1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова
  4. T. 108, № 12, 2022

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 12, стр. 1627-1638

Высокоаффинный KV1.2-селективный пептид

А. М. Гиголаев 1, Э. Л. Пиньейро-Жуниор 2, С. Пеньёр 2, Я. Титгат 2, А. А. Василевский 1, 3, *

1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Москва, Россия

2 Лёвенский университет
Лёвен, Бельгия

3 Московский физико-технический институт (государственный университет)
Долгопрудный, Россия

* E-mail: avas@ibch.ru

Поступила в редакцию 22.09.2022
После доработки 28.10.2022
Принята к публикации 30.10.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изоформа потенциал-чувствительных калиевых каналов KV1.2 представляет интерес, поскольку мутации в ее гене ассоциированы с различными заболеваниями, например атаксией и эпилепсией. Для изучения функции KV1.2 в норме и патологии необходимы селективные лиганды. В нашей работе мы получили такой лиганд на основе известного пептидного токсина скорпиона – харибдотоксина (ChTx, α-KTx1.1) из яда Leiurus hebraeus – путем введения в его структуру одной аминокислотной замены M29I. Пептид ChTx_M29I был получен в бактериальной системе экспрессии. Его фармакологическая характеристика проводилась на ооцитах лягушки Xenopus laevis, экспрессирующих панель каналов KV1 человека. Было обнаружено, что по сравнению с исходным токсином пептид ChTx_M29I менее аффинен к каналам KV1.1, 1.3 и 1.6, при этом в отношении KV1.2 его активность многократно возросла. Мы связываем такой эффект со взаимодействием пептида с определенным остатком канала (V381 у KV1.2). Если в этой позиции находится сравнительно небольшой остаток, то образуется выгодный контакт, повышающий аффинность. Изученный нами пептид ChTx_M29I представляет собой один из самых высокоаффинных (со значением полумаксимальной ингибирующей концентрации ИК50 ≈ 6 пМ) и высокоселективных лигандов KV1.2 (аффинность в отношении других изоформ ниже в 680 раз и более).

Ключевые слова: потенциал-зависимый калиевый канал, эпилепсия, нейротоксин, блокатор калиевых каналов

Потенциал-чувствительные калиевые каналы (KV) представляют собой трансмембранные белки и содержат четыре основные α-субъединицы [1]. Каждая α-субъединица состоит из цитоплазматического домена Т1 и шести трансмембранных спиралей (S1–S6). Спирали S1–S4 образуют потенциал-чувствительный домен, где собственно сенсором потенциала является спираль S4. В ее структуре можно выделить нехарактерные для внутримембранного пространства аминокислотные остатки (а. о.) K и R, которые в ответ на изменение потенциала вызывают движение всей спирали, что в итоге регулирует открытие и закрытие канала. Спирали S5 и S6 всех четырех α-субъединиц образуют поровый домен, в котором можно выделить селективный фильтр, содержащий консервативную последовательность TVGYG – она взаимодействует с ионами K+.

В геноме человека обнаружено 40 генов α-субъединиц KV, что делает эту группу самой крупной среди ионных каналов. В частности, каналы подсемейства KV1 широко представлены в мозге млекопитающих, особенно распространены KV1.1, 1.2, 1.4 и 1.6 [2]. Эти изоформы каналов могут образовывать как гомо-, так и гетеромеры, что влияет на их характеристики [3, 4]. В основном изучению доступны гомотетрамерные каналы из-за ограничений экспериментальных систем, в которых сложно контролировать экспрессию гетеромерных каналов.

Изоформа каналов KV1.2 представляет особый интерес, поскольку, во-первых, среди остальных изоформ KV1 она сравнительно равномерно экспрессирована в центральной нервной системе, а во-вторых, может образовывать как функциональные гомомерные, так и гетеромерные каналы с другими KV1 [3]. С мутациями этой изоформы связаны несколько заболеваний, таких как атаксия и эпилепсия [5, 6]. Для изучения функции KV1.2 в норме и патологии нужны селективные и высокоаффинные лиганды.

Одним из богатых источников лигандов KV является яд скорпионов. Из яда различных видов скорпионов было выделено множество пептидных блокаторов KV (KTx), согласно базе данных Kalium их насчитывается около 200 [7]. По аминокислотной последовательности их разделяют на несколько семейств: α-, β-, γ-, δ-, ε-, κ- и λ-KTx. Самым крупным и изученным является семейство α-KTx, оно включает пептиды длиной ~20–40 а. о., имеющие пространственную укладку цистеин-стабилизированных α-спирали и β-слоя (CSα/β). Также для них характерно наличие так называемой “функциональной диады” из а. о. K и Y, где K физически блокирует пору канала, а Y взаимодействует с его внешним вестибюлем [8].

