Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 12, стр. 1610-1626

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные

Эксперименты были выполнены на 30 взрослых самцах крыс популяции Вистар в возрасте 6–7 мес. и массой тела 350–400 г, выращенных в виварии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. На протяжении всего исследования крыс содержали в одиночных клетках с неограниченным доступом к пище и воде при естественном освещении и температуре воздуха 21–23°C. Манипуляции с животными проводились в соответствии принципам Базельской декларации, этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ и протоколу, утвержденным этическим комитетом Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Проведение операции по вживлению проводящих канюль

Перед проведением операции животных наркотизировали с помощью золетила (Zoletil®; Virbac, Франция), в дозе 60 мг/кг (внутримышечно). Установку канюль проводили с использованием стереотаксического устройства (Narishige, Япония) согласно атласу координат для крыс линии Вистар [25]: для кчЧС – 5 мм каудальнее брегмы и 2 мм слева и справа от саггитального шва, для левого бокового желудочка – 0.5 мм каудальнее брегмы, 1.5 мм латерально. Глубина погружения канюли на уровне кчЧС в головной мозг крысы составляла 5.5–6 мм, на уровне левого бокового желудочка – 4 мм. Такие длины нижних частей канюль исключали возможность механического повреждения интересующих нас структур мозга. Для закрепления канюль использовался зубной цемент “Акродент” (“Стома”, Украина). После застывания цемента в канюли помещали мандрены. Эксперименты начинали не раньше, чем через 7 дней после проведения операции.

Препараты и экспериментальные группы

Для выполнения микроинъекций наркотизированное золетилом (внутримышечно, 45 мг/кг) животное помещали в стереотаксическое устройство (Narishige, Япония). Микроинъекции препаратов осуществляли с помощью шприцов Hamilton с инъекционными иглами нужной длины и диаметра. Используемые в исследовании препараты растворяли в стерильном фосфатно-солевом буфере (phosphate buffered saline (PBS), пропущенном через фильтр-насадку на шприц PVDF 0.22 мкм (JET BIOFIL®, Корея).

Для исследования нами была выбрана хроническая модель БП у крыс, разработанная в лаборатории сравнительной термофизиологии, и созданная путем угнетения активности УПС в нигростриатной системе [8, 10, 26]. Данная модель позволяет моделировать основные патофизиологические признаки доклинической и клинической стадий БП у крыс. Для угнетения активности протеасом использовали специфический ингибитор их ферментативной активности лактацистин (ЛЦ) (Enzo Life Sciences, Великобритания). Введение ЛЦ осуществляли двукратно и билатерально в кчЧС в дозах 0.4 мкг/мкл (первая микроинъекция ЛЦ) и 4.0 мкг/мкл (вторая микроинъекция ЛЦ). Интервал между введениями составлял 7 дней.

Для подавления функционирования белка AQP-4 был выбран фармакологический подход и применен ингибитор 2-(никотинамид)-1,3,4-тиадиазол (2-(nicotinamide)-1,3,4-thiadiazole, TGN-020. Введение TGN-020 выполняли в боковой желудочек мозга в дозе 40 мкг и в объеме 6 мкл за 15 мин до введения ЛЦ. Поскольку коммерчески доступный препарат TGN-020 имеет низкую растворимость и для приготовления рабочего раствора требуется диметилсульфоксид, применение которого нежелательно для микроинъекций в мозг, в нашем исследовании была использована водорастворимая форма TGN-020 в виде натриевой соли, синтезированная В.А. Полукеевым (АО “Вектон”, Санкт-Петербург) согласно методическим протоколам разработчиков [27 ] . Контрольные группы животных получали микроинъекции растворителя препаратов (PBS) в том же объеме, что и экспериментальные животные. Скорость введения препаратов в канюлю составляла 0.5 мкл/мин (для TGN-020) и 0.1 мкл/мин (для ЛЦ). В конце эксперимента проводился гистологический контроль места инъекции (рис. 1).

