Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 12, стр. 1655-1667

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили фрагменты жировой ткани околосердечной области крыс Вистар разного возраста: 1, 14 сут, 3–4 мес. (n = 20). При работе с животными соблюдали международные правила Европейского сообщества по гуманному обращению с экспериментальными животными. Исследование было одобрено Локальным этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 2/22 от 06.04.2022). Материал фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида в течение одних суток [16] и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме Pfm Rotary 3003 (PFM, Германия). На срезах проводили иммуногистохимические реакции для выявления трех нейральных маркеров. Ферментный маркер – белок тирозингидроксилазу (ТН) – использовали для идентификации катехоламинергических структур симпатической нервной системы. Белок PGP 9.5 применяли для выявления всех нервных аппаратов без учета их медиаторной принадлежности [17]. Для исследования тонких терминальных окончаний применяли синаптофизин (Syn) [18]. Для выявления белка PGP 9.5 использовали поликлональные кроличьи антитела в разведении 1 : 200 (Spring Bioscience, США); для выявления Syn применяли поликлональные кроличьи антитела в разведении производителя (MONOSAN, Нидерланды); для TH – поликлональные кроличьи антитела в разведении 1 : 1000 (Abcam, Великобритания). Первичные антитела в нужном разведении наносили на гистологические срезы после депарафинирования на 1 сут. В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора Reveal Polyvalent HRP/DAB Detection System kit (SpringBioscience, США). Негативный контроль для иммуногистохимических реакций проводили путем нанесения на срезы вместо первичных антител их разбавителя (Dako, Дания). Часть срезов окрашивали толуидиновым синим и гематоксилином-эозином. Анализ гистологических препаратов осуществляли с помощью микроскопа Leica DM 750 (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica ICC 50 (Leica, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гистологический анализ сердца новорожденных крыс (Р1) показал, что ЭЖТ еще не сформирована и отсутствует. В области расположения корней магистральных артериальных и венозных сосудов сердца и бронхов располагаются округлой формы “эпителиальные тельца” размерами 150–200 мкм в диаметре. Они тесно прилежат к стенкам перечисленных магистральных кровеносных сосудов и воздухоносных путей и по строению сходны с железистой тканью (рис. 1а). Тельце состоит из глобул, в состав которых входят 4–8 клеток округлой, овальной или полигональной формы. Клетки имеют центрально расположенное гиперхромное ядро с одним–двумя ядрышками и большой объем цитоплазмы, заполненной микровезикулярными органеллами, которые наиболее четко выявляются на препаратах, окрашенных толуидиновым синим (рис. 1b). Анализ материала показал, что именно из клеток этих телец в постнатальном онтогенезе развиваются презумптивные элементы: преадипоциты и зрелые адипоциты белой и бурой жировых тканей. Вокруг телец и внутри, между глобулами, видны тонкие прослойки слабо развитой интерстициальной ткани. Сосуды в тельцах, как правило, не выявляются.

Рис. 1.

Эпителиальные тельца новорожденной крысы в аортально-пульмональной области сердца. a – общий вид, b – строение тельца; c – нервное сплетение в тельце. 1 – эпителиальное тельце; 2 – артерия; 3 – вена; 4 – трахея. Иммуногистохимическая реакция на белок PGP 9.5 (a, b) и тирозингидроксилазу (c), докраска толуидиновым синим (a, b). Масштабный отрезок равен 200 мкм (а), 50 мкм (b, c).

Вблизи телец видны ганглии, нервные стволики, а внутри – сплетения из пучков немиелинизированных нервных волокон (рис. 1a, b).

