Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 8, стр. 933-939

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было выполнено на 154 крысах-самцах линии Вистар массой 250–300 г. Все процедуры регулировались Директивой 2010/63/ЕС Европейского парламента и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованных Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH № 85-23, пересмотренная в 1996 г.). Этический комитет НИИ кардиологии Томского национального исследовательского медицинского центра одобрил данное исследование (протокол № 207 от 23 декабря 2020 г.).

Животные были разделены на 11 групп по 14 крыс в каждой. Крыс 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й и 6-й групп (групп нормоксического контроля) содержали в стандартных условиях вивария. Животных 7-й, 8-й, 9-й, 10-й и 11-й групп (опытных групп) подвергали кратковременной НГ, используя 6 последовательных циклов гипоксии–реоксигенации: НГ (10 мин) и реоксигенация (10 мин). Гипоксию осуществляли, помещая животных в герметичный сосуд объемом 3.3 л, внутри которого формировали воздушную среду с пониженным содержанием кислорода (8% О₂, 0.9% СО₂ и 91.1% N₂). Затем следовал 10-минутный сеанс реоксигенации (21% O₂). Газовый состав воздуха определяли с помощью газоанализатора Stat Profile M (Nova Biomedical Corporation, Waltham, США). Общая продолжительность НГ составляла 2 ч. Через 30 мин после НГ выполняли коронароокклюзию.

Всех животных перед началом хирургических манипуляций наркотизировали введением α-хлоралозы (100 мг/кг, внутрибрюшинно) и подключали к аппарату искусственной вентиляции легких SAR-830 Series (CWE Inc., США). Перед моделированием коронароокклюзии животным вводили следующие фармакологические агенты: 1-я группа – внутривенно 0.9%-ный раствор NaCl (1 мл/кг) за 10 мин до коронароокклюзии; 2-я группа – внутривенно 20%-ный раствор гидроксипропил-β-циклодекстрина (1 мл/кг) за 10 мин до коронароокклюзии; 3-я группа – ингибитор всех изоформ NO-синтазы N-ω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME) в дозе 10 мг/кг внутривенно за 10 мин до коронароокклюзии [5]; 4-я и 10-я группы – ингибитор индуцибельной NO-синтазы (iNOS) S-метилтиомочевины сульфат в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно за 10 мин до коронароокклюзии [6]; 5-я и 11-я группы – ингибитор нейрональной NO-синтазы (nNOS) 7-нитроиндазол в дозе 50 мг/кг внутривенно [5]. Животным 6-й группы внутривенно вводили донор NO диэтилентриамин (Diethylenetriamine/nitric oxide, DETA/NO) в дозе 2 мг/кг (инфузия в течение 5 мин) за один час до коронароокклюзии [3]. Крысам 8-й группы внутривенно вводили L-NAME (10 мг/кг) за 15 мин до НГ. Животным 9-й группы внутривенно вводили L-NAME (10 мг/кг) после НГ за 10 мин до коронароокклюзии.

L-NAME, S-метилтиомочевина, 7-нитроиндазол, DETA/NO были закуплены в компании Sigma-Aldrich (St. Louis, США). 7-нитроиндазол первоначально растворяли в 0.1 мл диметилсульфоксида (DMSO), а затем – в 0.9 мл 20%-ного раствора гидроксипропил-β-циклодекстрина (Tocris Bioscience, Bristol, Великобритания); L‑NAME, S-метилтиомочевину, DETA/NO растворяли в 0.9%-ном растворе NaCl. Все растворы готовили немедленно перед использованием. В связи с тем, что часть препаратов растворяли в 0.9%-ном NaCl, а часть – в 0.9 мл 20%-ного гидроксипропил-β-циклодекстрина, были сформированы две контрольные группы, которым вводили данные растворители.

Регистрацию артериального давления осуществляли с помощью датчика давления SS13L (BiopacSystem Inc., США), сопряженного с аппаратом MP35 (BiopacSystemInc., Goleta, США). Измерение артериального давления осуществляли с помощью канюлирования правой сонной артерии. Для этого в сонную артерию вводили канюлю, подключенную к датчику давления SS13L. Прибор MP35 использовался и для регистрации ЭКГ.

Для выполнения коронароокклюзии вскрывали грудную клетку, сердце освобождали от перикарда и выводили за пределы грудной клетки наружу. Затем накладывали лигатуру на левую коронарную артерию в ее верхней части на 45 мин. Реперфузия осуществлялась путем снятия лигатуры. Длительность реперфузии составляла 2 ч.

Для определения размера инфаркта сердце извлекали, канюлировали аорту, промывали физиологическим раствором, затем вновь накладывали лигатуру и вводили 5%-ный раствор перманганата калия для отделения зоны гипоперфузии (зоны риска) от интактного миокарда. После удаления перманганата калия левый желудочек рассекали на срезы толщиной 1 мм, которые окрашивали в 1%-ном растворе 2,3,5-трифенилтетразолия при 37°С в течение 30 мин и фиксировали в течение 24 ч в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Готовые срезы сканировали на сканере Scanjet G2710, планиметрически определяя размеры зон некроза и зон риска (ишемии) с помощью программы Ellipse 2.02 (ViDiTo, Чешская республика). Величину инфаркта выражали процентным соотношением площади зоны инфаркта к зоне риска (ЗИ/ЗР).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 13.0. Для оценки достоверности полученных результатов использовали критерий Манна–Уитни. Достоверными считались различия при p < 0.05. Результаты экспериментов выражали как среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего (SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Было установлено, что соотношение ЗИ/ЗР у неадаптированных крыс, которым вводили гидроксипропил-β-циклодекстрин или физиологический раствор, составляет около 50%. Разницы по ЗИ/ЗР между этими группами животных не обнаружено. Коронароокклюзия и реперфузия не оказывали достоверного эффекта на частоту сердечных сокращений и артериальное давление. Ни в данной серии эксперимента, ни в последующих сериях мы не наблюдали летальности при воздействии НГ или при выполнении коронароокклюзии–реперфузии.