Харибдотоксин (ChTx, α-KTx1.1) – это классический токсин из яда скорпиона Leiurus hebraeus, который был изучен на многих каналах. Он является высокоаффинным и селективным по отношению к каналам KV1.3, а также кальций-активируемым калиевым каналам KCa1.1 и KCa3.1 [9, 10]. В ходе исследований взаимодействия ChTx с различными калиевыми каналами в лаборатории Miller был получен ряд производных этого токсина. Наше внимание привлек пептид с заменой M29I [11]. Было показано, что если в KV дрозофилы Shaker внести замену T449F, аффинность ChTx_M29I падает в 1650 раз по сравнению с обычным ChTx. В каналах человека в аналогичной позиции находятся различные а. о., в том числе и крупные ароматические. Поэтому мы решили проверить, как данная мутация повлияет на аффинность токсина по отношению к каналам человека.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение рекомбинантного белка

ChTx_M29I был получен по стандартному протоколу, который мы использовали в предыдущих работах [12]. В бактериальной системе экспрессии велась наработка пептида в составе гибрида, содержащего вспомогательный белок тиоредоксин (Trx) [13], сайт гидролиза легкой цепи энтеропептидазы человека и гексагистидиновую последовательность для очистки белка при помощи аффинной хроматографии.

Клонирование целевого гена

Последовательность ДНК, кодирующая ChTx_M29I, была получена в результате двухэтапной ПЦР с использованием синтетических олигонуклеотидов. На первом этапе четыре праймера использовались для получения полноразмерной копии гена (табл. 1). На втором этапе реакционная смесь из первого этапа использовалась в качестве матрицы для амплификации с праймерами F1 и R1. Полученная ДНК была клонирована в экспрессионный вектор pET-32b (Novagen) по сайтам KpnI и BamHI.

Экспрессия и очистка химерного белка

Таблица 1.  

Последовательности праймеров, использованных для получения полноразмерного гена, кодирующего производное ChTx_M29I

Название Последовательность (5'–3')
F1 AGCTGCGGTACCGACGACGACGACCGTCAGTTTACCAATGTGAGCTGC
F2 GAGCGTTTGCCAGCGTCTGCATAACACCTCTCGCGGCAAGTGTATTAATA
R1 ACTTGAGGATCCTTAAGAATAACAACGGCATTTCTTATTAATACACTTGC
R2 CGCTGGCAAACGCTCCAACATTCTTTAGACGTGGTGCAGCTCACATTGGT

Сайты рестрикции обозначены подчеркиванием, жирным выделен сайт гидролиза энтеропептидазы.

Экспрессионный штамм Escherichia coli SHuffle T7 Express (New England Biolabs) был трансформирован вектором, несущим ген ChTx_M29I, рост клеточной биомассы в среде LB проходил при температуре 37°C до середины экспоненциальной фазы. Экспрессия была индуцирована добавлением изопропил-β-D-тиогалактопиранозида до концентрации 0.4 мМ. Далее клеточная биомасса культивировалась при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем клетки были разрушены при помощи ультразвука, а клеточный лизат нанесли на колонку со смолой HisPur Cobalt Resin (Thermo Fisher Scientific). Гибридный белок очищали по протоколу производителя смолы.

Очистка целевого пептида

Очищенный химерный белок растворяли в 50 мМ Tris-HCl (pH 8.0) до концентрации 1 мг/мл. Ферментативный гидролиз проводился при помощи легкой цепи энтеропептидазы человека (1 МЕ фермента на 1 мг белка) при 37°C в течение 16 ч [14]. Полученный гидролизат подвергался разделению при помощи обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (0–60% за 60 мин) на колонке Jupiter C5 (4.6 × 250 мм, Phenomenex). Детекция велась по оптическому поглощению элюата, а искомое соединение определялось по сравнению расчетных и экспериментально полученных масс, определенных при помощи матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрия

Для измерения молекулярной массы использовали спектрометр Ultraflex TOF‑T-OF (Bruker Daltonik), как описано ранее [15]. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (Sigma-Aldrich). Эксперименты проводились в режиме рефлектрона с погрешностью измерения масс не более 100 ppm. Масс-спектры анализировали с помощью программного обеспечения Data Analysis 4.3 и Data AnalysisViewer 4.3 (Bruker).