Иммуногистохимическое исследование с применением антител к белку PGP 9.5 показало, что на серийных срезах ЭЖТ крыс ранних сроков постнатального развития (Р1–Р14) вокруг и внутри эпителиальных телец, соседних органов (сосудов, бронхов, пучков миокардиоцитов) постоянно встречаются PGP 9.5⁺ и ТН⁺ фрагменты нервных стволиков, пучков и сплетений, а также PGP 9.5⁺ микроганглии и группы хромаффинных клеток. Особенно бросается в глаза обилие катехоламинергических структур в паренхиме самих телец. Так, ТН⁺ пучки симпатических нервных волокон и их тончайшие терминали варикозных аксонов прослеживаются между глобулами и их клетками (рис. 1c). В некоторых тельцах выявляются клетки с признаками преадипоцитов и адипоцитов. Трансформация клеток телец в адипоциты сопровождается изменением их формы, размеров, увеличением их числа, повышенной активностью, сопровождающейся формированием в цитоплазме везикулярных структур и различных размеров липидных вакуолей. В процессе дифференцировки из эпителиальных предшественников образуются две популяции жировых клеток: белые и бурые адипоциты, формируется белая и бурая жировая ткань.

Использование гистологических и иммуногистохимических методов исследования показало, что на 10–14-е сутки постнатального развития в формирующейся жировой ткани выявляются уже артериальные кровеносные сосуды: крупные, средние и мелкие артерии, артериолы и капилляры. Они окружены непрерывной плотной сетью терминальных тяжей варикозных аксонов, представляющих собой систему дистантных синапсов типа en passant. Сравнительный иммуногистохимический анализ показал, что в тончайших тяжах этого сплетения проходят как PGP 9.5⁺, так и ТН⁺ аксоны. В этот срок хорошо прослеживаются взаимоотношения нервных структур (ганглиев, пучков нервных волокон и терминальных сплетений) с питающими сосудами и клетками ЭЖТ. Иногда встречаются отдельные ганглиозные клеточные тяжи, следующие на значительном протяжении среди долек дифференцирующейся жировой ткани. При этом видно, как во многих участках нейроциты ганглия вплотную прилежат к разным типам жировых клеток – к бурым и белым адипоцитам (рис. 2а). По мере созревания ЭЖТ увеличивается число артериальных и венозных сосудов, возрастает плотность иннервации ткани (рис. 2b).

Рис. 2.

Тирозингидроксилаза-иммунопозитивные нервные структуры в парасимпатическом ганглии (а) и терминальные варикозные аксоны вокруг сосудов (b) в жировой ткани смешанного типа у крыс в возрасте 14 сут. N – нервные клетки в ганглии; фрагменты нервных пучков (стрелки). Иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу. Масштабный отрезок равен 50 мкм.

Морфологический анализ области основания сердца крысы в 3–4-месячном возрасте показал, что наиболее выраженная масса жировой ткани в сердце крысы сосредоточена в эпиперикардиальной области органа в виде трех “подушек”, локализующихся между магистральными сосудами: одна – между краниальной полой веной и аортой, вторая – между аортальным и легочным стволами, третья – на дорсальной стенке, в области впадения легочных вен в правое предсердие. У половозрелых крыс подушки ЭЖТ состоят из долек различного размера, в которых различается два вида тканей, состоящих из белых и бурых адипоцитов (рис. 3а, 4а). Адипоциты белой жировой ткани имеют крупные размеры, достигают в диаметре 50–75 мкм, практически весь объем этих клеток занимает липидная вакуоль, ядро смещено на периферию и имеет уплощенную форму. Белая жировая ткань в дольках, как правило, у взрослых крыс преобладает. В большинстве долек среди белой ткани постоянно встречаются скопления бурых адипоцитов. Бурые адипоциты – клетки округлой или кубической формы. Они легко отличаются по строению от белых адипоцитов и очень сходны по морфологии с клетками эпителиальных тел, мельче (15–20 мкм) адипоцитов белой жировой ткани, имеют сферической формы, центрально расположенное гиперхромное ядро с одним-двумя ядрышкамии и темноватую цитоплазму, в которой видны многочисленные микровезикулярные структуры. Среди них можно выделить клетки, находящиеся на различных стадиях дифференцировки: малодифференцированные преадипоциты, дифференцирующиеся и зрелые (белые и бурые) адипоциты. Между белыми и бурыми элементами встречаются также клетки переходной формы. Для них характерно наличие в цитоплазме кроме микровезикулярных структур также средних и относительно крупных размеров липидных вакуолей. ЭЖТ крыс в возрасте 3–4-х мес. богато васкуляризирована. В ее дольках видны артерии различного диаметра, артериолы и капилляры.