Рис. 1.

Гистологический контроль мест микроинъекций. Световая микроскопия: (a) левый боковой желудочек, (b) черная субстанция. Срезы мозга окрашены антителами против тирозингидроксилазы. Стрелками обозначены места микроинъекций. Масштаб – 20 мкм.

Для выполнения исследования путем простой рандомизации были сформированы следующие группы животных:

Группа 1. Интактные животные (n = 6);

Группа 2. Контроль (n = 6; введение PBS (контрольного раствора) в левый боковой желудочек и в кчЧС);

Группа 3. TGN-020 (n = 6; введение TGN-020 в левый боковой желудочек и PBS в кчЧС);

Группа 4. ЛЦ (n = 6; введение PBS в левый боковой желудочек и ЛЦ в кчЧС);

Группа 5. ЛЦ + TGN-020 (n = 6; введение TGN-020 в левый боковой желудочек и ЛЦ в кчЧС).

Оценка изменений моторного поведения

Тесты на моторное поведение проводились через 19–20 дней после первого введения препаратов.

Тест с семенами подсолнечника (Sunflower seed test). Тест с семенами подсолнечника применяли для оценки изменений мелкой моторики передних конечностей, рта и языка [28]. В период содержания крыс в виварии в их рацион периодически добавляли небольшое количество семян подсолнечника. За сутки до тестирования крыс не кормили. В день эксперимента каждая крыса получала 10 семян подсолнечника, тестирование проводили с применением видеорегистрации. В ходе эксперимента определяли среднее время, затрачиваемое крысой на манипуляции, необходимые для поедания одного семени (взятие семечка передними конечностями, вскрытие кожуры, извлечение и поедание).

Тест “Открытое поле” (Оpen field test). Тест “Открытое поле” дает возможность выявить признаки гипокинезии и акинезии по изменению двигательной активности [29, 30]. Не менее чем за 1 ч до проведения теста животных переносили в экспериментальную комнату для адаптации. При проведении эксперимента соблюдали тишину. Крысу помещали в центр открытого поля (ООО “НПК Открытая Наука”, Россия), запускали программу видеотрекинга EthoVision (Noldus, США) и наблюдали за ее поведением в течение 5 мин. После тестирования каждого животного поверхности протирали влажной губкой и дезодорировали 3%-ным раствором перекиси водорода. Для того чтобы оценить изменения двигательной активности, выполняли автоматизированное вычисление общей длины пути, пройденного каждой крысой.

Тест “Сужающаяся дорожка” (Beam-walking test). Установку “Сужающаяся дорожка” (ООО “НПК Открытая Наука”, Россия) использовали для оценки моторной функции передних и задних конечностей, что позволяет выявить признаки развития сенсомоторного дефицита [31]. В данном тесте животное должно пройти по доске, которая постепенно сужается, и зайти в темный отсек. Доска состоит из 2 частей: верхней, по которой идет крыса, и более широкой нижней, позволяющей фиксировать соскальзывания лапок и ошибочные постановки конечностей. В течение 4–5 дней до финального тестирования проводили предварительную адаптацию животных к помещению и экспериментальной установке. В день эксперимента не менее чем за 1 ч до проведения теста животных переносили в экспериментальную комнату для адаптации. В тесте “Сужающаяся дорожка” регистрировали постановку лапы на верхнюю или нижнюю доску. Подсчитывали количество постановок конечности на нижнюю доску (ошибок), количество соскальзываний конечности с верхней доски на нижнюю и общее количество шагов животного от стартовой линии до попадания в темный отсек. Полученные по трем попыткам данные усредняли.