Электрофизиология

Эксперименты были выполнены по протоколам, опубликованным ранее [12]. Потенциал-чувствительные калиевые каналы человека (KV1.1 (GenBank: NM000217), 1.2 (GenBank: NM004974), 1.3 (GenBank: NM002232) и 1.6 (GenBank: NM002235)) были экспрессированы в ооцитах лягушки Xenopus laevis. Для этого были получены мРНК, кодирующие каналы, при помощи набора mMESSAGE mMACHINE T7 (Thermo Fisher Scientific). Затем полученные мРНК были инъецированы в ооциты с использованием микроинжектора (Drummond Scientific).

Запись токов, проходящих через мембрану ооцитов, велась при комнатной температуре методом двухэлектродной фиксации потенциала. Данные были получены с использованием усилителя GeneClamp 500 и программного обеспечения Clampex 9 (Molecular Devices). Потенциал покоя был равен −90 мВ, открытие каналов вызывалось деполяризацией мембраны до 0 мВ в течение 500 мс, затем в течение еще 500 мс потенциал поддерживался на уровне −50 мВ и возвращался к потенциалу покоя.

Для построения кривой зависимости ингибирования тока от концентрации токсина исследуемый пептид был последовательно разведен и добавлен в камеру с ооцитом, где достигалась конечная исследуемая концентрация. Полученные данные были анализированы по уравнению Хилла:

$y = \frac{{100}}{{1 + {{{\left( {\frac{{{\text{И}}{{{\text{К}}}_{{50}}}}}{{{{С}_{{{\text{пептида}}}}}}}} \right)}}^{{h~}}}~~}},$
где y – ингибирование тока в %, Спептида – концентрация исследуемого пептида, ИК50 – полумаксимальная ингибирующая концентрация, h – коэффициент Хилла.

Все данные были получены как минимум в трех независимых экспериментах (n ≥ 3). Обработка результатов проводилась в программе Origin (OriginLab Corporation).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение рекомбинантного пептида ChTx_M29I

Одним из основных способов получения пептидов с аминокислотными заменами является использование бактериальных систем экспрессии. Для того, чтобы в бактериях наработать нужный нам пептид, необходимо получить генетическую конструкцию, его кодирующую. Мы клонировали ген, кодирующий ChTx_M29I, в экспрессионный вектор pET-32b по сайтам рестрикции KpnI и BamHI. Полученной конструкцией мы трансформировали штамм E. coli SHuffle T7 Express, который предназначен для экспрессии дисульфид-богатых белков [16]. Целевой пептид нарабатывался в виде слитного белка с Trx, который был очищен с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии. Слитный белок затем подвергался ферментативному гидролизу по сайту энтерокиназы человека, а гидролизат разделялся при помощи ОФ-ВЭЖХ (рис. 1). Определение пика на хроматограмме, соответствующего пептиду ChTx_M29I, велось при помощи МАЛДИ масс-спектрометрии. Выход целевого пептида составил 4 мг с 1 литра питательной среды.

Электрофизиологическое исследование полученного пептида

Рис. 1.

(a) – хроматографическое разделение продуктов гидролиза гибридного белка энтеропептидазой. (b) – спектр очищенного ChTx_M29I, полученный при помощи МАЛДИ масс-спектрометрии в режиме рефлектрона, показаны соответствующие моноизотопные массы. Расчетная моноизотопная масса [M+H]+ составляет 4292.9 Да, экспериментально измеренная – 4293.1 Да.

Фармакологическую характеристику пептида ChTx_M29I мы провели при помощи метода двухэлектродной фиксации потенциала на панели каналов KV1. По сравнению с обычным ChTx он оказался намного менее аффинным по отношению к каналам KV1.1 и 1.6: в концентрации 2 мкМ он блокирует эти каналы на 3.1 ± 2.7% и 9.6 ± 0.6% соответственно (рис. 2, табл. 2). Среди KV ChTx проявляет селективность по отношению к каналу KV1.3 (табл. 2), в то время как полученный мутант оказался в 1500 раз более аффинным по отношению к каналу KV1.2 (ИК50 = 6 ± 0.4 пМ) и в 20 раз менее аффинным к KV1.3 (ИК50 = 4.1 ± 0.8 нМ). Таким образом, соотношение между ИК50 по отношению к каналам KV1.2 и 1.3 составило 680 раз, что делает ChTx_M29I одним из наиболее селективных лигандов KV1.2.

Рис. 2.

