Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2022, T. 108, № 9, стр. 1222-1238

Соблюдении биоэтических норм

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям Комиссии по контролю содержания и использования лабораторных животных (IACUC) Национального медицинского исследовательского цента им. В.А. Алмазова.

Проведенное нами исследование включало два этапа.

На первом этапе мы изучали потенциальные защитные свойства иНГЛТ-2 при введении их в течение 7 дней до моделирования ишемического инсульта животным без нарушений углеводного обмена. Такой дизайн исследования позволяет создать “чистую” модель ОНМК и феноменологически подтвердить наличие у препарата самостоятельного нейропротективного эффекта, не связанного с его положительным влиянием на гликемический профиль.

Задачей второго этапа было изучение возможных механизмов реализации нейротропного эффекта высоко- и низкоселективных иНГЛТ-2. Для этого мы воспроизводили СД 2-го типа, рассматривая его как модель хронического повреждения головного мозга. Мы отказались от попытки исследования нейропротективных свойств препаратов на фоне моделирования острой ишемии, так как механизмы защиты в условиях острого состояния принципиально сходны и сводятся преимущественно к противовоспалительному, антиапоптотическому и другим эффектам. Механизмы же реализации защитного эффекта препаратов именно в условиях хронического повреждения представляют научный и практический интерес.

Первый этап

Исследование проводилось на крысах-самцах стока Вистар (масса 420–470 г), n = 32.

Крысы содержались не более, чем по 5 голов в одной клетке при неограниченном потреблении корма и воды, при фиксированном световом режиме 12.00 : 12.00 ч (свет : темнота). Температура поддерживалась в пределах 22–25°С, относительная влажность – 50–70%.

Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. В течение карантина проводился ежедневный осмотр каждого животного. Оценивались окраска кожи и видимых слизистых, поведение, характер двигательной активности, наличие судорог, изменение характера дыхательных движений, положение хвоста. Взвешивание производилось при поступлении животных и в период карантина – не реже 1 раза в неделю. Животные, имевшие отклонения по массе тела, общему состоянию или поведению, не были включены в эксперимент.

Были сформированы следующие группы животных:

• Группа “КОНТРОЛЬ” (n = 12) – введение 0.9%-ного раствора NaCl 1 мл per os, 1 раз в день, 7 дней до ишемии мозга;

• Группа “ЭМПА” (n = 8) – терапия эмпаглифлозином per os 2 мг/кг, 1 раз в день, 7 дней до ишемии мозга;

• Группа “КАНА” (n = 8 ) – терапия канаглифлозином per os 25 мг/кг, 1 раз в день, 7 дней до ишемии мозга.

Ежедневно в одно и то же время производилось измерение массы тела крыс всех групп, а также массы потребляемого корма.

Кроме того, трехкратно (на второй, четвертый и шестой дни эксперимента) производилось определение уровня гликемии. Гликемия оценивалась в одно и то же время, при этом животное находилось на свободном потреблении корма. Производилась пункция хвостовой вены, после чего содержание глюкозы в полученной капле венозной крови определялось при помощи прибора определения гликемии и кетонемии StatStrip (Nova Biomedical, США). Нормальными считались значения гликемии от 3.3 до 7.8 ммоль/л, поскольку измерение производилось в течение дня (не натощак).

Транзиторная фокальная ишемия головного мозга воспроизводилась по достижении хирургической стадии наркоза (Золетил + Ксилазин в/м) с помощью модели транзиторной окклюзии левой средней мозговой артерии по методике Koizumi с соавт. в модификации Longa [10]. Методика заключается во введении окклюдера – нити длиной 20–22 мм (Doccol Corporation, США) во внутреннюю сонную артерию на глубину 20–22 мм до места отхождения средней мозговой артерии, устье которой перекрывается вводимым окклюдером. В результате введения нити происходит ишемизация мозга в бассейне левой средней мозговой артерии. Верификация снижения регионарного кровотока на фоне окклюзии осуществлялась при помощи допплерографии (Минимакс-Допплер-К модель НБ, Россия). Доступ к корковой ветви левой средней мозговой артерии производился через трепанационное окно. Уменьшение линейной скорости кровотока на 70% и более по сравнению с исходной свидетельствовало о наличии ишемии в исследуемом бассейне. Длительность окклюзии составляла 30 мин, после чего нить извлекалась, рана ушивалась.