Степень выраженности моторного дефицита отдельно для передних и задних конечностей рассчитывали по формуле, рекомендованной производителем экспериментальной установки:

Иммуногистохимическое исследование

Крыс декапитировали через 21 день после первого введения препаратов. Животных наркотизировали с помощью хлоралгидрата (внутрибрюшинно, 400 мг/кг). Для дальнейшего иммуногистохимического исследования мозг быстро извлекали из черепной коробки и фиксировали в 10%-ном растворе формалина (Биовитрум, Россия) при температуре 4°С. Через 4–5 дней после декапитации мозг промывали в PBS (pH 7.4) и помещали в 20%-ный раствор сахарозы для криопротекции при температуре 4°С. Через 5–7 дней мозг замораживали в изопентане, охлажденном с помощью сухого льда до –45°С, и далее хранили в морозильной камере при температуре –80°С. Изготовление чередующихся серий фронтальных срезов головного мозга крыс толщиной 10 мкм осуществлялось на криостате Leica (Германия). Локализацию структур (кчЧС и дорсального стриатума) определяли с помощью анатомического атласа мозга крысы [25]. Предметные стекла со срезами высушивали в течение суток при комнатной температуре и далее хранили при температуре –20°С.

Для визуализации и последующего подсчета количества выживших ДА-ергических нейронов в кчЧС и их аксонов в стриатуме, а также оценки содержания в нейронах кчЧС скорость-лимитирующего фермента синтеза ДА тирозингидроксилазы (ТГ), использовали биотин-стрептавидиновый метод. После выполнения стандартных подготовительных этапов [10] срезы кчЧС и стриатума инкубировали с первичными поликлональными антителами кролика против ТГ (Abcam, Великобритания (1 : 700)) и оставляли на сутки при комнатной температуре во влажной камере. Затем срезы инкубировали со вторичными антителами козы против кролика, конъюгированными с биотином (Vector Laboratories, США (1 : 400)), в течение 1 ч при комнатной температуре, и далее – со стрептавидин-пероксидазой (Vector Laboratories, США (1 : 400)) в течение 1 ч при комнатной температуре. Визуализация осуществлялась с использованием 3,3'-диаминобензидина. После стандартной проводки в спиртах восходящей концентрации препараты помещали в среду Microclearing (Diapath, Италия) и затем заключали под покровное стекло с помощью среды Витрогель (Биовитрум, Россия). Далее стекла хранили при комнатной температуре.

Окрашивание нейронов по методу Ниссля

Известно, что на результат иммуногистохимического исследования может влиять ряд различных факторов, в частности – количество белка-мишени, качество взаимодействия антигена и антитела. Для того чтобы получить дополнительное свидетельство развития нейродегенеративного процесса в кчЧС, использовали стандартную методику окраски нейронов по методу Ниссля с использованием 1%-ного раствора толуидинового синего. Дифференцирование в 96%-ном этиловом спирте проводили под визуальным контролем с использованием светового микроскопа (Биомед, Россия) до проявления у окрашенных клеток ядра, ядрышка и светлой зернистой цитоплазмы. Затем стекла высушивали, помещали в среду Microclearing (Diapath, Италия) и заключали под покровное стекло с помощью среды Витрогель (Биовитрум, Россия). Окрашенные стекла со срезами хранили в затемненном месте при комнатной температуре.

Морфологический анализ препаратов

Изображения исследуемых структур мозга получали с помощью микроскопа Karl Zeiss (Imager A1) со встроенной видеокамерой и программы Zen Blue для захвата изображения в формате [jpg]. Подсчет ТГ-иммунопозитивных нейронов кчЧС с видимым ядром и нейронов кчЧС, окрашенных по методу Ниссля и имеющих отчетливо видимое ядро и ядрышко, проводили с применением программы PhotoM (http://www.t_lambda.chat.ru/). Для каждого животного было обработано 8–10 снимков кчЧС. Оптическая плотность ТГ, используемая для анализа содержания этого фермента в нейронах кчЧС, рассчитывалась компьютерной программой PhotoM как средний десятичный логарифм отношения яркости фона, не содержащего иммунореактивное вещество, к яркости точки объекта (нейронов кчЧС, содержащих иммунореактивное вещество ТГ) при прохождении волны света длиной 650 нм на том же срезе. Данные по изменению оптической плотности ТГ выражали в условных единицах (у. е). Для подсчета количества ТГ-иммунореактивных аксонов в дорсальном стриатуме использовали программу ImageJ/FiJi (NIH, США), позволяющей полуавтоматически (под контролем экспериментатора) выделять интенсивно окрашенные аксоны и анализировать их количество на каждом снимке. У каждого животного было обработано 15–20 снимков.