Фармакологическая характеристика пептида ChTx_M29I. (a‒d) – записи токов через мембрану ооцитов в контроле (черные кривые) и в присутствии пептида (2 мкМ для KV1.1 и 1.6, 6 пМ для KV1.2 и 4 нМ для KV1.3; серые кривые). (e, f) – кривые доза–ответ для каналов KV1.2 и 1.3, пунктирными линиями показаны значения ИК50. Коэффициенты Хилла (h) составляют 1.1 ± 0.1 и 0.35 ± 0.02 соответственно.

Таблица 2.  

Фармакологическая характеристика харибдотоксина (ChTx) и его мутанта ChTx_M29I

1 А/Б, где А – концентрация пептида, Б – процент ингибирования. Светло-серым выделены остатки цистеина, темно-серым обозначена позиция, в которую вносилась замена. Z обозначает остаток пироглутаминовой кислоты. Указаны значения Kd (для ChTx) [10, 17] и ИК50 (для ChTx_M29I) в нМ.

Ранее Miller и соавт. было предположено, что имеет место взаимодействие между а. о. токсина ChTx (M29) и канала Shaker (T449; табл. 3). При этом формируется высокоаффинный комплекс (Kd ≈ 0.063 нМ) [11]. При введении замен в токсин (M29I) и канал (T449F) получался менее стабильный комплекс (Kd ≈ 1100 нМ). То есть введение большого ароматического а. о. в положение 449 канала приводит к чрезвычайному ухудшению связывания производного ChTx_M29I. В случае изоформ KV1 человека ухудшение связывания этого производного с каналами KV1.1 и 1.6 не является неожиданным, так как в соответствующем положении находится большой ароматический а. о. (Y379 и Y429 соответственно; табл. 3).

Таблица 3.  

Сравнение аминокислотных последовательностей порового региона канала Shaker и KV1

Различающиеся а. о. обозначены серым фоном, полужирным выделены ключевые а. о., предположительно взаимодействующие с а. о. токсина M/I29.

В случае KV1.3 мы также наблюдаем снижение аффинности, что аналогично можно связать с наличием крупного а. о. (H451) в этой позиции. В свою очередь, у канала KV1.2 в этом положении находится сравнительно небольшой гидрофобный а. о. (V381), Ван-дер-ваальсовы взаимодействия с ним, по-видимому, объясняют высокую аффинность ChTx_M29I к данному каналу. Для объяснения наблюдаемых эффектов можно рассмотреть уже известную структуру комплекса ChTx с химерой KV1.2/2.1 [18]. Мы предполагаем, что ChTx_M29I располагается в вестибюле поры канала так же, как и сам ChTx. На рис. 3 можно видеть, что а. о. M29 токсина и V381 канала сближены в пространстве. Соответственно, если в этом положении у канала находится большой ароматический а. о., то это приводит к стерическому затруднению и уменьшению аффинности.

Рис. 3.

Структура комплекса ChTx с каналом KV1.2/2.1. Канал показан серым, а. о. V381 выделен желтым; токсин показан фиолетовым, K27 выделен синим, M29 – оранжевым.

В нашей лаборатории ранее был получен и охарактеризован токсин из яда скорпиона Mesobuthus eupeus MeKTx11-1 (α-KTx1.16), проявляющий высокую аффинность к KV1.2 (ИК50 ≈ 0.2 нМ) [19]. Однако этот токсин уступает и по аффинности, и по селективности рассматриваемому в данной статье пептиду ChTx_M29I. У MeKTx11-1 в структуре в положении 29 находится M, что наталкивает на мысль о получении более селективного лиганда при внесении такой же замены M29I.

Для сопоставления наших результатов со сведениями из литературы с помощью базы данных Kalium был составлен список селективных лигандов канала KV1.2 (табл. 4). Большинство из них – это токсины скорпионов, но также можно отметить несколько токсинов актиний, конусов и змей. Общая наблюдаемая тенденция заключается в том, что большинство лигандов не обладают высокой селективностью. Помимо MeKTx11-1, стоит упомянуть уротоксин [20] и мезомартоксин (MMTX) [21], обладающих сопоставимой селективностью с ChTx_M29I, однако аффинность которых существенно ниже. И наконец, Pi-4 из яда скорпиона Pandinus imperator [22] обладает сходной аффинностью и даже превосходит ChTx_M29I по селективности, однако активность этого пептида не была исследована в отношении KV1.6.

Таблица 4.  

