Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 1, стр. 121-128

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена с использованием интактных и кастрированных крыс-самцов Вистар массой 180–200 г, которые содержались при режиме 12 ч – свет, 12 ч – темнота и температуре 22 ± 2°С. Подопытные животные были разделены на 7 групп по 10 особей. Двухстороннюю орхидэктомию выполняли за 12 дней до начала тестирования.

Аналог-агонист Гн-РГ сурфагон (синтезирован в НМИЦ кардиологии МЗ РФ) растворяли в физиологическом растворе NaCl и вводили внутрибрюшинно за 12 мин до начала опыта в дозах 0.004; 0.02; 0.01; 1.5; 15 и 150 мкг/кг. Контрольные группы получали эквивалентные объемы физиологического раствора.

Исследования проводили с 9 до 15 ч. Для определения порогов электрокожной болевой чувствительности крысам на основание хвоста накладывали пластинчатые электроды и наносили раздражение переменным электрическим током с помощью установки Shocker LE 100-26 (Panlab, Испания). Пороги болевых реакций у крыс регистрировали в мA с помощью цифрового мультиметра UT804 (Uni-Trend, КНР). На каждом животном проводили 2 испытания с интервалом 1 мин.

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, принципам Базельской декларации и рекомендациям Регионального этического комитета при Курском государственном медицинском университете (протокол № 3 от 16.11.2020).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием интегрированной среды разработки для языка R “RStudio Desktop 1.4.1717” (RStudio, PBC, США, https://www.rstudio.com). Полученные результаты представлены в виде диаграмм boxplot. Достоверность выявленных различий между двумя группами определяли с помощью U-критерия Манна–Уитни (пакет “coin”), тремя и более – критерия Краскела–Уоллиса с post hoc анализом Данна (пакет “dunn.test”). Различия считались статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сурфагон в использованных дозах оказывал существенное алгическое влияние на болевую чувствительность у крыс (рис. 1), выраженность которого зависела от дозы. При введении в дозе 0.004 мкг/кг пептид вызывал значительное снижение порогов как собственно болевых (напряжение хвоста, поворот головы к электродам), так и эмоционально-аффективных реакций (вращение, вокализация, кусание электродов) на 31–37% (р < 0.05).

Рис. 1.

Величина порогов болевых реакций у крыс в тесте электрокожного раздражения хвоста после внутрибрюшинного введения сурфагона (в мA). (a) – напряжение хвоста, (b) – повороты головы, (c) – вокализация, (d) – повороты тела, (e) – кусание электродов. Полужирная черта – медиана, ящик – межквартильный размах, усы – крайние значения вариационных рядов, полужирная точка – выброс. * – p < 0.05 в сравнении с контрольной группой (по критерию Краскела–Уоллиса с post hoc анализом Данна), ** – p < 0.01 в сравнении с контрольной группой (по критерию Краскела–Уоллиса с post hoc анализом Данна).

При повышении дозы препарата до 0.02 мкг/кг отмечалось ослабление его эффектов: снижение порогов реакции напряжения хвоста составляло в среднем 17% и не достигало достоверно значимых различий. При этом снижение порогов реакций поворота головы, вокализации и вращения на 21–27% (р < 0.05) имело менее выраженный характер, чем в предыдущей группе. Однако эмоционально-аффективная реакция кусания электродов имела самые низкие пороги среди всех подопытных групп.

Увеличение вводимой дозы сурфагона до 0.1 мкг/кг не вызывало значимых изменений исследованных показателей. При этом проявилась тенденция к повышению порогов проявления эмоционально-аффективных реакций на фоне снижения болевой чувствительности. Дальнейшее увеличение дозы пептида до 1.5 мкг/кг, как и в предыдущей подопытной группе, не вызывало достоверно значимых сдвигов.

В то же время у крыс, получавших сурфагон в дозе 15 мкг/кг, вновь проявилось алгическое действие, по выраженности сравнимое после введения пептида в минимальных дозах (на 27–36%, р < 0.05). Однако в наибольшей дозе – 150 мкг/кг, эффекты пептида вновь нивелировались.