Статистическая обработка результатов

Анализ всех полученных результатов проводился в программе GraphPad Prism 8. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения средних значений двух независимых выборок использовали t‑критерий Стьюдента. Статистическую обработку результатов, распределенных нормально, осуществляли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA, с последующим Tukey post-hoc анализом. Различия результатов между группами считали достоверными при уровне значимости p < 0.05, результаты представлены в виде mean ± SEM.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроинъекции контрольного раствора и TGN-020 не оказывают влияния на моторное поведение, показатели нейродегенерации в нигростриатной системе и содержание тирозингидроксилазы в ДА-ергических нейронах компактной части черной субстанции

Для того чтобы выяснить, оказывает ли операция по вживлению направляющих канюль и последующее введение PBS влияние на моторное поведение и развитие нейродегенеративного процесса в нигростриатной системе у крыс, был проведен сравнительный анализ этих показателей у двух групп животных – интактных и подвергшихся хирургическому вмешательству и микроинъекциям. Установлено, что проведение операции и выполнение микроинъекций PBS в ликвор бокового желудочка мозга и кчЧС не приводило к появлению моторных нарушений у крыс. У контрольных животных, по сравнению с интактными, не было обнаружено статистически значимого изменения количества иммунореактивных к ТГ нейронов в кчЧС (99.1 ± 1.9 vs 103.0 ± 2.6, p = 0.64) и их аксонов в дорсальном стриатуме (4.9 ± ± 0.2 × 10³ vs 5.0 ± 0.1 × 10³, p = 0.69), а также общего числа нейронов в кчЧС, окрашенных по методу Ниссля (114.3 ± 3.9 vs 123.4 ± 3.3, p = 0.10). Анализ оптической плотности ТГ в телах ДА-ергических нейронов в кчЧС не выявил изменений содержания этого фермента у контрольных животных по сравнению с интактными (0.21 ± 0.01 vs 0.22 ± 0.01, p = 0.85). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что проведение хирургической операции и введение контрольных растворов не оказывает значительного влияния на исследуемые показатели.

Далее нами было изучено влияние микроинъекций TGN-020 на вышеперечисленные показатели по сравнению с контролем (PBS). Выяснено, что применяемая доза TGN-020 не вызывает изменений показателей моторного поведения (рис. 2), не приводит к развитию нейродегенерации в нигростриатной системе и изменению содержания ТГ в ДА-ергических нейронах кчЧС (рис. 3–5).

Ингибитор TGN-020 вызывает развитие моторных нарушений, усиление нейродегенерации в нигростриатной системе и снижение содержания тирозингидроксилазы в ДА-ергических нейронах компактной части черной субстанции в модели БП у крыс

Рис. 2.

Влияние TGN-020 на показатели моторного поведения в лактацистиновой модели БП у крыс. a) общая пройденная дистанция в тесте “Открытое поле”(см); b) cредняя продолжительность поедания семечка подсолнечника (с) (Interaction F(1, 20) = 2.71, p = 0.11; “TGN-020” factor F (1, 20) = 10.89, p = 0.0036; “LC” factor F(1, 20) = 29.86, p < 0.001); с) сенсомоторный дефицит верхних конечностей (%); d) сенсомоторный дефицит нижних конечностей (%) (Interaction F(1, 20) = 10.55, p = 0.0040; “TGN-020” factor F(1, 20) = 9.35, p = 0.0062; “LC” F(1, 20) = 31.51, p < 0.001). ***р < 0.001 – достоверность различий по сравнению с контролем; # p < 0.05, ##p < 0.01 – достоверность различий между ЛЦ и TGN-020 + ЛЦ.