Список известных полипептидных лигандов, селективно воздействующих на KV1.2

  KV1.1 KV1.2 KV1.3 KV1.6 Ссылки
СhTx_M29I 2000/31 0.006 2 4.1 2000/10 Эта работа
MeKTx11-1 2110 0.19 67 8900 [19]
MeKTx11-3 130 3.1 78 910 [19]
Css20 >10 3 1.3 7.2 4 [23]
Toxin II.10.4 >10 3.6 ~72   [24]
Toxin II 10.5 >10 0.3 8.3   [24]
Toxin II.12.5 > 0 0.7 26.2   [24]
Toxin II.12.8 4.8 2.9 >10   [24]
TsTX-K-alpha 1000/85 0.2 1000/85 1000/94 [25, 26]
Tst26 >10 1.9 10.7   [27]
Pi-1 >5000 0.44 9.7   [28, 29]
Maurotoxin 45 0.8 180   [30]
Pi-4 >10 000 0.008 >10 000   [22]
Urotoxin 253 0.16 91   [20]
OdK1 >400 183 >400   [31]
Kbot1 145 2.5 15   [32]
CoTx1 24 400 27 5300   [33]
OsK-2 >250 97 >250   [34]
Ts15 500/10 196 508 500/20 [35]
MMTX >50 000 15.6 12500   [21]
Bcs3a 405 0.03 74 1.31 [36]
Bcs4a 3000/54 173 1007 2246 [36]
RIIIJ ~4000 33 ~10 000 ~8000 [37]
RIIIK >10 000 280 >10 000 5000/10 [38, 39]
α-DTX 9.4 0.38 >100 9 [40–42]
DTX-I 3.1 0.13 4533 10/26 [43–45]

1 А/Б, где А – концентрация пептида в нМ, Б – процент ингибирования. 2 ИК50, нМ. 3 лиганд не действует в концентрации больше указанного значения в нМ. 4 нет данных.

Мутации в гене канала KV1.2 могут приводить к эпилептической энцефалопатии [6]. В основном, это мутации с потерей функции, когда канал теряет способность открываться в ответ на деполяризующий стимул. Однако известны патогенные мутации KV1.2 с приобретением функции, которые вызывают смещение порогового потенциала активации каналов в отрицательную область. В таком случае как раз могли бы найти применение селективные блокаторы в качестве фармакологического агента, корректирующего работу мутантного канала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы продемонстрировали, что одна аминокислотная замена может привести к значительному изменению аффинности и селективности лиганда калиевого канала на примере хорошо изученного харибдотоксина (ChTx). Замена M29I привела к ухудшению аффинности токсина по отношению к каналам KV1.1, 1.3 и 1.6, а к каналу KV1.2 мы наблюдали увеличение аффинности более чем в 1500 раз (ИК50 ≈ 6 пМ). Полученный пептид в итоге оказался высокоаффинным и высокоселективным лигандом канала KV1.2.

Список литературы

  1. Hille B (2001) Ion Channels of Excitable Membranes, 3rd ed. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass.

  2. Zeisel A, Hochgerner H, Lönnerberg P, Johnsson A, Memic F, Zwan J van der, Häring M, Braun E, Borm LE, Manno G La, Codeluppi S, Furlan A, Lee K, Skene N, Harris KD, Hjerling-Leffler J, Arenas E, Ernfors P, Marklund U, Linnarsson S (2018) Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell 174:999–1014.e22. https://doi.org/10.1016/J.CELL.2018.06.021

  3. Shamotienko OG, Parcej DN, Dolly JO (1997) Subunit combinations defined for K+ channel Kv1 subtypes in synaptic membranes from bovine brain. Biochemistry 36: 8195–8201. https://doi.org/10.1021/bi970237g

  4. Dodson PD, Barker MC, Forsythe ID (2002) Two heteromeric Kv1 potassium channels differentially regulate action potential firing. J Neurosci 22: 6953–6961. https://doi.org/10.1523/jneurosci.22-16-06953.2002

  5. Pena SDJ, Coimbra RLM (2015) Ataxia and myoclonic epilepsy due to a heterozygous new mutation in KCNA2: proposal for a new channelopathy. Clin Genet 87: e1–e3. https://doi.org/10.1111/CGE.12542

