Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 12, стр. 1639-1654

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 80 крысах самцах стока Wistar SPF-категории (Пущино) в условиях улучшенного конвенционального вивария, массой 300–350 г, в соответствии с Директивой Европейского Совета по соблюдению этических принципов в работе с лабораторными животными, согласно дизайну эксперимента (рис. 1), утвержденного решением биоэтического комитета Института экспериментальной медицины Национального медицинского исследовательского центра им. В.А. Алмазова, протокол-заявка 21-09ПЗ#V1 от 21.05.2021. Животные случайным образом распределялись в одну из пяти групп (n = 16 в каждой группе): 1) контроль (CTR) – крысы получали стандартный корм и питьевую воду ad libitum; 2) синдром системного воспалительного ответа (ССВО). Крысам с первичным висцеральным ожирением, индуцированным жироуглеводной диетой, на основе контролируемого потребления ненасыщенных жирных кислот (2 г) и сахарозы (1 г) соответственно на 1 крысу в сутки, в течение 28 дней до моделирования ССВО и далее до окончания опыта [9], осуществлялось моделирование ССВО [7]. Животным однократно ректально вводили смесь 3%-ного раствора уксусной кислоты и 3%-ного раствора этанола в физиологическом растворе, общим объемом 1 мл, индуцируя острое воспаление толстого кишечника. Начиная со следующего дня, этим животным внутрижелудочно вводили смесь антимикробных препаратов (амоксициллин, метронидазол и кларитромицин) в следующем режиме: 1 мл раствора антимикробных препаратов в суточной дозе по 15 мг каждого препарата на крысу в течение трех дней, что провоцировало антибиотик-индуцированный дисбиоз; 3) ССВО с введением смеси пробиотических лакто- и бифидобактерий (SIRS + LBS) – крысам с ССВО вместо 1 мл физиологического раствора в течение 8 дней вводили 1 мл раствора смеси пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus (LA-5) и Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB-12), в концентрации не менее 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) каждого штамма на одно животное; 4) ССВО с введением сахаромицетов (SIRS + SB) – крысам данной группы в 1 мл физиологического раствора вводили 25 мг лиофилизированных Saccharomyces boulardii на одно животное; 5) ССВО с введением энтерококков (SIRS + EF) – крысам данной группы в качестве пробиотических микроорганизмов вводили лиофилизированные Enterococcus faecium L3 в дозе 10⁸ КОЕ на одно животное. Краткие сведения об использованных штаммах приведены в обсуждении.

Рис. 1.

Дизайн эксперимента. CTR – контроль, SIRS – синдром системной воспалительной реакции, SIRS + LBS – ССВО и смесь LA-5 и BB-12, SIRS + SB – ССВО и S. boulardii, SIRS + EF – ССВО и E. faecium L3, AA + E – смесь уксусной кислоты и этанола, HFCD – жироуглеводная диета, Veh – физиологический раствор, AMC – смесь антимикробных препаратов.

На 8-й день после моделирования ССВО, на 40 рандомно отобранных крысах для соответствующих групп (n = 8), проводили опыт по методике окклюзии левой коронарной артерии под изофлурановым наркозом, которая включала в себя следующие этапы: индукция анестезии, трахеостомия, катетеризация сонной артерии, катетеризация бедренной вены, торакотомия, моделирование ишемически-реперфузионного повреждения миокарда, включающее период стабилизации исходных значений, ишемию (30 мин) и реперфузию (120 мин). В конце эксперимента анестезия углублялась с 2%-ного до 5%-ного раствора изофлурана, выполнялась реокклюзия коронарной артерии и вводилось 2.5 мл синего Эванса (2%-ный раствор). Через 10 с после выявления четкой границы между перфузируемым и ишемизированным отделом сердца его быстро вырезали, промывали в физиологическом растворе и разрезали на 5 поперечных фрагментов толщиной 1.5–2.0 мм. Планиметрическую оценку размера инфаркта проводили путем окраски срезов сердца 1%-ным раствором трифенилтетразолия хлорида при температуре 37°С в течение 15 мин. Определяли размер зоны риска и размер инфаркта, которые выражали в процентах от общей площади среза и от площади зоны риска соответственно и вычисляли средние значения для данного сердца по результатам анализа 5 срезов [11].