Во время проведения оперативного вмешательства, а также в послеоперационном периоде до момента прекращения действия наркоза производился динамический контроль гликемии при помощи повторных пункций хвостовой вены, а также контроль ректальной температуры животного, которая поддерживалась на уровне 37.0°C при помощи терморегулирующего столика.

После моделирования ишемии (с момента выхода из наркоза) каждое животное было помещено в отдельную клетку.

В течение последующих двух суток (48 ч) не менее 3 раз в сутки осуществлялось определение гликемии по указанной выше методике.

Животные всех групп в течение реперфузионного периода получали 1 мл 0.9%-ного раствора NaCl per os 1 раз в день. Введение исследуемых препаратов было прекращено, так как целью исследования было изучение их протективных свойств только при применении до инсульта, в качестве агентов прекондиционирования.

Через 48 ч реперфузии во всех группах оценивался неврологический дефицит по шкале Garcia [11]. Данная шкала включает параметры, позволяющие выявлять сенсорные и моторные нарушения у животных, перенесших фокальную ишемию головного мозга в бассейне левой средней мозговой артерии. В соответствии с данной шкалой здоровое животное имеет 18 баллов, в то время как максимально выраженный неврологический дефицит характеризуется 3 баллами (табл. 1).

После оценки неврологического дефицита производилось извлечение материала головного мозга для определения объема повреждения при помощи окраски срезов мозга 1%-ным раствором трифенилтетразолия хлорида. Для этого изготавливались пять срезов головного мозга толщиной 2 мм. Срезы мозга инкубировались в 1%-ном растворе трифенилтетразолия хлорида (MP Biomedicals, США) в течение 15 мин при температуре 37°С и рН 7.4. После инкубации обе поверхности всех срезов фотографировались цифровой камерой Olympus C-4000, сопряженной с помощью микрофотографического устройства с микроскопом МБС10 (ЛОМО, Санкт-Петербург). Цифровые изображения срезов в последующем обрабатывались компьютерным методом с помощью программ ImageJ, Adobe Photoshop 8.0, которые позволяют рассчитать площадь зоны некроза. Затем при помощи суммации результата по всем срезам вычислялся объем повреждения мозга,по отношению к общему объему мозга (в %).

Дизайн первого этапа исследования представлен на рис. 1.

Рис. 1.

Дизайн первого этапа эксперимента. – взятие крови из хвостовой вены для определения гликемии. Transient focal 30-min brain ischemia – транзиторная фокальная 30-минутная ишемия мозга. Neurological deficiency evaluation – оценка неврологического дефицита. Brain damage volume measurement – измерение объема повреждения мозга.

Второй этап

На втором этапе исследования крысы-самцы стока Вистар, n = 25, (масса 200–255 г) по истечении акклиматизационного периода (14 дней) в течение 28 дней содержались на диете с высоким содержанием насыщенных жиров (22%) – общая экспериментальная группа.

Через 4 недели у всех животных определялась гликемия посредством пункции хвостовой вены, как описано выше, при помощи прибора определения гликемии и кетонемии StatStrip (Nova Biomedical, США), затем вводился раствор никотинамида (Nicotimamide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США) 230 мг/кг внутрибрюшинно в качестве панкреатопротектора, через 15 мин – раствор стрептозотоцина (Streptozocin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США) 60 мг/кг внутрибрюшинно в качестве панкреатотоксина [12].

В течение всего последующего эксперимента крысы общей экспериментальной группы продолжали находиться на диете с повышенным содержанием насыщенных жиров.