Рис. 3.

Фрагменты жировой ткани околосердечной области крысы в возрасте 3–4-х месяцев. а – белая и бурая жировая ткань; b – плотная терминальная сеть варикозных аксонов в смешанной жировой ткани. Br – бурая жировая ткань; Wh – белая жировая ткань. Окраска толуидиновым синим (а); иммуногистохимическая реакция на белок PGP 9.6 (b). Масштабный отрезок равен 50 мкм.

Применение иммуногистохимических маркеров показало, что ЭЖТ взрослых крыс хорошо иннервирована. В ее дольках можно видеть парасимпатические ганглии, группы хромаффинных клеток, синтезирующих катехоламины, нервные пучки и нервные сплетения из симпатических и парасимпатических безмиелиновых нервных волокон.

Входящие в дольки ЭЖТ артерии окружены PGP 9.5⁺ периваскулярной сетью из терминальных варикозных аксонов. Последние, по нашему мнению, представляют собой основную сеть дистантных синапсов типа en passant. Варикозные аксоны этой сети наблюдаются не только вокруг гладкомышечных клеток артериальных сосудов, но часто вокруг адипоцитов бурой и смешанной ЭЖТ (рис. 3b, 4).

Рис. 4.

Периваскулярные терминальные нервные сплетения и межклеточные окончания варикозных аксонов в смешанной ЭЖТ. А –артериола; V – венула; Wh – белая жировая ткань; * – бурые адипоциты. Иммуногистохимическая реакция на PGP 9.5. Масштабный отрезок равен 50 мкм.

Установлено, что в бурой и белой жировой ткани находятся терминальные нервные сплетения из проводников разной медиаторной природы: TH⁺ симпатических и PGP 9.5⁺ парасимпатических нервных волокон. Наиболее выраженная иннервация выявлена в бурой и смешанной ЭЖТ, в то время как в белой жировой ткани иннервация выражена очень слабо (рис. 5). На поперечных срезах среди массы белых адипоцитов можно встретить лишь единичные пучки и тяжи нервных волокон, располагающихся в адвентиции артерий и артериол. С помощью реакции на синаптофизин удалось выявить тончайшие Syn⁺ синаптические нервные окончания в составе периваскулярной сети, связанной с гладкомышечными клетками артериальной стенки сосудов, а также в виде свободно располагающихся между клетками белой и бурой ткани.

Рис. 5.

Низкая степень иннервации белой жировой ткани; видны единичные поперечно срезанные тонкие пучки ТН⁺ аксонов в адвентиции редких сосудов (стрелки). Иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу. Масштабный отрезок равен 50 мкм.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В последние два десятилетия большое внимание исследователей уделяется вопросам происхождения, морфологии и иннервации белой и бурой жировой ткани. Выяснению этих вопросам посвящен ряд обзорных статей [3, 5, 8] и монография Афанасьева и Колодезниковой [1]. С помощью иммуногистохимической реакции установлено, что при экспериментальном снижении температуры окружающей среды в бурой жировой ткани увеличивается плотность иммунореактивных нервных сплетений ТН⁺, CGRP⁺, VIР⁺ нервных волокон [6], что более иннервированной является бурая жировая ткань [19]. Эти факты связывают с тем, что преадипоциты и адипоциты бурого жира ЭЖТ выполняют гормональную функцию – вырабатывают адипокины, влияющие на функционирование сердца [3]. Следует отметить, что сердце в свою очередь через паракринную сигнализацию секреторных миокардиоцитов правого предсердия оказывает влияние на ЭЖТ [3].