У оставшихся 40 крыс соответствующих групп под краткосрочным наркозом брали цельную кровь (2 мл) из большой подкожной вены для гематологического, биохимического и иммунологического анализа. Клинический анализ крови выполняли на автоматическом ветеринарном гематологическом анализаторе (URIT-3000 Vet Plus, URIT Medical Electronic, Китай). Концентрацию кальция (Са²⁺), желчных кислот (ЖК), щелочной фосфатазы (ЩФ), мочевой кислоты и мочевины оценивали с помощью биохимического анализатора (BioChem Analette, HTI, CША). Уровень трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), фактора некроза опухолей-α (TNF-α), провоспалительных цитокинов IL-1α, IL-2, IL-6, IL-8, липополисахарида (LPS), моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1) оценивали иммуноферментным методом (MR-96A, Mindray, Китай).

Посмертно измерялась масса некоторых внутренних органов – слепой кишки как макроскопического показателя антибиотик-индуцированного дисбиоза, печени – полифункционального органа, вырабатывающего желчь, почек – основы мочевыделительной системы, и селезенки как самого большого лимфоидного органа. Массовый коэффициент органов как процентное отношение массы органа к массе тела [12] в данной модели вычисляли без массы слепой кишки в связи с кратным увеличением внутрипросветного содержимого, индуцированного дисбиозом в результате введения антибиотиков. На протяжении всего эксперимента, ежедневно с 9 до 10 утра проводили оценку потребления корма и воды, а также массы тела животных.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программного пакета STATISTICA 10.0. Статистический анализ дискретных значений проводился с использованием непараметрического H-критерия Краскела–Уоллиса для обнаружения статистически значимых различий, с последующим апостериорным сравнением с использованием критерия Манна–Уитни. Для повторных измерений непрерывного типа, проверку гипотезы о равенстве средневыборочных величин в нескольких независимых выборках проводили методами дисперсионного анализа ANOVA c проведением post-hoc теста (Tukey HSD). В таблицах использованы медианные значения (Mе) и значения для нижнего и верхнего квартиля (25%; 75%). Для построения графических изображений использовали средние значения и стандартные отклонения (SD). Статистически значимыми считали различия при уровне значимости р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Масса тела и внутренних органов

Масса тела крыс в группе CTR, начиная со дня моделирования ССВО до окончания опыта, в среднем увеличивалась на 1.5 ± 0.6 г/сутки, тогда как в группах SIRS, SIRS + LBS, SIRS + SB и SIRS + EF наблюдали уменьшение массы тела животных на 3.9 ± 0.4; 3.6 ±1.4; 3.9 ± 1.1 и 2.3 ± 0.2 г/сутки соответственно (p < 0.05 в сравнении с группой CTR). Потребление воды животными за этот же период, из расчета на 100 г массы тела, в группе CTR составило 7.1 ± 0.6 мл/сутки, что значимо не отличалось от значений данного показателя в остальных группах (7.5 ± 0.5; 7.3 ± 1.3; 8.3 ± 0.8 и 6.3 ± 1.2 мл/сутки для групп SIRS, SIRS + LBS, SIRS + SB и SIRS + EF соответственно). Потребление корма в группах из расчета на 100 г массы тела в сутки, начиная с дня моделирования, для крыс из группы CTR составило 3.9 ± 0.2; SIRS – 1.5 ± 0.03; SIRS + LBS – 1.6 ± 0.1; SIRS + SB – 1.8 ± 0.1; и SIRS + EF – 1.6 ± 0.2 г/100 г/сутки, показывая сокращение в опытных группах в 1.9–2.5 раза (р < 0.05) по отношению к контролю (рис. 2а, b, c).