На вторые и третьи сутки после введения стрептозотоцина и никотинамида производилось определение гликемии по описанной методике. При выявлении в 2 измерениях, выполненных в разные дни, гликемии больше 11.1 ммоль/л диагностировался СД [13, 14]. При обнаружении меньших значений гликемии хотя бы в одном из измерений выполнялся пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ). Измерение гликемии производилось исходно (натощак), а также через 15, 30 и 60 мин после зондового введения 40%-ного раствора глюкозы в расчете 3 г/кг массы тела животного. При определении гликемии натощак нормальными значениями считались до 6.1 ммоль/л, уровень 6.1–7.0 ммоль/л расценивался как “серая” зона, гликемия больше 7.0 ммоль/л натощак соответствовала критериям СД. При выявлении во время ПГТТ, после введения глюкозы, в любой из точек гликемии 11.1 ммоль/л и больше, при наличии или отсутствии гипергликемии натощак, диагностировался СД. При выявлении меньших значений данная патология не подтверждалась, и животные исключались из дальнейшего эксперимента.

Наблюдение за животными продолжалось еще 28 дней с момента индукции СД. При появлении на данном этапе симптомов, характерных для абсолютной инсулиновой недостаточности, то есть клинической картины СД 1-го типа (полидипсия, полиурия, интенсивная потеря массы тела), эти животные исключались из дальнейшего эксперимента.

Через 28 дней животные были разделены на группы (n = 5 в каждой):

• Группа “СД” – СД без лечения (56 дней);

• Группа “СД + ЭМПА” – терапия эмпаглифлозином per os 2 мг/кг 1 раз в день 56 дней;

• Группа терапия “СД + КАНА” – терапия канаглифлозином per os 25 мг/кг 1 раз в день 56 дней.

Также была создана группа здоровых животных “Контроль” (n = 5), которые находились на стандартном корме и не подвергались никаким интервенциям в течение всего эксперимента.

Во всех группах на протяжении всего эксперимента 1 раз в 2 дня измерялись масса животных и масса потребленного корма.

Через 8 недель проведения соответствующей терапии выполнялась эвтаназия, затем головной мозг животных аккуратно извлекали с сохранением мягкой мозговой и паутинной оболочек, фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [15], обезвоживали и заливали в парафин обычным способом. Морфологическому исследованию подвергали фронтальные срезы конечного мозга толщиной 5 мкм на уровне –3.36 мм ± 0.12 мм относительно брегмы согласно анатомического атласу [16].

Выявление микроглиоцитов в структурах переднего мозга осуществляли при помощи иммуноцитохимического маркирования с использованием козьих поликлональных антител к Iba-1 в разведении 1 : 1000 (Abсam, Великобритания). В качестве вторичных реагентов использовали набор VECTASTAIN Universal Quick HRP kit (Vector Labs, США). Пероксидазную метку выявляли с использованием диаминобензидинового хромогена (DAB+; Аgilent, США).

Дизайн второго этапа исследования показан на рис. 2.

Рис. 2.

Дизайн второго этапа исследования. CRL, Контроль – группа “КОНТРОЛЬ”, DM, СД – группа “СД”, DM + EMPA, СД + ЭМПА – группа “СД + ЭМПА”, DM + CANA, СД + КАНА – группа “СД + КАНА”, N/A, Н/А – никотинамид, STR, СТР – стрептозотоцин. – взятие крови из хвостовой вены для определения гликемии. – иммуногистохимическое исследование головного мозга

Статистический анализ

Статистическая обработка данных производилась при помощи программного пакета IBM SPSS Statistics-22 (IBM, США) и Statistica-10 (Statsoft, США). Статистический анализ производился при помощи непараметрических методов. Значимость различий между группами оценивалась с помощью непараметрического критерия Крускала–Уоллеса и Манна–Уитни для независимых выборок, с применением непараметрического дисперсионного анализа (апостериорное попарное сравнение групп при помощи критерия Данна). Все показатели представлены в виде “медиана (25%; 75%)”. Значения p меньше 0.05 рассматривались как значимые.