В нашем исследовании показано, что ЭЖТ хорошо васкуляризирована и иннервирована. У новорожденных, 14-суточных и взрослых половозрелых крыс с помощью применения нейроиммуногистохимических маркеров (белок PGP 9.5, TH и Syn) в исследованных жировых подушках основания сердца были выявлены парасимпатические микроганглии, одиночные нейроны, нервные стволики, пучки и терминали. Нервные аппараты различной медиаторной принадлежности выявлялись в презумптивной ЭЖТ крыс, начиная с первых суток постнатального развития, когда она была представлена еще эпителиальными тельцами, и далее, постоянно, на разных стадиях цито- и гистодифференцировки бурых и белых адипоцитов, бурой и белой жировых тканей.

На основании иммуногистохимического исследования показано, что на ранних этапах постнатального онтогенеза (Р1–Р14) в иннервации ЭЖТ существенную роль играют катехоламинергические (ТН-иммунореактивные) нервные волокна, а после периода полового созревания (3–4 мес.) наблюдается выраженное разрежение катехоламинергических нервных сплетений в тканях сердца и преобладание холинергических (PGP 9.5-иммунореактивных) нервных волокон [20]. Полученные данные согласуются также с мнением о двунаправленности взаимодействия нервной и нейроэндокринной регуляции липидного обмена со стороны как периферической, так и центральной нервной системы [21–23]. Согласно концепции авторов [21–23], нервная система и, в частности, ее симпатический отдел обеспечивает регуляцию процессов метаболизма липидов через гипоталамус. Chi с соавт. [15] показали, что взаимосвязь симпатической нервной системы с развивающимися жировыми клетками у мышей возникает довольно рано – в период Р6–Р28 постнатального развития. Нам удалось выявить ТН⁺ и PGP9.5⁺ нервные волокна и терминальные сплетения, начиная со стадии Р1, до периода половозрелости и, таким образом, подтвердить участие симпатической и парасимпатической нервной системы в регуляции бурых и белых адипоцитов.

Вопрос о развитии адипоцитов белой и бурой жировых тканей в процессе онтогенеза дискуссионен. По данным литературы, белые, бурые, а также переходные формы – “бежевые” адипоциты образуются еще до формирования жирового депо [8]. Основные депо бурых адипоцитов у грызунов находятся в “подушечках” межлопаточной, подмышечной, надпочечной и парааортальной жировой ткани. Некоторые авторы считают, что большинство бурых жировых клеток происходит из клеток-предшественников эмбриональной мезодермы, из тех же, что и субпопуляции белых адипоцитов [8]. Результаты нашего исследования показали, что обе ЭЖТ сердца (бурая и белая) крысы происходят из специализированных эпителиальных телец, являющихся, по нашему мнению, закладками мезодермального зародышевого листка, это согласуется с данными литературы. Интересно отметить, что клетки эпителиальных телец по морфологическим (гистологическим и электронномикроскопическим) признакам, форме, размерам и строению митохондрий сходны с секреторными клетками фетальной коры надпочечников [14, 24]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в онтогенезе ЭЖТ может вырабатывать регуляторные биологически активные вещества, и т.о. подтверждается точка зрения, что жировые депо в организмах животных и человека кроме функций, связанных с липидным обменом, выполняют также функцию эндокринных органов [2].

В ходе исследования ЭЖТ в жировых депо “подушек” сердца нами выделены следующие клеточно-тканевые структуры, образующиеся из эпителиальных телец: эпителиоморфные преадипоциты и дифференцирующиеся адипоциты бурой ткани (в виде очаговых скоплении), кластеры из бурых и белых адипоцитов – смешанная тканевая структура, и высокодифференцированная белая жировая ткань из кольцевидных адипоцитов. Эмбриональное происхождение и морфология третьей популяции адипоцитов – “бежевых”, описанных в разных жировых депо животных, остается дискуссионным. Отмечают, что “бежевые” и бурые адипоциты могут происходить из различных клеточных линий. Предполагается, что “бежевые” клетки в подкожном депо происходят из белых зрелых адипоцитов путем трансдифференцирования или возникают de novo из клеток-предшественников [8, 25]. Афанасьев и Колодезникова [1] выделяют до семи типов клеток на разных стадиях дифференцировки, начиная от незрелого предшественника – “эпителиоморфной клетки”, и заканчивая терминальным периодом полной дегенерации адипоцита. На основании этих данных можно усомниться в трансдифференциации из белых адипоцитов бурых. Формирование бурой ткани в условиях эксперимента может объясняться наличием стволовых клеток-предшественников, которые, по-видимому, в течение всей жизни организма присутствуют в жировых депо человека и животных.

В наших предыдущих исследованиях для изучения иннервации сердца и других органов млекопитающих нередко применялся сравнительный анализ специальных нейроиммуногистохимических маркеров: белка PGP 9.5, ТН и Syn [9, 26]. В настоящей работе применение комплекса этих маркеров позволило установить, что белая и бурая ЭЖТ и ее артериальные сосуды богато иннервированы парасимпатическими и симпатическими нервными волокнами. Эти данные дополняют сведения о наличии в дольках межлопаточного бурого жира [19, 27] нервных волокон, имеющих разную пептидергическую природу (субстанция P, NPY, CGRP, SP). Их обнаружение, по мнению авторов, согласуется с гипотезой о сенсорной и трофической функциях перечисленных пептидов.

В настоящем исследовании установлено, что чередование и распределение нервных структур разной медиаторной природы в ЭЖТ заметно изменяется в течение онтогенеза животного. Эти факты могут свидетельствовать о функциональных изменениях липидного обмена в тканях сердца. Несмотря на то, что парасимпатические нервные структуры (холинергические ганглии, нервные пучки и сплетения) появляются в субэпикарде крысы раньше катехоламинергических или симпатических, роль постганглионарных симпатических нервных волокон имеет не менее существенное значение. В настоящей работе иннервация впервые нами обнаружена в “эпителиальных тельцах” на стадиях Р1–Р14. Показано, что уже на этих этапах онтогенеза TH⁺пучки катехоламинергических симпатических нервных волокон и их терминальные сплетения, состоящие из варикозных аксонов, присутствуют в тельцах. Наиболее иннервируемой в онтогенезе оказалась бурая жировая ткань. По нашему мнению, именно она является более чувствительной к нервной стимуляции в ответ на внешние и внутренние факторы раздражения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью иммуногистохимических реакций на белок PGP 9.5, тирозингидроксилазу и синаптофизин в “подушках” и дольках белой и бурой жировых тканях основания сердца крысы на разных этапах онтогенеза выявлены различные катехоламинергические и холинергические нервные аппараты: ганглии, скопления хромаффинных клеток, нервные стволы, пучки сплетения, отдельные волокна, синаптические окончания. Установлено, что парасимпатические и симпатические постганглионарные нервные волокна проникают в дольки жировой ткани в составе ремаковских тяжей варикозных аксонов по артериальным сосудам, образуют терминальные синаптические сплетения типа en passant и участвуют в иннервации адипоцитов обоих типов ЭЖТ. Установлены важные различия в иннервации тканей. Тяжи терминальной синаптической сети симпатических и парасимпатических варикозных аксонов локализуются преимущественно в очагах бурой и смешанной жировой ткани, где находятся в тесной связи не только со стенкой артериальных сосудов, но и с бурыми адипоцитами. В белой жировой ткани тяжи варикозных аксонов выявляются в основном вокруг артериальных сосудов и практически отсутствуют между ее адипоцитами. Установленный нами факт наличия парасимпатических и симпатических нервных сплетений в ЭЖТ у новорожденных животных может свидетельствовать о важной роли автономной нервной системы в адипогенезе и липидном обмене, начиная с ранних сроков постнатального развития.