Рис. 3.

Влияние TGN-020 на число нейронов в кчЧС в лактацистиновой модели БП у крыс. Световая микроскопия: a) ТГ-иммунопозитивные нейроны кчЧС (масштаб 50 мкм); b) нейроны кчЧС, окрашенные по методу Ниссля (масштаб 50 мкм). c) число ТГ-иммунопозитивных нейронов в кчЧС (interaction F(1, 20) = 2.57, p = 0.12; “TGN-020” factor (F(1, 20) = 11.71, p = 0.0027; “LC” factor (F(1, 20)=124.2, p < 0.001); d) число нейронов кчЧС, окрашенных по методу Ниссля (interaction F(1, 20) = 2.02, p = 0.17; “TGN-020” factor F(1, 20) = 11.34, p = 0.0031; “LC” factor F(1, 20) = 75.54, p < 0.001). ***p < 0.001 – достоверность различий по сравнению с контролем; # p < 0.05, ## p < 0.01 – достоверность различий между ЛЦ и TGN-020 + ЛЦ.

Рис. 4.

Влияние TGN-020 на количество ДА-ергических аксонов в дорсальном стриатуме в лактацистиновой модели БП у крыс. a) cветовая микроскопия: микрофотографии аксонов в дорсальном стриатуме (масштаб 50 мкм); b) число аксонов в дорсальном стриатуме (interaction F(1, 20) = 2.05, p = 0.17; “TGN-020” factor F(1, 20) = = 7.41, p = 0.01; “LC” factor F(1, 20) = 44.75, p < 0.001). **p < 0.01, ***p < 0.001 – достоверность различий по сравнению с контролем; #p < 0.05 – достоверность различий между ЛЦ и TGN-020 + ЛЦ.

Рис. 5.

Влияние TGN-020 на содержание тирозингидроксилазы в нейронах кчЧС в лактацистиновой модели БП у крыс. a) световая микроскопия: микрофотографии ТГ-иммунопозитивных нейронов кчЧС (масштаб 50 мкм); b) изменение оптической плотности ТГ в нейронах кчЧС (interaction F(1, 20) = 7.59, p = 0.01; “TGN-020” factor F(1, 20) = 9.54, p = 0.0058; “LC” factor F(1, 20) = 2.02, p = 0.17). *p < 0.05 – достоверность различий по сравнению с контролем; ##p < 0.01 – достоверность различий между ЛЦ и TGN-020 + ЛЦ.

Проведенное нами исследование показало, что введение ЛЦ не вызывает развития моторных нарушений (рис. 2). Проведение морфологического анализа позволило выяснить, что применение ЛЦ приводит к уменьшению числа иммунореактивных к ТГ нейронов в кчЧС на 27% (p < 0.001) (рис. 3a, c) и их аксонов в стриатуме на 19% (p < 0.01) (рис. 4). При подсчете числа нейронов в кчЧС на препаратах, окрашенных по методу Ниссля, было выявлено уменьшение их количества на 24% (p < 0.001) (рис. 3b, d). Этот результат согласуется с данными, полученными при подсчете ТГ-иммунопозитивных клеток в кчЧС. При изучении уровня ТГ в ДА-ергических нейронах кчЧС значимых изменений обнаружено не было (рис. 5). Таким образом, микроинъекции ЛЦ приводили к развитию нейродегенеративного процесса в нигростриатной системе, степень выраженности которого соответствовала допороговому уровню по сравнению с уровнем нейродегенерации при клинической стадии БП, при которой погибает более половины нейронов кчЧС. Наблюдаемые нами нейродегенеративные изменения в нигростриатной системе, не сопровождающиеся развитием моторных нарушений, соответствуют характеристикам доклинической стадии БП.

Нами впервые было апробировано введение TGN-020 в ликворную систему головного мозга с целью выявления взаимосвязи между снижением активности AQP-4 и развитием патологических признаков БП у модельных животных. При изучении моторного поведения не было выявлено достоверного изменения общей пройденной дистанции в тесте “Открытое поле” у животных, получавших TGN-20 перед микроинъекциями ЛЦ, по сравнению с группой животных, воспроизводивших модель доклинической стадии БП (рис. 2a). Однако и по сравнению с контролем, и по сравнению с доклинической моделью БП в тесте с семенами подсолнечника было отмечено увеличение среднего времени, затрачиваемого крысой на вскрытие и поедание семечка (рис. 2b), а в тесте “Сужающаяся дорожка” – появление признаков сенсомоторного дефицита нижних конечностей (рис. 2с, d).

Подсчет количества ДА-ергических нейронов в кчЧС и их аксонов в дорсальном стриатуме при введении TGN-020 в модели доклинической стадии БП позволил установить, что ингибитор AQP-4 приводит к увеличению числа погибших ДА-ергических нейронов кчЧС в 1.7 раз (р < 0.01) (рис. 3a, c), а их аксонов в дорсальном стриатуме – в 1.6 раз (р < 0.05) (рис. 4) по сравнению с действием одного ЛЦ. Сходные данные были получены при подсчете нейронов кчЧС на препаратах, окрашенных по методу Ниссля: применение TGN-020 в доклинической модели БП у крыс приводило к увеличению числа погибших нейронов в кчЧС в 1.56 раз (p < 0.05) по сравнению с действием ЛЦ (рис. 3b, d). Для того чтобы оценить влияние TGN-020 на уровень ТГ в ДА-ергических нейронах кчЧС в модели доклинической стадии БП, было проанализировано изменение оптической плотности ТГ. Установлено, что оптическая плотность ТГ в нейронах кчЧС в группе животных, получавших TGN-020 до ЛЦ, снижалась на 17% (р < 0.05) по сравнению с контролем и на 21% (р < 0.01) по сравнению с группой крыс с доклинической стадией БП (рис. 5)

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе проведенного исследования было установлено, что введение ЛЦ в кчЧС приводит к гибели 27% ДА-ергических нейронов в кчЧС и 19% их аксонов в дорсальном стриатуме. В этих условиях не было выявлено снижения уровня ТГ в выживших нейронах кчЧС и не наблюдалось признаков моторных нарушений (нарушений мелкой моторики передних конечностей, рта и языка, изменения общей пройденной дистанции, признаков сенсомоторного дефицита). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что примененный протокол введения ЛЦ позволяет моделировать доклиническую стадию БП. Отсутствие двигательных нарушений в этой модели можно объяснить сохранением компенсаторных процессов в нигростриатной системе, направленных на поддержание уровня дофамина на уровне нормы. Кроме того, не исключено, что маскированию моторной симптоматики при развитии нейродегенеративного процесса в нигростриатной системе может способствовать увеличение уровня везикулярного транспортера моноаминов 2 [10], уменьшение экспрессии мембранного переносчика дофамина, уменьшение активности моноаминоксидазы B, обеспечивающей деградацию дофамина [32].

Для того чтобы оценить влияние ослабления функции AQP-4 на развитие нейродегенеративного процесса в нигростриатной системе, нами был применен фармакологический ингибитор AQP-4 TGN-020 в модели доклинической стадии БП у крыс [27, 33 ] . Согласно данным литературы, этот препарат является одним из наиболее часто используемых для ингибирования AQP-4 в различных моделях неврологических нарушений [34–36]. Применение магнитно-резонансной томографии показало, что введение TGN-020 замедляло распространение контрастного вещества в тканях головного мозга и подавляло клиренс тау-белка [11, 37]. Эти данные свидетельствует о том, что применение TGN-020 может нарушать работу глимфатической системы. Однако следует отметить, что все вышеперечисленные исследования были выполнены с использованием внутрибрюшинного пути введения TGN-020. В исследовании на мышах было обнаружено, что меченый препарат [¹¹C]TGN-020 после системного введения может обнаруживаться в сердце [27 ] . Кроме того, авторы высказали предположение, что TGN-020 также может оказывать ингибирующее действие на другой водный канал, AQP-1, который на 60% гомологичен AQP-4. Для того чтобы избежать влияния TGN-020 на работу AQP-4 и, возможно, AQP-1 в периферических органах, нами было принято решение использовать центральные микроинъекции этого препарата в ликворную систему головного мозга. Проведенное нами исследование показало, что применение TGN-20 в модели доклинической стадии БП не привело к развитию признаков гипокинезии, однако были обнаружены симптомы нарушения тонкой моторики (судя по увеличению времени, затрачиваемого крысой на вскрытие и поедание семечек подсолнечника) и признаки развития сенсомоторного дефицита задних конечностей. Появление моторных нарушений было сопряжено с увеличением числа погибших ДА-ергических нейронов в кчЧС в 1.7 раза и их аксонов в дорсальном стриатуме в 1.6 раза по сравнению действием одного ЛЦ, что свидетельствовало об ускорении процесса нейродегенерации в нигростриатной системе. Подобный уровень нейродегенерации сам по себе может быть недостаточно высоким, чтобы вызвать отчетливые моторные нарушения, однако нами было обнаружено снижение уровня ТГ в нейронах кчЧС на 21%, которое свидетельствует об ослаблении компенсаторных механизмов поддержания уровня дофамина в нигростриатной системе, что способствует проявлению симптомов паркинсонизма.

Результаты выполненного нами исследования, свидетельствующие об ускорении нейродегенеративного процесса в условиях действия ингибитора AQP-4, согласуются с данными, полученными другими исследователями в экспериментах на нокаутированных по AQP-4 мышах [21–23 ]. Установлено, что через 6 месяцев после введения фибрилл α-синуклеина в дорсальный стриатум число ДА-ергических нейронов в кчЧС у мышей AQP4^+/– и мышей дикого типа уменьшалось на 55.2% и 31.8%, что свидетельствовало об усилении нейродегенерации в кчЧС при подавлении экспрессии AQP-4. Кроме того, у мышей AQP4^+/– по сравнению с мышами дикого типа было отмечено более раннее развитие моторной дисфункции (ухудшение координации, уменьшение мышечной силы и снижение двигательной активности [21]. При использовании нокаутированных по AQP-4 мышей в острой и хронической МФТП-моделях БП также было обнаружено достоверное увеличение числа погибших ДА-ергических нейронов в кчЧС по сравнению с мышами дикого типа [23, 24 ] . Кроме того, было выявлено, что в острой и хронической МФТП-модели БП у AQP4^–/– мышей отмечается более выраженная потеря ТГ-иммунопозитивных волокон не только в дорсальном, но и в вентральном стриатуме, и увеличение числа погибших ДА-ергических нейронов в вентральной тегментальной области [23 ] . Эти данные свидетельствуют о том, что снижение экспрессии AQP-4 приводит к увеличению уязвимости к МФТП и цитотоксичности олигомеров α-синуклеина.