Рис. 2.

Динамика изменения массы тела (а), потребление воды (b) и корма (c) со дня моделирования ССВО до окончания опыта, среднее значение (± SD). CTR – контроль; SIRS – синдром системного воспалительного ответа; SIRS + LBS – ССВО и смесь LA-5 и BB-12; SIRS + SB – ССВО и S. boulardii; SIRS + EF – ССВО и E. faecium L3. * – р < 0.05 по отношению к группе CTR.

В группе SIRS произошло уменьшение массового коэффициента печени на 16% (р < 0.05), в группе SIRS + LBS на 10% (р < 0.05), SIRS + EF на 19% (р < 0.05) по отношению к группе CTR, тогда как в группе SIRS + SB этот показатель не отличался от такового в группе CTR. Для селезенки отмечено уменьшение массового коэффициента в группе SIRS на 12% (р < 0.05) по сравнению с группой CTR. В группе SIRS + SB массовый коэффициент селезенки был на 12% выше, чем в группе CTR. Значимое увеличение массового коэффициента почек на 12% наблюдали в группе SIRS (табл. 1).

Таблица 1.  

Массовые коэффициенты органов, критерий Краскела–Уоллиса, (Me; 25%; 75%), n = 8

Группа	CTR	SIRS	SIRS + LBS	SIRS + SB	SIRS + EF
Слепая кишка	1.41# (1.39; 1.45)	5.92* (4.64; 6.90)	2.68# (2.66; 2.68)	3.29*, # (3.03; 3.32)	3.25*, # (3.20; 3.29)
Печень	3.00# (2.96; 3.08)	2.69* (2.68; 2.70)	2.78* (2.77; 2.79)	3.08# (3.01; 3.17)	2.53*, # (2.51; 2.57)
Селезенка	0.18# (0.175; 0.182)	0.14* (0.136; 0.145)	0.17# (0.170; 0.175)	0.2*, # (0.197; 0.212)	0.17# (0,165; 0,178)
Почки	0.52# (0.509; 0.527)	0.57* (0.574; 0.576)	0.53 (0.532; 544)	0.56 (0.535; 0.566)	0.52# (0.522; 0.531)

* – р < 0.05 по отношению к группе CTR, # – р < 0.05 по отношению к группе SIRS (U-критерий). CTR – контроль; SIRS – синдром системного воспалительного ответа; SIRS + LBS – ССВО и смесь LA-5 и BB-12; SIRS + SB – ССВО и S. boulardii; SIRS + EF – ССВО и E. faecium L3.

Размер инфаркта и гемодинамические показатели

Непараметрический анализ различий гемодинамических показателей программным пакетом для повторных измерений непрерывного типа (ANOVA) показал, что исходные показатели, данные для 5-й минуты ишемии, а также для 90-й и 120-й минуты реперфузии между группами не различались. В группе SIRS, начиная с 10-й минуты ишемии и до 60-й минуты реперфузии, уровень среднего артериального давления (САД) и частота сердечных сокращений (ЧСС) с начала ишемии и до 90-й минуты реперфузии, были значимо ниже по отношению к контролю (р < 0.05). В группе SIRS + SB в ходе всего наблюдения показатели ЧСС были значимо меньше, чем в группе CTR, а для САД были близкими к контрольным. В группе SIRS + LBS показатели САД были меньше контроля, начиная с 5-й до 40-й минуты реперфузии, при уменьшении ЧСС с 30-й минуты ишемии до 60-й минуты реперфузии, а в группе SIRS + EF САД уменьшилось с 10-й минуты ишемии до 40-й минуты реперфузии (р < 0.05), при ЧСС близкой к контролю (рис. 3а, b).

Рис. 3.