Кастрация вызвала статистически достоверное повышение порогов большинства исследованных реакций на болевое раздражение на 25–33% (р < 0.05), кроме реакции поворота головы.

Эффекты пептида у кастрированных животных, как и у контрольных, имели алгическую направленность (рис. 2) с наибольшей выраженностью в наименьшей использованной дозе 0.004 мкг/кг, при которой пороги большинства реакций снижались на 23–30% (р < 0.05). При этом следует отметить отсутствие достоверно значимых изменений реакции поворота головы во всех подопытных группах кастрированных крыс. Увеличение вводимой дозы до 0.02 мкг/кг сопровождалось снижением эффектов пептида в отношении эмоционально-аффективных реакций вращения и кусания электродов при выраженном снижении порогов напряжения хвоста (на 38%, р < 0.05).

Рис. 2.

Величина порогов болевых реакций у кастрированных крыс в тесте электрокожного раздражения хвоста после внутрибрюшинного введения сурфагона (в мA). (a) – напряжение хвоста, (b) – повороты головы, (c) – вокализация, (d) – повороты тела, (e) – кусание электродов. Полужирная черта – медиана, ящик – межквартильный размах, усы – крайние значения вариационных рядов, полужирная точка – выброс. ORX – кастрация, х – p < 0.05–0.01 в сравнении с контрольными животными (по U-критерию Мана–Уитни). * – p < 0.05 в сравнении с контрольной группой кастрированных животных (по критерию Краскела–Уоллиса с post hoc анализом Данна). ** – p < 0.001 в сравнении с контрольной группой кастрированных животных (по критерию Краскела–Уоллиса с post hoc анализом Данна).

В подопытных группах, которым вводили сурфагон в дозах 0.1 и 1.5 мкг/кг, изменения всех исследованных реакций были слабовыраженными и не достигали достоверных различий.

Дальнейшее увеличение вводимой дозы сурфагона вновь сопровождалось проявлением его статистически значимых эффектов. Так, после введения сурфагона в дозе 15 мкг/кг наблюдалось снижение порогов реакции вращения (на 13%, р < 0.05), а в дозе 150 мкг/кг снижение порогов как спинальной реакции напряжения хвоста, так и супраспинальных эмоционально-аффективных проявлений в виде вокализации и вращения (на 13–25%, р < 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные в работе результаты показали алгическое действие сурфагона как у интактных, так и у кастрированных крыс, которое имело выраженный дозозависимый характер. Установленное наличие действия пептида в наименьших и наибольших использованных дозах при отсутствии в промежуточных является проявлением U-эффекта, характерного для регуляторных пептидов. Данный эффект связывают с активацией при различных дозах разных систем вторичных мессенджеров [8, 9] и, следовательно, с возможностью активации различных нервных структур.

Использованная модель боли при раздражении путем фиксации электродов на хвост позволяет в одном опыте оценить спинальные (сегментарные) и супраспинальные (надсегментарные) болевые реакции, тогда как при температурном воздействии подобные результаты можно получить только при использовании двух тестов – “горячая пластина” и “отдергивание хвоста” [10]. Механизмы реакции напряжения хвоста локализованы на спинальном (сегментарном) уровне, остальные проявления болевого поведения имеют супраспинальное происхождение [11]. В выполненном нами ранее исследовании сурфагон в аналогичном интервале доз в тесте “горячая пластина” оказывал у интактных мышей-самцов преимущественно анальгетическое действие [3]. В основе этих различий могут находиться данные о том, что механизмы формирования боли имеют ряд нейрохимических особенностей на сегментарном уровне в зависимости от вида раздражителя. Так, при температурном воздействии в передаче болевых импульсов на нейроны задних рогов спинного мозга принимают участие соматостатин, нейрокинин А и нейрокинин₂-рецепторы [12, 14]. При электрокожном раздражении происходит возбуждение механических ноцицепторов [13] и на спинальном уровне в болевой трансмиссии участвуют вещество Р и нейрокинин₁-рецепторы [12, 14]. Данные особенности сегментарных ноцицептивных механизмов могут являться основой различий эффектов сурфагона при электрокожном и температурном раздражении, а также свидетельствовать о наличии сложного пептидергического механизма болевой нейротрансмиссии на спинальном уровне. Согласно представлениям о континууме регуляторных пептидов как функционально-непрерывной совокупности [15], Гн-РГ может иметь иерархические взаимоотношения с участвующими в спинальной болевой нейротрансмиссии пептидами (соматостатин, вещество Р, нейрокинин А, кальцитонин-ген родственный пептид), а его аналоги-агонисты – влиять на данные процессы. Также необходимо учитывать, что входящая в структуру молекулы сурфагона аминокислота L-аргинин является источником оксида азота, который участвует в болевой нейротрансмиссии в спинном мозге [16].