Используемая нами ЛЦ-модель БП характеризуется развитием α-синуклеиновой патологии в кчЧС [9, 10, 38]. Это позволило нам предположить, что одним из ключевых механизмов, лежащих в основе TGN-020 – индуцированной прогрессии нейродегенерации в нигростриатной системе, может являться накопление токсичных олигомеров α-синуклеина во внеклеточной среде из-за снижения активности водного канала AQP-4, которое может приводить к нарушению водного обмена между цереброспинальной и интерстициальной жидкостями в головном мозге. Известно, что олигомерный α-синуклеин, обладающий прионными свойствами, может посредством различных механизмов выходить во внеклеточное пространство и затем интернализоваться соседними клетками (нейронами, астроцитами, микроглией) [39, 40]. Недостаточно эффективная “очистка” клеток мозга и межклеточного пространства от нейротоксичных форм этого белка может приводить к прогрессированию патологии БП. Было продемонстрировано, что введение патогенных фибрилл α-синуклеина в дорсальный стриатум частично нокаутированным по AQP-4 мышам (AQP4^+/–) по сравнению с мышами дикого типа вызывает усиленное накопление патологического α-синуклеина в стриатуме, черной субстанции и моторной коре [21]. При этом отмечалось увеличение содержания нерастворимой формы α-синуклеина в различных областях коры и стриатуме. Введение в дорсальный стриатум рекомбинантного α-синуклеина с флуоресцентной меткой показало, что у мышей со сниженной экспрессией AQP-4 область флуоресценции была значительно больше, чем у мышей дикого типа, что могло свидетельствовать о нарушении глимфатического клиренса [21]. В другом исследовании было показано, что у мышей AQP4^−/− по сравнению с мышами дикого типа также было отмечено замедление клиренса растворимых форм рекомбинантного человеческого α-синуклеина (A53T и α-syn A30P) из паренхимы мозга. Однако авторы исследования не обнаружили увеличения агрегации олигомеров α-синуклеина и предполагают, что AQP-4 участвует в клиренсе растворимых макромолекул из паренхимы головного мозга [20]. Применение фармакологического ингибирования AQP-4 с помощью TGN-020 в моделях болезни Альцгеймера на животных также способствовало развитию амилоидогенеза и прогрессии нейродегенерации [36, 37]. Совокупность представленных выше наших экспериментальных данных и данных литературы указывает на связь AQP-4 с развитием БП. Можно предположить, что дисфункция AQP-4 может приводить к нарушению функционирования глимфатической системы вследствие снижения эффективности водного обмена между интерстициальной и спинномозговой жидкостью в головном мозге, что, в свою очередь, вызывает усугубление α-синуклеиновой патологии и усиление нейродегенеративного процесса.

Известно, что α-синуклеин может удаляться из внеклеточного пространства путем эндоцитоза или фагоцитоза астроцитами и микроглиоцитами [41]. Нарушение функционирования AQP-4 в результате фармакологического ингибирования могло негативно сказаться на способности астроцитов захватывать и разрушать патологические формы α-синуклеина. Кроме того, AQP-4 может быть вовлечен в механизмы развития нейровоспаления, являющегося одним из важнейших звеньев патогенеза БП [3, 23, 42 ] . Можно предположить, что подавление функционирования AQP-4 может способствовать усилению нейровоспаления и ускорению нейродегенеративного процесса, наблюдаемому в нашем исследовании. Перечисленные выше механизмы являются основными предполагаемыми факторами, лежащими в основе TGN-020-индуцированного усиления нейродегенеративного процесса, наблюдаемого в нашем исследовании. Однако, несмотря на то, что молекулярные механизмы очистки головного мозга от метаболитов чрезвычайно активно исследуются, в отношении концепции глимфатико-лимфатической системы по-прежнему остается много противоречий и вопросов, на которые еще только предстоит ответить.

Таким образом, полученные нами результаты указывают на то, что AQP-4 играет важную роль в молекулярных механизмах защиты нейронов от нейротоксических факторов при развитии Паркинсон-подобной патологии. В связи с тем, что AQP-4 является ключевым звеном в обеспечении водного гомеостаза головного мозга, этот канал представляется перспективной терапевтической мишенью. Новые данные, полученные в ходе поиска путей модуляции функционирования и локализации AQP-4, могут иметь большое значение для разработки новых подходов превентивной терапии БП и других нейродегенеративных патологий мозга.