Динамика изменения среднего артериального давления (a) и частоты сердечных сокращений (b) на протяжении ишемии и реперфузии, среднее значение (± SD). CTR – контроль, SIRS – синдром системной воспалительной реакции, SIRS + LBS – ССВО и смесь LA-5 и BB-12, SIRS + SB – ССВО и S. boulardii, SIRS + EF – ССВО и E. faecium L3. Значимость в отдельных точках * – р < 0.05 по отношению к группе CTR указана в тексте.

Медианные значения размера зоны риска от общей площади исследованной части миокарда составили 47% (39; 48), 45% (36; 48), 44% (38; 53), 43% (42; 50), 46% (40; 55) в группах CTR, SIRS, SIRS + LBS, SIRS + SB и SIRS + EF соответственно (р > 0.05), (рис. 2), что показывает равенство методических условий во всех экспериментальных группах. Размер инфаркта в группе CTR составил 42% (41; 46), а в группе SIRS – 55% (53; 59) от зоны риска, что значимо больше на 24%, тогда как в группе SIRS + LBS – 47% (41; 50) значение этого показателя было близким к контролю. В группах SIRS + SB и SIRS + EF размер инфаркта миокарда составил 59% (47; 61) и 58% (50; 59) соответственно, что больше чем в контроле на 40 и 38% (p < 0.05), и практически равно показателю в группе SIRS, это указывает на отсутствие кардиопротекции в этих группах, (рис. 4а, b).

Рис. 4.

Зона риска и зона некроза миокарда, Me (25%; 75%). CTR – контроль, SIRS – синдром системной воспалительной реакции, SIRS + LBS – ССВО и смесь LA-5 и BB-12, SIRS + SB – ССВО и S. boulardii, SIRS + EF – ССВО и E. faecium L3. * – р < 0.05 по отношению к группе CTR.

Первичный анализ результатов позволяет заключить, что ССВО значимо увеличивает размер инфаркта на фоне существенного снижения САД и ЧСС, тогда как после пробиотической терапии в группе с введением лакто- и бифидобактерий этот показатель был близок к контролю, что говорит о возможной кардиопротекции в условиях ССВО. Для этой группы SIRS + LBS, после стабильности в период ишемии, показано снижение артериального давления в начале периода реперфузии с сопутствующим падением ЧСС по отношению к CTR, с последующим подъемом, что, видимо, носит компенсаторный характер. Введение других двух пробиотиков не отразилось на размере инфаркта после моделирования ССВО, несмотря на стабильность САД в группе SIRS + SB, и стабильность ЧСС в группе SIRS + EF, что показывает специфические особенности влияния различных пробиотических штаммов на координацию регуляторных механизмов функциональности миокарда. Все три пробиотика нормализовали, в той или иной степени, гематологические, биохимические, иммунологические и функциональные параметры, но только в группе SIRS + LBS помимо стабилизации большинства биохимических и иммунологических показателей, произошло уменьшение размера инфаркта до контрольных значений.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе были исследованы кардиотропные эффекты трех пробиотических препаратов на модели регионарной ишемии–реперфузии миокарда у крыс с ССВО, включающим первичное висцеральное ожирение, антибиотик-индуцированный дисбиоз и острое воспаление толстого кишечника. Клинические исследования штаммов LA-5 и BB-12 показали благоприятное воздействие на микрофлору кишечника и местный иммунитет у здоровых людей и людей с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Под влиянием BB-12 происходит повышение продукции иммуноглобулина А в слизистой оболочке кишечника, что способствует повышению ее противоинфекционной резистентности [13, 14]. Saccharomyces boulardii проявляет антагонизм к ряду патогенных и условно патогенных микроорганизмов, подавляет их развитие; повышает местную иммунную защиту вследствие увеличения продукции иммуноглобулина А и других иммуноглобулинов, оказывает иммунобиологическое и антидиарейное действие [15]. Пробиотический штамм Enterococcus faecium L3 – непатогенный энтерококк, выделенный из молочной закваски с выраженным антагонизмом к патогенной и условно патогенной флоре с иммуномодулирующими и витаминообразующими свойствами [16, 17]. Максимальное увеличение массы слепой кишки в нашей работе было отмечено в группе SIRS при сравнении с группой CTR, что подтверждает антибиотик-индуцированное нарушение пищеварительной и эвакуаторной функций тонкой кишки [18, 19]. Общая картина изменений состава лейкоцитов, полученная в данном исследовании, в целом характерна для ожоговой травмы и сопровождается снижением числа гранулоцитов при увеличении представительства лимфоцитов и эозинофилов в группе SIRS [20]. В условиях моделирования ССВО на фоне увеличения основных субпопуляций лейкоцитов (LYM и MID) выявлены специфические особенности влияния пробиотических препаратов на изменения состава лейкоцитов. По отношению к группе SIRS интересно существенное снижение количества LYM и MID в группах SIRS + LBS и SIRS + EF, причем самое заметное уменьшение субпопуляции MID отмечено у крыс последней группы, что указывает на специфические особенности действия исследованных пробиотических препаратов.