Было установлено, что НГ способствует уменьшению соотношения ЗИ/ЗР на 30% (рис. 1). Предварительное введение L-NAME за 15 мин до НГ полностью устраняло инфаркт-лимитирующий эффект НГ. Инъекция L-NAME за 10 мин до коронароокклюзии не влияла на кардиопротекторный эффект НГ. Эти данные указывают на то, что NO является триггером, но не конечным эффектором НГ-индуцированной толерантности сердца к И/Р. Введение ингибитора iNOS S-метилтиомочевины за 15 мин до НГ нивелировало кардиопротекторный эффект адаптации к гипоксии. Ингибитор nNOS 7-нитроиндазол не влиял на инфаркт-лимитирующий эффект НГ. Следует отметить, что L-NAME, 7-нитроиндазол, S-метилтиомочевина не влияли на соотношение ЗИ/ЗР у неадаптированных крыс. L-NAME вызывал снижение частоты сердечных сокращений и увеличивал систолическое артериальное давление.

Рис. 1.

Влияние ингибиторов NO-синтазы и донора NO диэтилентриамина на размер инфаркта у крыс после курса НГ. IS/AAR – отношение зоны некроза к зоне риска, NH – нормобарическая гипоксия (НГ); * – р < 0.05 по сравнению с контрольной группой (0.9%-ный раствор NaCl), # – р < 0.05 по сравнению с группой НГ, U-критерий Манна–Уитни.

Эти данные указывают на то, что триггером НГ-индуцированной толерантности сердца к И/Р является NO, синтезируемый iNOS. Донор оксида азота DETA/NO также увеличивал устойчивость сердца к И/Р. DETA/NO не оказывал достоверного эффекта на частоту сердечных сокращений и артериальное давление.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Мишенью для действия оксида азота на сердце являются кардиомиоциты и гладкомышечные клетки коронарных артерий [7–10]. Хорошо известно, что NO-синтаза принимает участие в повышении толерантности сердца к И/Р при ишемическом пре- и пост-кондиционировании [11, 12]. С учетом схожести эффектов пре-, посткондиционирования и НГ, мы выдвинули предположение о важной роли NO-синтазы в механизме формирования кардиопротекторного эффекта НГ [13, 14]. Однако вопрос об участии отдельных изоформ NOS оставался открытым. Предполагалось, что медиаторами НГ являются iNOS [14] и эндотелиальная NO-синтаза [13]. Нами было подтверждено, что блокада iNOS нивелирует инфаркт-лимитирующий эффект НГ, в то время как nNOS не участвует в реализации данного кардиозащитного эффекта. Факт участия iNOS в повышении толерантности сердца к И/Р предоставил возможность имитировать инфаркт-лимитирующий эффект НГ. Предполагалось, что применение донора NO будет способствовать уменьшению размера инфаркта у интактных животных. Данная гипотеза была подтверждена, и нами было показано, что внутривенное введение DETA/NO за 1 ч до моделирования коронароокклюзии–реперфузии оказывает кардиопротекторный эффект, который выражался в уменьшении размера инфаркта.

Известно, что многие опосредованные NO эффекты связаны с активацией оксидом азота растворимой гуанилилциклазы (рГЦ) и повышением уровня циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) [15–17]. Кроме того, оксид азота способен взаимодействовать с сульфгидрильными группами белков, что приводит к образованию S-нитрозотиола (SNO) и посттрансляционной модификации протеинов, известной как S-нитрозилирование белков [18, 19]. Считается, что оба пути важны для кардиопротекции. Активация рГЦ с последующим повышением уровня цГМФ приводит к активации протеинкиназы G, которая активирует митохондриальный К_АТФ-канал с последующим повышением стабильности митохондриальной поры переменной проницаемости (mPTP, mitochondrial permeability transition pore) [15]. Повышение стабильности mPTP приводит к тому, что митохондрии кардиомиоцитов не подвергаются кальциевой перегрузке, снижается продукция активных форм кислорода и вероятность развития окислительного стресса [21].

Нитрозилирование играет важную роль в реализации кардиопротекторного эффекта ишемического прекондиционирования [20, 22]. Известно, что NO приводит к активации PKCε, митохондриальных К_АТФ-каналов и ингибированию открытия mPTP [22]. Вероятно, эти же молекулярные механизмы задействованы при при воздействии кратковременной НГ.

Таким образом, возможные механизмы кардиопротекторного действия кратковременной нормобарической гипоксии и NO включают каскады внутриклеточных трансмиттеров с активацией митохондриальных К_АТФ-каналов и повышением устойчивости mPTP, которые, по всей видимости, являются конечными эффекторами. Полученные нами данные указывают на то, что оксид азота является триггером, но не конечным эффектором кардиопротекторного эффекта кратковременной нормобарической гипоксии.