке Lys168Glu появляется аномальное количество сильно связанных с актином головок миозина в цикле гидролиза АТФ [60]. Похожие патологические механизмы лежат в основе нарушения сократительной функции в присутствии замены Arg133Trp. Обнаружено, что при высоких концентрациях Ca²⁺ замена Arg133Trp в β-субъединице αβ-гетеродимера и ββ-гомодимера тропомиозина, идентифицированная при различных вариантах наследственной миопатии – CFTD, немалиновой миопатии и дистальном артрогрипозе – уменьшает относительное количество головок миозина, сильно связанных с Ф-актином, и деактивирует мономеры актина. Эта мутация также препятствует смещению тяжей тропомиозина в открытую позицию в тонких нитях и уменьшает эффективность работы миозиновых поперечных мостиков. При низких концентрациях Ca²⁺ количество головок миозина в сильно связанной с актином конформации также уменьшается по сравнению с контрольным тропомиозином, что может приводить к понижению чувствительности миофиламентов к Ca²⁺ в присутствии замены Arg133Trp.

Учитывая вышеизложенные данные о критических изменениях в структурных перестройках актина, миозина и тропомиозина, можно заключить, что в основе ослабления сократительной способности мышечной ткани, обнаруженной в мышечных волокнах, содержащих мутантные формы тропомиозина, могут лежать различные патологические механизмы. Данные, полученные методом поляризационной микрофлуориметрии, позволяют предположить, что критическое значение для определения характера развития дисфункции мышечной ткани имеет аномальное поведение тропомиозина в цикле гидролиза АТФ: “замораживание” мутантного тропомиозина недалеко от открытой позиции вызывает появление высокой Са²⁺-чувствительности тонких нитей, и наоборот, “фиксация” тропомиозина недалеко от выключенной позиции инициирует понижение Са²⁺-чувствительности нити. Дальнейший характер развития дисфункции мышечной ткани может зависеть от поведения поперечных миозиновых мостиков в цикле гидролиза АТФ. Например, появление аномально высокого количества поперечных миозиновых мостиков, находящихся в сильной форме связывания с актином, а также появление ригорных мостиков при моделировании расслабленного состояния мышечной ткани, может привести не только к падению сократительной способности мышечной ткани, но и к появлению разрывов миофибрилл и морфологических изменений мышечной ткани. Наоборот, уменьшение количества поперечных миозиновых мостиков будет вызывать ослабление сократительной функции без появления существенных нарушений морфологической картины в мышечной ткани.

Выявленные типичные изменения конформации белков, инициированные точечными мутациями тропомиозина, позволили разделить все исследованные мутации на группы, условно отнесенные к CFTD, немалиновой миопатии, кэп-миопатии и дистальному артрогрипозу [61]. Для CFTD (замены Arg90Pro и Glu173Ala в γ-тропомиозине) и дистального артрогрипоза (замена Arg91Gly в β-тропомиозине) было типичным “замораживание” тропомиозина в открытой позиции и резкое увеличение количества поперечных миозиновых мостиков, сильно связанных с актином и включенных мономеров актина. Немалиновая миопатия (замены Glu41Lys, Glu117Lys, Arg133Trp в β-тропомиозине и Arg167His в γ-тропомиозине) характеризовалась, наоборот, смещением тропомиозина и/или “замораживанием” тропомиозина в блокирующей позиции и резким уменьшением количества включенных мономеров актина и поперечных миозиновых мостиков в сильно-связанной конформации. При этом мутантные формы тропомиозина, ассоциированные с кэп-миопатией (делеция Glu139 и замена Gln147Pro в β-тропомиозине), не вызывали значительного ингибирования образования сильной формы связывания миозина с актином при высоких концентрациях Са²⁺. Здесь стоит отметить, что некоторые исследователи считают кэп-миопатию разновидностью немалиновой миопатии (см. обзор [5]) несмотря на то, что кэп-структуры и немалиновые тельца значительно отличаются по составу и локализации в саркомере. Результаты проведенной нами работы указывают на различия в механизмах проявления последствий этих мутаций в мышечной ткани. Действительно, механизмы развития немалиновой и кэп-миопатий близки друг к другу, и, по-видимому, только на молекулярном уровне можно объяснить тонкие различия в этих механизмах. Неудивительно, что в литературе периодически публикуются данные о спорных диагнозах, согласно которым авторы соотносят одну и ту же мутацию с различными вариантами миопатии [19, 62].

Таким образом, относительное количество головок миозина, способных образовывать с актином сильную, существенную для генерации усилия форму связывания можно использовать в качестве одного из важнейших диагностических критериев миопатии на молекулярном уровне. Согласно предложенному нами критерию, замену Glu150Ala в γ-тропомиозине (диагностирована при кэп-миопатии) следует отнести к мутациям, обнаруженным при CFTD, а замену Ala155Thr (диагностирована при немалиновой миопатии) и Lys168Glu (ассоциирована с CFTD) в γ-тропомиозине – к мутациям, обнаруженным при кэп-миопатии [35, 55, 61].

На основании полученных данных можно предложить возможные пути для реабилитации сократительной способности мышечной ткани для некоторых миопатий. Например, если замена Glu41Lys в β-тропомиозине вызывает уменьшение Са²⁺-чувствительности, которое, однако, сопровождается увеличением количества включенных мономеров актина при низкой концентрации Са²⁺, то использование реагентов, увеличивающих способность тропонина активировать включение мономеров, будет неприемлемым для лечения миопатии, ассоциированной с этой мутацией. Для таких мутаций (Glu41Lys, Glu117Lys, Arg133Trp) представляется целесообразным использовать агенты, активирующие работу миозина. Показано, что замена Arg90Pro в γ-тропомиозине, связанная с CFTD, вызывает увеличение Са²⁺-чувствительности тонкой нити, но эта мутация ингибирует способность тропонина включать мономеры актина при высоких концентрациях Ca²⁺. Поэтому использование агентов, которые ингибируют активацию мономеров актина при высоких концентрациях Ca²⁺, может быть недостаточным для лечения миопатии, связанной с этой мутацией, и необходимо использовать ингибиторы миозина. Использование ингибиторов тропонина является также неадекватным подходом в лечении тех миопатий, при которых обнаруживается появление высокой Ca²⁺-чувствительности тонкой нити, если мутация не препятствует способности тропонина выключать мономеры актина при низких концентрациях Ca²⁺ (мутации Glu139del, Lys168Glu).

4. ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Если для лечения кардиомиопатий предложен целый ряд лекарственных препаратов, которые уже применяются или находятся на разных стадиях клинических испытаний (исследования Cytokinetics, MyoKardia, Novartis), то для наследственных миопатий до сих пор не существует этиотропного лечения. Не существует никаких терапевтических подходов к устранению мышечной слабости и восстановлению сократительной функции скелетных мышц на молекулярном уровне кроме симптоматической терапии, которой явно недостаточно для поддержания нормального качества жизни пациентов. К настоящему времени опубликовано чрезвычайно мало работ, посвященных молекулярным механизмам восстановления сократительной функции сердечной мышцы, и практически отсутствуют исследования, посвященные молекулярным механизмам действия потенциальных лекарственных препаратов при наследственных миопатиях. Для лечения заболеваний скелетных мышц требуется найти и охарактеризовать такие химические соединения, которые обладают потенциалом восстановления работы сократительной системы и не оказывают существенного влияния на сократимость сердечной мышцы. Обзор литературных данных привел нас к обнаружению двух основных групп потенциальных лекарственных препаратов, нацеленных на этиотропное лечение наследственных миопатий (табл. 3). Это так называемая группа активаторов быстрого скелетного тропонина (FSTA – fast skeletal troponin activators) и группа ингибиторов быстрого скелетного миозина. Яркими перспективными примерами группы FSTA являются релдесемтив (CK-2127107) и тирасемтив (CK-2017357), разрабатываемые компанией Cytokinetics Inc. в сотрудничестве с компанией Astellas, которые проходят клинические испытания для лечения бокового амиотрофического склероза и некоторых других заболеваний, связанных с мышечной слабостью и/или усталостью скелетных мышц [63–65]. Связываясь с тропонином, релдесемтив и тирасемтив замедляют скорость освобождения Ca²⁺, что повышает чувствительность саркомера к Ca²⁺ и способствует активации миозина и увеличению сократительной способности скелетных мышц. Перспективным ингибитором миозина для лечения миопатий, сопровождающихся мышечными контрактурами и ингибированием мышечного расслабления, является BTS, специфичный к миозину быстрых скелетных мышц [66, 67]. Было показано, что BTS снижает скорость АТФазной активности миозина, скорость освобождения фосфата из активного центра и скорость диссоциации от актина головок миозина, связанных с АДФ. Как результат, это соединение может препятствовать развитию контрактур. Предполагается, что BTS не влияет на связывание ионов кальция к тропонину и последующее за ним смещение тропомиозина на актине.

Некоторые соединения не обладают специфичностью связывания к изоформам скелетных мышечных белков, как, например, аналоги блеббистатина и BDM, ингибитор тропонина W7, активатор тропонина бепридил, а также активаторы миозина EMD 57033 и омекамтив мекарбила [73, 74, 81], которые способны связываться также с сердечным миозином. В виду перспективности их применения они могут быть усовершенствованы для получения аналогов, специфичных к скелетному мышечному миозину. Бепридил и W7 обратимо связываются с тропонином С в различных сайтах, изменяя его конформацию и чувствительность тонких нитей к ионам кальция [75, 77]. Действие активатора миозина EMD 57033 также реализуется посредством связывания с тропонином С, однако при этом он не влияет на связывание Са²⁺ с тропонином, а действует, как возможно предположить, путем смещения тропомиозина к внутренним доменам актина, активации сильного связывания миозина с актином и укорочения саркомера [79].

Объем знаний о механизмах действия представленных в табл. 3 соединений различный, однако несомненно, что данных о молекулярных механизмах их действия в сократительной системе саркомера скелетных мышц недостаточно. Опубликовано всего несколько работ, в которых проведено тестирование этих соединений для коррекции сократительной функции. Цель подобных исследований состоит в создании научной основы для разработки дифференциальных терапевтических подходов, направленных на восстановление сократимости.

Так, проведено исследование влияния активатора тропонина CK-1909178 и активатора миозина EMD 57033 на параметры Са²⁺-чувствительности и генерации силы в одиночных демебранизированных мышечных волокнах, полученных путем биопсии у пациентов, несущих мутации TPM2-null, TPM3-Arg167His или TPM2-Glu181Lys, связанных с немалиновой миопатией [71]. Было обнаружено, что активаторы CK-1909178 и EMD 57033 увеличивают Са²⁺-чувствительность мышечного сокращения при мутациях TPM2-null и TPM3-Arg167His. Также в одной работе доктора Д. Ochala было выполнено изучение влияния активатора миозина EMD 57033 на параметры Са²⁺-чувствительности и генерации силы при мутации TPM2-Glu41Lys [82], также связанной с немалиновой миопатией.

Показана потенциальная эффективность активатора тропонина CK-2066260 для лечения немалиновой миопатии, связанной с мутациями гена небулина [68]. Было обнаружено, что CK-2066260 значительно повышает Ca²⁺-чувствительность генерации силы, но не влияет на кооперативность активации тонких нитей. Используя в качестве модели немалиновой миопатии мышей с нокаутом гена небулина, приводящим к выраженной скелетной мышечной слабости, было обнаружено, что CK-2066260 сдвигает кривую зависимости мышечной силы от рСа влево, с наибольшим увеличением силы при низких и средних концентрациях Са²⁺, увеличивает силу сокращения при рСа 6.0 и значительно увеличивает константу скорости развития силы при быстром укорочении мышцы [22].

Немногочисленность научных групп, изучающих молекулярные механизмы восстановления сократительной функции скелетных мышц, объясняется прежде всего тем, что большинство исследований посвящены изучению действия потенциальных лекарственных препаратов на функцию сердечной мышцы [83–85]. Ряд исследований инициируется Центром преклинических исследований компании Cytokinetics. В перспективе научных исследований необходимо выявить и охарактеризовать неизвестные до настоящего времени конформационные изменения сократительных и регуляторных белков, происходящие при использовании агентов, обладающих потенциальной способностью восстановления сократимости мышечной ткани, ассоциированной с наследственными заболеваниями скелетных мышц человека. В частности, важно получить информацию о конформационных изменениях тропомиозина, актина и миозина, происходящих в присутствии химических соединений (ингибиторов или активаторов работы тропонина и миозина), способных нормализовать Са²⁺-чувствительность и АТФазную активность миозина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поскольку наследственная миопатия проявляется, как правило, с самого рождения или в раннем детском возрасте, то своевременно начатое этиотропное лечение заболевания критически важно для предотвращения или замедления прогрессирования мышечной слабости и гипотонии, проявления компенсаторных процессов, в том числе в виде появления внутриклеточных включений, и дальнейших последствий нарушения сократительной функции, таких как дыхательная и сердечная недостаточность. Существует острая необходимость в изучении молекулярных механизмов дисфункции сократимости мышечной ткани, содержащей мутантные белки, и в подборе и тестировании химических агентов для реабилитации наследственных заболеваний скелетных мышц. Особенности функционирования сократительной системы в присутствии различных мутаций в тропомиозине можно использовать на пути к поиску адекватной классификации мутаций, способствующей ранней и точной диагностике варианта миопатии, и поиску мишеней для нормализации сократительной функции. Имеющиеся данные позволяют предполагать, что, используя в качестве мишени актин-миозиновое взаимодействие и систему тропонин-тропомиозиновой регуляции, можно с помощью активаторов и ингибиторов функции тропонина и миозина скорректировать аномальную работу сократительной системы при скелетно-мышечных патологиях. Содержание современной научной литературы в области миологии отражает стремление научного сообщества восполнить недостаток данных о молекулярных механизмах заболеваний скелетных мышц и их терапии. Дальнейшие исследования молекулярных механизмов мышечной дисфункции позволят получить приоритетные данные о возможностях реабилитации на молекулярном уровне сократительной функции скелетных мышц, нарушенной при наследственных миопатиях, отобрать и протестировать наиболее эффективные фармакологические агенты, способные отменить или частично скомпенсировать негативные последствия мутаций в генах тропомиозина и других белков, ответственных за развитие немалиновой миопатии, кэп-миопатии, CFTD, дистального артрогрипоза и других заболеваний скелетной мускулатуры человека.