Первый этап

Применение как ЭМПА, так и КАНА у здоровых животных привело к замедлению физиологической прибавки массы тела по сравнению с контрольной группой, не получавшей терапии. При этом различий в динамике массы тела между группами “ЭМПА” и “КАНА” не было (рис. 3а).

Рис. 3.

Динамика массы тела и потребления корма у животных в ходе первого этапа исследования. (а) Динамика массы тела. (b) Динамика потребления корма. *– р < 0.05 по сравнению с группой “Контроль”, § – р < 0.05 между группами “ЭМПА” и “КАНА”.

Потребление корма у животных, получавших КАНА, первоначально имело тенденцию к снижению, однако с четвертого дня наблюдения, напротив, стало нарастать и достоверно превысило таковое в контрольной группе. На фоне терапии ЭМПА имела место противоположная тенденция. Так, первоначально потребление корма в этой группе было стабильно высоким, однако в дальнейшем стало снижаться (рис. 3b).

На фоне применения обоих иНГЛТ-2 в течение 7 дней у животных без СД уровень гликемии оставался в пределах нормы, эпизодов гипогликемии зафиксировано не было (табл. 2).

Мониторинг гликемии во время оперативного вмешательства, моделирования транзиторной фокальной ишемии головного мозга, показал, что применение обоих иНГЛТ-2 предотвращает интраоперационную гипергликемию, имевшую место в контрольной группе на фоне применения наркоза. При этом эпизодов гипогликемии также зафиксировано не было (табл. 3).

В табл. 4 представлены средние значения гликемии в течение первых и вторых суток в исследуемых группах. Необходимо отметить, что в течение первых суток, на фоне продолжавшегося действия наркоза, до восстановления сознания и возможности потреблять пищу, у 2 животных в группе “ЭМПА” и 3 животных в группе “КАНА” наблюдались эпизоды гипогликемии. Так, минимальные зафиксированные значения гликемии составили 2.8 и 3.1 ммоль/л в группах “ЭМПА” и “КАНА” соответственно. Это потребовало неотложных мероприятий по купированию гипогликемии – введения 5%-ного раствора глюкозы подкожно, а после восстановления сознания – 40%-ного раствора глюкозы через желудочный зонд. Эти животные были исключены из дальнейшего анализа. С учетом полученных данных, в последующем мы производили подкожное введение 5%-ного раствора глюкозы по окончании оперативного вмешательства для предотвращения гипогликемии, а также при появлении тенденции к низко-нормальной гликемии повторно в течение первых суток, до выхода из наркоза.

В связи с необходимостью исключения указанных пяти животных из эксперимента в дальнейшем группы “ЭМПА” и “КАНА” были дополнены еще двумя и тремя крысами соответственно – с целью сохранения исходно запланированного количества животных в группах.

При оценке выраженности неврологического дефицита при помощи шкалы Garcia мы не выявили достоверных различий между группами “ЭМПА”, “КАНА” и “Контроль” (рис. 4).

Рис. 4.

Неврологический статус, оценка по шкале Garcia [11]. Максимальный неврологический дефицит = 3 балла, здоровое животное = 18 баллов.

При этом применение как ЭМПА, так и КАНА в течение 7 дней до моделирования транзиторной фокальной ишемии головного мозга привело к достоверному уменьшению объема повреждения ткани мозга по сравнению с группой контроля. Достоверных различий в выраженности инфаркт-лимитирующего эффекта между группами “ЭМПА” и “КАНА” не было (рис. 5).

Рис. 5.

Объем повреждения мозга в результате моделирования транзиторной фокальной ишемии. (а) – размер инфаркта мозга, представленный в виде точечных графиков с медианой, (b) – репрезентативные срезы головного мозга. * – р < 0.05, по сравнению с группой “Контроль”.