  6. Syrbe S, Hedrich UBS, Riesch E, Djémié T, Müller S, Møller RS, Maher B, Hernandez-Hernandez L, Synofzik M, Caglayan HS, Arslan M, Serratosa JM, Nothnagel M, May P, Krause R, Löffler H, Detert K, Dorn T, Vogt H, Krämer G, Schöls L, Mullis PE, Linnankivi T, Lehesjoki AE, Sterbova K, Craiu DC, Hoffman-Zacharska D, Korff CM, Weber YG, Steinlin M, Gallati S, Bertsche A, Bernhard MK, Merkenschlager A, Kiess W, Gonzalez M, Züchner S, Palotie A, Suls A, De Jonghe P, Helbig I, Biskup S, Wolff M, Maljevic S, Schüle R, Sisodiya SM, Weckhuysen S, Lerche H, Lemke JR (2015) De novo loss- or gain-of-function mutations in KCNA2 cause epileptic encephalopathy. Nat Genet 2015 474 47: 393–399. https://doi.org/10.1038/ng.3239

  7. Tabakmakher VM, Krylov NA, Kuzmenkov AI, Efremov RG, Vassilevski AA (2019) Kalium 2.0, a comprehensive database of polypeptide ligands of potassium channels. Sci Data 2019 61 6: 1–8. https://doi.org/10.1038/s41597-019-0074-x

  8. Mouhat S, De Waard M, Sabatier JM (2005) Contribution of the functional dyad of animal toxins acting on voltage-gated Kv1-type channels. J Pept Sci 11: 65–68.

  9. MacKinnon R, Miller C (1988) Mechanism of charybdotoxin block of the high-conductance, Ca2+- activated K+ channel. J Gen Physiol 91: 335. https://doi.org/10.1085/JGP.91.3.335

  10. Garcia ML, Garcia-Calvo M, Hidalgo P, Lee A, MacKinnon R (1994) Purification and characterization of three inhibitors of voltage-dependent K+ channels from Leiurus quinquestriatus var. hebraeus venom. Biochemistry 33: 6834–6839. https://doi.org/10.1021/bi00188a012

  11. Naranjo D, Miller C (1996) A strongly interacting pair of residues on the contact surface of charybdotoxin and a Shaker K+ channel. Neuron 16: 123–130. https://doi.org/10.1016/S0896-6273(00)80029-X

  12. Berkut AA, Usmanova DR, Peigneur S, Oparin PB, Mineev KS, Odintsova TI, Tytgat J, Arseniev AS, Grishin EV, Vassilevski AA (2014) Structural similarity between defense peptide from wheat and scorpion neurotoxin permits rational functional design. J Biol Chem 289: 14331–14340. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.530477

  13. McCoy J, LaVallie E (2001) Expression and Purification of Thioredoxin Fusion Proteins. In: Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons Inc. Hoboken NJ USA. 16.8.1–16.8.14

  14. Gasparian ME, Ostapchenko VG, Schulga AA, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP (2003) Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Exp Purif 31(1): 133–139. https://doi.org/10.1016/S1046-5928(03)00159-1

  15. Kuzmenkov AI, Sachkova MY, Kovalchuk SI, Grishin E V, Vassilevski AA (2016) Lachesana tarabaevi, an expert in membrane-active toxins. Biochem J 473: 2495–2506. https://doi.org/10.1042/BCJ20160436

  16. Lobstein J, Emrich CA, Jeans C, Faulkner M, Riggs P, Berkmen M (2012) SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm. Microb Cell Fact 11: 56. https://doi.org/10.1186/1475-2859-11-56

  17. Takacs Z, Toups M, Kollewe A, Johnson E, Cuello LG, Driessens G, Biancalana M, Koide A, Ponte CG, Perozo E, Gajewski TF, Suarez-Kurtz G, Koide S, Goldstein SAN (2009) A designer ligand specific for Kv1.3 channels from a scorpion neurotoxin-based library. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 22211–22216. https://doi.org/10.1073/PNAS.0910123106

  18. Banerjee A, Lee A, Campbell E, MacKinnon R (2013) Structure of a pore-blocking toxin in complex with a eukaryotic voltage-dependent K+ channel. Elife 2: e00594. https://doi.org/10.7554/eLife.00594

  19. Kuzmenkov AI, Nekrasova O V., Peigneur S, Tabakmakher VM, Gigolaev AM, Fradkov AF, Kudryashova KS, Chugunov AO, Efremov RG, Tytgat J, Feofanov AV, Vassilevski AA (2018) KV1.2 channel-specific blocker from Mesobuthus eupeus scorpion venom: Structural basis of selectivity. Neuropharmacology 143: 228–238. https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2018.09.030