При анализе полученных данных обращает внимание недостоверное ослабление спинального болевого рефлекса после введения сурфагона интактным животным в дозе 0.02 мкг/кг на фоне ярко выраженных эмоционально-аффективных реакций. Подобный характер действия пептида позволяет заключить, что механизмы их реализации находятся преимущественно на супраспинальном уровне и согласуется с описанной ранее активацией агрессивно-оборонительного поведения при неизбегаемом электроболевом раздражении [2] и анксиогенным действием сурфагона [1]. Отмеченное при этом усиление спинальных болевых рефлексов может проявляться как вследствие действия пептида непосредственно на сегментарном уровне, так и за счет ослабления нисходящих антиноцицептивных влияний из головного мозга. Известно, что в центральном сером веществе среднего мозга установлено связывание Гн-РГ и его аналогов со специфическими рецепторами [17, 18], поэтому изменение функционального состояния нейронов данной структуры может оказывать существенное влияние на болевые реакции. Кроме того, рецепторы к Гн-РГ локализованы в гиппокампе и миндалевидном комплексе [19] и связывание с ними может оказывать влияние на супраспинальные механизмы формирования боли.

Повышение порогов болевых реакций после кастрации во многом может быть связано с усилением активности серотонинергической системы [20], которая играет важную роль в активации сегментарных антиноцицептивных механизмов. О стероидонезависимом характере действия сурфагона свидетельствует сохранение направленности и выраженности его алгического действия после кастрации. Обращает внимание изменение болевых реакций после введения сурфагона в дозе 0.02 мкг/кг кастрированным животным (значительное повышение болевой чувствительности на фоне ослабления эмоционально-аффективных поведенческих реакций), противоположное эффекту пептида в данной дозе у интактных животных. Преобладание ослабления супраспинальных реакций отмечалось и после введения кастрированным крысам пептида в дозе 150 мкг/кг. Полученные на кастрированных животных данные показывают значение функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы в реализации эффектов сурфагона в отношении ноцицептивной чувствительности и вызванного болью поведения, а также свидетельствуют об участии пептида в данных процессах как на спинальном, так и супраспинальном уровнях. Следует отметить, что сурфагон у кастрированных мышей в тесте “горячая пластина” также оказывал алгическое действие [3].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, аналог-агонист Гн-РГ сурфагон при внутрибрюшинном введении в интервале доз от 0.004 до 150 мкг/кг оказывал у крыс алгическое действие и усиливал вызванное болью эмоционально-аффективное поведение в дозах 0.004; 0.02 и 150 мкг/кг в тесте электрокожного раздражения хвоста. У гонадэктомированных животных наблюдалось повышение большинства порогов болевых реакций. При введении пептида через 12 дней после кастрации направленность отмеченных у интактных животных эффектов сохранялась, что свидетельствует об их стрероидонезависимом характере. Полученные данные свидетельствуют о наличии как спинальных, так и супраспинальных механизмов алгического действия сурфагона при электроболевом раздражении у крыс.

Результаты проведенных исследований расширяют представления о физиологических эффектах регуляторных пептидов и их полифункциональности, а данные о повышении болевой чувствительности и усилении эмоционально-аффективных реакций на боль необходимо учитывать при клиническом применении аналогов-агонистов Гн-РГ.