Летальности в ходе проведения оперативного вмешательства и в послеоперационном периоде не было, в связи с чем из эксперимента выбыли только животные, у которых была зафиксирована гипогликемия (n = 5).

Второй этап

При моделировании СД в ходе проведения ПГТТ у одного животного не удалось зафиксировать нарушений углеводного обмена (уровень гликемии не выходил за пределы нормы натощак и во всех точках измерения после введения раствора глюкозы), у трех животных значения гликемии находились в “серой” зоне, что соответствовало нарушению толерантности к глюкозе. Эти животные были исключены из дальнейшего эксперимента. У одного животного после моделирования СД развилась симптоматика, характерная для СД 1-го типа (обильное потребление жидкости, полиурия и интенсивная потеря массы тела) – это животное также было исключено. Таким образом, опыт был продолжен на 20 крысах (по 5 крыс в каждой группе).

Развитие СД 2-го типа сопровождалось более интенсивным набором массы тела по сравнению с группой контроля с отсутствием нарушений углеводного обмена. При этом набор массы тела был сопоставим в группах “СД” и “СД + КАНА”, в то время как в группе “СД + ЭМПА” данный параметр был достоверно выше (рис. 6а). В то же время потребление корма было сходным в группах “СД” без лечения, а также на фоне обоих вариантов сахароснижающей терапии (в группах “СД + ЭМПА” и “СД + КАНА”) и превышало таковое в группе “Контроль” (рис. 6b).

Рис. 6.

Динамика массы тела и потребления корма в ходе второго этапа исследования. (а) – динамика массы тела. (b) – динамика потребления корма. * – р < 0.05 по сравнению с группой “Контроль”, § – р < 0.05 по сравнению с группой “СД”, # – р < 0.05 между группами “ЭМПА” и “КАНА”.

Уровень гликемии в группе “СД” был достоверно выше, чем в группе “Контроль” на протяжении всего эксперимента. Применение как ЭМПА, так и КАНА вызвало стойкую нормализацию гликемического профиля, достоверных различий между сахароснижающей эффективностью данных двух препаратов не было. Эпизодов гипогликемии не наблюдалось (рис. 7).

Рис. 7.

Динамика гликемии в ходе второго этапа исследования. STR – стрептозотоцин. * – р < 0.05 по сравнению с группой “Контроль”, § - р < 0.05 по сравнению с группой “СД”.

Иммуногистохимическое исследование с использованием специфического маркера микроглии Iba-1 выявило присутствие рамифицированной микроглии во всех областях головного мозга. Проведенный количественный анализ показал, что в зоне stratum radiatum СА1 области гиппокампа у животных группы “СД” количество клеток микроглии достоверно больше, чем у здоровых животных контрольной группы. Данная зона была выбрана для анализа в связи с тем, что нейроны области СА1 гиппокампа высокочувствительны к разного рода воздействиям. В зоне stratum radiatum проходят дендриты этих нейронов, на повреждение которых реагирует микроглия. Кроме того, изучаемая область имеет хорошо определяемые слои, что позволяет проводить сравнения данной области у разных животных.

Применение ЭМПА приводило к уменьшению числа клеток микроглии в исследуемой зоне по сравнению с группой “СД” – количество микроглиоцитов в группе “СД + ЭМПА” не отличалось от такового в контрольной группе. Терапия КАНА достоверно не повлияла на данный показатель (рис. 8).

Рис. 8.

Результаты иммуногистохимической реакции на микроглиальный маркер Iba-1. (a)–(d) – микрофотографии области CA1 гиппокампа (1) и stratum radiatum (2): (a) – “Контроль”, (b) – “СД”, (с) – “СД + КАНА”, (d) – “СД + ЭМПА”. Масштабный отрезок равен 20 мкм. (e) – количество Iba-1-иммунопозитивных клеток на 1 мм² в зоне stratum radiatum области CA1 гиппокампа. * – р < 0.05 по сравнению с группой “Контроль”, § – р < 0.05 по сравнению с группой “СД”.