  20. Luna-Ramírez K, Bartok A, Restano-Cassulini R, Quintero-Hernández V, Coronas FIV, Christensen J, Wright CE, Panyi G, Possani LD (2014) Structure, molecular modeling, and function of the novel potassium channel blocker urotoxin isolated from the venom of the Australian scorpion Urodacus yaschenkoi. Mol Pharmacol 86: 28–41. https://doi.org/10.1124/MOL.113.090183

  21. Wang X, Umetsu Y, Gao B, Ohki S, Zhu S (2015) Mesomartoxin, a new K(v)1.2-selective scorpion toxin interacting with the channel selectivity filter. Biochem Pharmacol 93: 232–239. https://doi.org/10.1016/J.BCP.2014.12.002

  22. M’Barek S, Mosbah A, Sandoz G, Fajloun Z, Olamendi-Portugal T, Rochat H, Sampieri F, Guijarro JI, Mansuelle P, Delepierre M, De Waard M, Sabatier JM (2003) Synthesis and characterization of Pi4, a scorpion toxin from Pandinus imperator that acts on K+ channels. Eur J Biochem 270: 3583–3592. https://doi.org/10.1046/J.1432-1033.2003.03743.X

  23. Corzo G, Papp F, Varga Z, Barraza O, Espino-Solis PG, Rodríguez de la Vega RC, Gaspar R, Panyi G, Possani LD (2008) A selective blocker of Kv1.2 and Kv1.3 potassium channels from the venom of the scorpion Centruroides suffusus suffusus. Biochem Pharmacol 76: 1142–1154. https://doi.org/10.1016/J.BCP.2008.08.018

  24. Olamendi-Portugal T, Bartok A, Zamudio-Zuñiga F, Balajthy A, Becerril B, Panyi G, Possani LD (2016) Isolation, chemical and functional characterization of several new K(+)-channel blocking peptides from the venom of the scorpion Centruroides tecomanus. Toxicon 115: 1–12. https://doi.org/10.1016/J.TOXICON.2016.02.017

  25. Cerni FA, Pucca MB, Peigneur S, Cremonez CM, Bordon KCF, Tytgat J, Arantes EC (2014) Electrophysiological characterization of Ts6 and Ts7, K+ channel toxins isolated through an improved Tityus serrulatus venom purification procedure. Toxins (Basel) 6: 892–913. https://doi.org/10.3390/TOXINS6030892

  26. Possani LD, Selisko B, Gurrola GB (1999) Structure and function of scorpion toxins affecting K+-channels. Perspect Drug Discov Des 150 (15): 15–40. https://doi.org/10.1023/A:1017062613503

  27. Papp F, Batista CVF, Varga Z, Herceg M, Román-González SA, Gaspar R, Possani LD, Panyi G (2009) Tst26, a novel peptide blocker of Kv1.2 and Kv1.3 channels from the venom of Tityus stigmurus. Toxicon 54: 379–389. https://doi.org/10.1016/J.TOXICON.2009.05.023

  28. Fajloun Z, Carlier E, Lecomte C, Geib S, Di Luccio E, Bichet D, Mabrouk K, Rochat H, De Waard M, Sabatier JM (2000) Chemical synthesis and characterization of Pi1, a scorpion toxin from Pandinus imperator active on K+ channels. Eur J Biochem 267: 5149–5155. https://doi.org/10.1046/J.1432-1327.2000.01577.X

  29. Péter M, Varga Z, Panyi G, Bene L, Damjanovich S, Pieri C, Possani LD, Gáspár R (1998) Pandinus imperator scorpion venom blocks voltage-gated K+ channels in human lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun 242: 621–625. https://doi.org/10.1006/BBRC.1997.8018

  30. Kharrat R, Mansuelle P, Sampieri F, Crest M, Oughideni R, Van Rietschoten J, Martin-Eauclaire MF, Rochat H, El Ayeb M (1997) Maurotoxin, a four disulfide bridge toxin from Scorpio maurus venom: purification, structure and action on potassium channels. FEBS Lett 406: 284–290. https://doi.org/10.1016/S0014-5793(97)00285-8

  31. Abdel-Mottaleb Y, Clynen E, Jalali A, Bosmans F, Vatanpour H, Schoofs L, Tytgat J (2006) The first potassium channel toxin from the venom of the Iranian scorpion Odonthobuthus doriae. FEBS Lett 580: 6254–6258. https://doi.org/10.1016/J.FEBSLET.2006.10.029