Известно, что усиление лейкопоэза возникает под влиянием таких провоспалительных цитокинов, как IL-1, IL-6, IL-8, а также под влиянием ряда медиаторов воспаления. Универсальными стимуляторами гранулоцитарно-моноцитарного лейкопоэза являются гормоны адаптации – катехоламины и глюкокортикоиды, реализующие свои эффекты на костный мозг через усиление образования колониестимулирующих факторов и интерлейкинов. К числу стимуляторов лейкопоэза относятся витамин В₁₂, аскорбиновая кислота, фолиевая кислота, железо. Подавление костномозгового кроветворения возможно под влиянием ряда медиаторов воспаления, таких как простагландины, IL-10, IL-13, TNF-α, TGF-β, а также лактоферрин и кислый изоферритин [21]. Однако анализ результатов экспериментального моделирования воспаления в нашем случае усложняется введением во внутреннюю среду организма с локальным химически индуцированным повреждением толстой кишки пробиотических штаммов, обладающих собственным про- и противовоспалительным потенциалом [22]. В нашей работе отмечено увеличение большинства провоспалительных цитокинов в группе c моделированием ССВО и снижение устойчивости миокарда к ИРП, тогда как в группе SIRS + LBS с размером инфаркта, не отличавшимся от контроля, отмечено уменьшение уровня провоспалительных цитокинов во всех исследованных случаях, а в группе SIRS + SB – отсутствие нормализации уровней LPS и IL-8, что может быть косвенно связано с отсутствием эффекта кардиопротекции. Однако нет оснований утверждать, что именно LPS или IL-8 является прямой причиной снижения устойчивости миокарда к ИРП, т.к. в группе SIRS + EF эффект кардиопротекции также не наблюдали при близости показателей этих маркеров к контрольным. Предпосылку к подобным рассуждениям дают сведения о возможной супрессии лейкопоэза под действием TNF-α, TGF-β и др., как контур обратной регуляции при гипервозбуждении в системе воспаления. Можно предположить, что максимальный показатель TGF-β в группе SIRS + LBS объясняет сопряженное уменьшение комплекса медиаторов до близких к нормальным значениям, что способствует регуляции процессов лейкопоэза и гибели лейкоцитов, а также определенной стадийности дифференцировки элементов миелоидного, лимфоидного и мегакариоцитарного рядов с сохранением регуляторных механизмов устойчивости миокарда к ИРП.

Следует отметить, что показатели гемодинамики (АД и ЧСС) в группе SIRS были достоверно ниже параметров, регистрируемых в контроле, тогда как в группах SIRS + LBS и SIRS + EF ЧСС, а в группе SIRS + SB среднее АД за период наблюдения достоверно отличалась в сторону увеличения от группы SIRS.

К настоящему времени в литературе убедительно продемонстрировано, что уровень в крови провоспалительных цитокинов, и в частности TNF-α у пациентов с хронической сердечной недостаточностью ассоциирован с тяжестью клинических проявлений [23]. В связи с задачей исследования по выяснению кардиопротективной роли пробиотических микроорганизмов на фоне ССВО необходимо обратить внимание на изменения размера инфаркта миокарда в связи с концентрацией пула желчных кислот (ЖК) в крови животных. Остается открытым вопрос: являются ли ЖК маркером патологии энтерогепатической циркуляции или непосредственным участником патофизиологической цепочки “макроорганизм–ЖКТ–микробиота–воспаление–миокард”. Первичные ЖК образуются в печени, непосредственно участвуют в пищеварении и метаболизируются ферментами определенных представителей кишечной микробиоты, обладают прямым и косвенным антимикробным действием, выступают в роли эндогенных лигандов к рецепторам некоторых гормонов, регуляторных белков, витамина D₃ и др. Вторичные ЖК принимают участие в процессах ожирения, воспаления и канцерогенеза [24]. В патофизиологическом смысле являются интересными сведения о кишечном дисбиозе с воспалительными заболеваниями кишечника в связи с недостаточностью вторичных ЖК, немногими известными продуцентами которых являются представители семейств Lachnospiraceae и Ruminococcaceae, тогда как в процессе деконьюгации и гидролизе первичных ЖК участвуют многие кишечные комменсалы таких обширных родов, как Bacteroides, Clostridium и Enterococcus [25]. В наших предыдущих исследованиях на модели ССВО мы показали прямую корреляционную связь между увеличением площади некроза миокарда изолированного сердца и концентрацией в плазме крови уксусной и пропионовой кислоты, продуцентами которых являются факультативные и облигатные анаэробы, в т.ч. патогенные и условно-патогенные [7]. С другой стороны, продуцентами короткоцепочечных жирных кислот являются представители вышеупомянутых семейств Lachnospiraceae и Ruminococcaceae, что дает повод к неоднозначному и порой противоречивому толкованию роли и значения отдельных представителей микробиоты, часто рассматриваемых однозначными симбионтами [26]. Возвращаясь к результатам данного исследования о сочетанном снижении значений пула ЖК, ряда ключевых провоспалительных маркеров (TNF-α, IL-1, IL-8, MCP-1), нормализации лейкограммы и уменьшения площади некроза в группе SIRS + LBS после моделирования ССВО, можно предположить, что определенные представители кишечной микробиоты и пробиотические штаммы, а также их композиции в состоянии индуцировать как кардиопротективный ответ, так и напротив, снижать устойчивость миокарда к ИРП, что требует дальнейших исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальная модель, включающая в себя первичное висцеральное ожирение, острое воспаление толстого кишечника и антибиотик-индуцированный дисбиоз, разработана для изучения потенциала пробиотических препаратов в отношении изучения возможности модуляции устойчивости миокарда к ишемии–реперфузии в условиях несбалансированного увеличения уровня цитокинов в крови. Данная модель отражает известную клиническую картину ССВО и требует комплексного изучения общих и специфических реакций организма на локальное и системное повреждение. В работе подтверждено, что ССВО сопровождается существенными отклонениями биохимических, гематологических и иммунологических показателей от нормы и приводит к увеличению размера инфаркта, т.е. снижает устойчивость миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению. Показано, что все три использованных пробиотика в разной степени нормализуют возникающие при ССВО отклонения биохимических, гематологических и иммунологических показателей, при этом только смесь LA-5 и BB-12 приближает размер инфаркта к контрольному значению, т.е. обладает кардиопротективным потенциалом в условиях ССВО. Два остальных изученных пробиотика, несмотря на частичную нормализацию биохимических и иммунологических параметров на фоне ССВО, не обладают кардиопротективным действием. Главным выводом данной работы можно считать тот факт, что на экспериментальной модели ССВО различные пробиотические штаммы специфическим образом воздействуют на устойчивость миокарда к ишемическому-реперфузионному повреждению. Полученные результаты могут быть использованы для исследования кардиопротективного потенциала пробиотических препаратов в рамках концепции трансляционной медицины.