  32. Mahjoubi-Boubaker B, Crest M, Khalifa R Ben, El Ayeb M, Kharrat R (2004) Kbot1, a three disulfide bridges toxin from Buthus occitanus tunetanus venom highly active on both SK and Kv channels. Peptides 25: 637–645. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2004.02.017

  33. Jouirou B, Mosbah A, Visan V, Grissmer S, M’Barek S, Fajloun Z, Van Rietschoten J, Devaux C, Rochat H, Lippens G, El Ayeb M, De Waard M, Mabrouk K, Sabatier JM (2004) Cobatoxin 1 from Centruroides noxius scorpion venom: chemical synthesis, three-dimensional structure in solution, pharmacology and docking on K+ channels. Biochem J 377: 37–49. https://doi.org/10.1042/BJ20030977

  34. Dudina EE, Korolkova YV, Bocharova NE, Koshelev SG, Egorov TA, Huys I, Tytgat J, Grishin EV (2001) OsK2, a new selective inhibitor of Kv1.2 potassium channels purified from the venom of the scorpion Orthochirus scrobiculosus. Biochem Biophys Res Commun 286: 841–847. https://doi.org/10.1006/BBRC.2001.5492

  35. Cologna CT, Peigneur S, Rosa JC, Selistre-de-Araujo HS, Varanda WA, Tytgat J, Arantes EC (2011) Purification and characterization of Ts15, the first member of a new α-KTX subfamily from the venom of the Brazilian scorpion Tityus serrulatus. Toxicon 58: 54–61. https://doi.org/10.1016/J.TOXICON.2011.05.001

  36. Orts DJB, Peigneur S, Madio B, Cassoli JS, Montandon GG, Pimenta AMC, Bicudo JEPW, Freitas JC, Zaharenko AJ, Tytgat J (2013) Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of bunodosoma caissarum. Mar Drugs 11: 655–679. https://doi.org/10.3390/md11030655

  37. Chen P, Dendorfer A, Finol-Urdaneta RK, Terlau H, Olivera BM (2010) Biochemical characterization of kappaM-RIIIJ, a Kv1.2 channel blocker: evaluation of cardioprotective effects of kappaM-conotoxins. J Biol Chem 285: 14882–14889. https://doi.org/10.1074/JBC.M109.068486

  38. Ferber M, Sporning A, Jeserich G, DeLaCruz R, Watkins M, Olivera BM, Terlau H (2003) A novel conus peptide ligand for K+ channels. J Biol Chem 278: 2177–2183. https://doi.org/10.1074/JBC.M205953200

  39. Ferber M, Al-Sabi A, Stocker M, Olivera BM, Terlau H (2004) Identification of a mammalian target of κM-conotoxin RIIIK. Toxicon 43: 915–921. https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2003.12.010

  40. Tytgat J, Debont T, Carmeliet E, Daenens P (1995) The alpha-dendrotoxin footprint on a mammalian potassium channel. J Biol Chem 270: 24776–24781. https://doi.org/10.1074/JBC.270.42.24776

  41. Swanson R, Marshall J, Smith JS, Williams JB, Boyle MB, Folander K, Luneau CJ, Antanavage J, Oliva C, Buhrow SA, Bennet C, Stein RB, Kaczmarek LK (1990) Cloning and expression of cDNA and genomic clones encoding three delayed rectifier potassium channels in rat brain. Neuron 4: 929–939. https://doi.org/10.1016/0896-6273(90)90146-7

  42. Hurst RS, Busch AE, Kavanaugh MP, Osborne PB, North RA, Adelman JP (1991) Identification of amino acid residues involved in dendrotoxin block of rat voltage-dependent potassium channels. Mol Pharmacol 40.

  43. Robertson B, Owen D, Stow J, Butler C, Newland C (1996) Novel effects of dendrotoxin homologues on subtypes of mammalian Kv1 potassium channels expressed in Xenopus oocytes. FEBS Lett 383: 26–30. https://doi.org/10.1016/0014-5793(96)00211-6

  44. Hopkins WF, Demas V, Tempel BL (1994) Both N- and C-terminal regions contribute to the assembly and functional expression of homo- and heteromultimeric voltage-gated K+ channels. J Neurosci 14: 1385–1393. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.14-03-01385.1994

  45. Hopkins WF, Allen ML, Houamed KM, Tempel BL (1994) Properties of voltage-gated K+ currents expressed in Xenopus oocytes by mKv1.1, mKv1.2 and their heteromultimers as revealed by mutagenesis of the dendrotoxin-binding site in mKv1.1. Pflugers Arch 428: 382–390. https://doi.org/10.1007/BF00724522

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал