Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 10, стр. 1414-1429

ВВЕДЕНИЕ

Среди причин нарушений продукции андрогенов и снижения фертильности у мужчин важное место занимают патологическое ожирение и метаболические расстройства, сопровождаемые ожирением, такие как сахарный диабет 2-го типа (СД2), метаболический синдром, стеатоз печени [1–5]. Имеются клинические данные о значимом снижении уровня тестостерона у мужчин с ожирением [1, 2, 4], а также о нарушении функций гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной (ГГТ) оси, развитии гипогонадотропных состояний и андрогенном дефиците у подростков пубертатного возраста с явно выраженным ожирением [6, 7]. Получены доказательства негативного влияния диета-индуцированного ожирения (ДИО) на тестикулярный стероидогенез и фертильность у самцов обезьян, крыс и мышей, а также установлены причинно-следственные взаимосвязи между андрогенным дефицитом и ожирением [3, 8, 9]. Среди факторов, провоцирующих андрогенную недостаточность при ожирении, можно выделить инсулиновую и лептиновую резистентность, гипергликемию, дислипидемию, липотоксичность, усиление воспалительных процессов, нарушение окислительно-восстановительного баланса, причем эти факторы могут действовать на различные компоненты ГГТ оси – продуцирующие гонадолиберин гипоталамические нейроны, гонадотрофы аденогипофиза и тестикулярные клетки, в том числе на синтезирующие тестостерон клетки Лейдига [2, 10].

Повышение уровня тестостерона у пациентов с ожирением с помощью заместительной терапии препаратами андрогенов и гонадотропинов, бариатрических операций и низкокалорийной диеты приводит к нормализации массы тела, снижению доли жировой ткани, улучшению липидного метаболизма [5, 11–15]. Однако терапия андрогенами и гонадотропинами имеет ряд побочных эффектов, включая нарушение кроветворения и липидного баланса. Наряду с этим, для нее характерен синдром отмены, когда после прекращения лечения функциональные нарушения в ГГТ оси возвращаются и в ряде случаев даже прогрессируют [16–18]. Возможной альтернативой такой терапии является применение аллостерических регуляторов рецептора лютеинизирующего гормона (ЛГР). В отличие от гонадотропинов – хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и лютеинизирующего гормона (ЛГ), аллостерические регуляторы сравнительно мягко активируют ЛГР, более селективны в отношении внутриклеточных сигнальных каскадов, не вызывают десенситизации ЛГР и резистентности клеток-мишеней к эндогенному ЛГ, как это показано нами ранее для производных тиено[2,3-d]-пиримидина [19–22]. Другим подходом может быть применение препаратов, снижающих массу тела и жировой ткани и улучшающих гормональные и метаболические показатели при ожирении, и здесь наибольший интерес представляет метформин (МФ) – препарат, широко применяемый для лечения СД2 и метаболического синдрома. Имеются данные, что МФ при этих заболеваниях может восстанавливать сперматогенез и андрогенный статус, хотя также получены результаты, которые не поддерживают точку зрения о положительном влиянии МФ на репродуктивные функции при СД2 и метаболическом синдроме [23–26].

Несмотря на имеющийся прогресс в отношении коррекции андрогенного дефицита при метаболических расстройствах, эффективность и механизмы действия гонадотропинов, обладающих ЛГ-активностью, и МФ на стероидогенную активность тестикулярных клеток при ожирении без явных признаков нарушений панкреатических β-клеток остаются малоизученными, а для аллостерических ЛГР-агонистов такие данные вовсе отсутствуют. Нет сведений о влиянии комбинированного применения МФ и ЛГР-агонистов на продукцию тестостерона при ожирении. Влияние аллостерических ЛГР-агонистов на экспрессию гипофизарных генов, кодирующих компоненты системы синтеза гонадотропинов, до настоящего времени не исследовано, а для диета-индуцированного ожирения (ДИО) такие сведения отсутствуют и для ХГЧ, и для МФ. Поскольку ожирение тесно связано с андрогенным дефицитом и гипогонадотропными состояниями, то такие исследования имеют несомненное практическое значение. Целью работы было изучить эффекты длительной (5 нед.) терапии МФ и пятидневной обработки ЛГР-агонистами, ХГЧ и разработанным нами тиено[2,3-d]-пиримидиновым производным ТП03 на уровень тестостерона в крови и на экспрессию тестикулярных генов, ответственных за стероидогенез, и гипофизарных генов, вовлеченных в синтез и секрецию гонадотропинов, у самцов крыс с ожирением, вызванным длительной высокожировой диетой. Наряду с раздельным применением препаратов, исследовали введение ЛГР-агонистов на фоне МФ терапии, чтобы проверить возможность потенцирующего влияния МФ на их эффекты. Ранее нами было продемонстрировано усиление стероидогенных эффектов ЛГР-агонистов при их однократном введении самцам крыс с СД2, длительное время леченных МФ [21]. Выбор ТП03 обусловлен его отчетливо выраженной стероидогенной активностью, показанной нами ранее у контрольных, диабетических и стареющих самцов крыс [20].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали самцов крыс линии Wistar, которым в начале эксперимента было два месяца. Ожирение и ассоциированные с ним метаболические и гормональные расстройства вызывали переводом двухмесячных самцов крыс на высокожировую диету, которая включала 52.4% жира (свиного сала), 41.7% творога, 5% паштета (свиная печень), 0.5% метионина, 0.2% дрожжей и 0.2% поваренной соли (NaCl) [27]. Крысы на протяжении 23 нед. получали ежедневно по 5–7 г высокожировой смеси, дополнительно к стандартному рациону (гранулированный сухой корм). Контрольная группа животных того же возраста получала только гранулированный сухой корм.

Перед началом лечения отбирали крыс с повышенным содержанием глюкозы в крови (выше 7.0 мМ) через 120 мин после глюкозной нагрузки в интраперитонеальном глюкозотолерантном тесте (ИГТТ, 2 г глюкозы/животное, в/б), а также с повышенной массой тела, рассматривая их как группу с ожирением и нарушенной толерантностью к глюкозе. Затем крыс с ожирением случайным образом распределяли на экспериментальные группы (в каждой n = 18), одна из которых (группа “ОЖ + МФ”) в течение 5 нед. получала МФ (“Sigma”, США; 120 мг/кг/сутки, перорально через зонд), другая (группа “ОЖ”) вместо МФ получала плацебо (водный раствор). Обе группы до конца эксперимента продолжали получать пищу с высоким содержанием насыщенных жиров. За неделю до окончания эксперимента, перед обработкой животных ЛГР-агонистами, проводили повторный ИГТТ для изучения чувствительности к глюкозе и инсулинового и лептинового ответа на глюкозную нагрузку, оценивая уровни глюкозы, инсулина и лептина в крови через различные временные интервалы после введения глюкозы. Для определения уровня глюкозы использовали глюкометр и тест-полоски “One-Touch Select Ultra” (США), для определения концентрации инсулина и лептина – наборы “Rat Insulin ELISA” (“Mercodia AB”, Швеция) и “ELISA Kit for Leptin” (Cloud-Clone Corp., США). В крови животных оценивали уровни гликированного гемоглобина (HbA1c), общего холестерина и триглицеридов, для чего использовали набор “Multi Test HbA1c System kit” (“Polymer Technology Systems, Inc.”, США) и тест-полоски “Cholesterol multiCare-in” и “Triglycerides multiCare-in” (“Biochemical Systems Int.”, Италия). На следующий день после ИГТТ оценивали уровни тестостерона в крови животных на протяжении шестичасового временного промежутка (в 10.00, 12.00, 14.00 и 16.00), рассчитывая интегративное значение AUC_0–6 (в относительных единицах). Концентрацию тестостерона определяли с помощью набора “Тестостерон-ИФА” (“Алкор-Био”, Россия). Образцы крови забирали из хвостовой вены под местной анестезией, которую осуществляли с помощью 2%-ного раствора лидокаина из расчета 2–4 мг/кг массы тела.

После повторного тестирования группы “ОЖ” и “ОЖ + МФ” рандомизировали каждую на три подгруппы, после чего животных в течение 5 дней обрабатывали ЛГР-агонистами (ТП03, ХГЧ) или растворителем (ДМСО, растворитель для ТП03). Ранее было показано, что в используемом объеме ДМСО не влияет на метаболические и гормональные показатели [20]. Синтез и характеристику ТП03 осуществляли, как описано нами ранее [21], в то время как ХГЧ был производства “Московского эндокринного завода” (Россия).

Тем самым были сформированы следующие группы (в каждой n = 6): “К” (контроль), “ОЖ” (без лечения), “ОЖ + ТП” (ТП03, 15 мг/кг/сутки, в/б, 5 дней), “ОЖ + Г” (ХГЧ, 20 МЕ/крысу/сутки, п/к, 5 дней), “ОЖМ” (МФ, 120 мг/кг/сутки, перорально), “ОЖМ + ТП” (совместно МФ и ТП03), “ОЖМ + Г” (совместно МФ и ХГЧ). В ходе эксперимента оценивали концентрацию тестостерона в крови крыс после однократного введения ЛГР-агонистов (1-й день, забор крови до введения, которое осуществляли в 10.00, и через 1, 3 и 5 ч после него) и ежедневно в течение пяти дней через 3 ч после их введения (13.00). Сразу после последнего забора крови животных наркотизировали (хлоральгидрат, 400 мг/кг), декапитировали и забирали у них ткани семенников и гипофиза для оценки экспрессии целевых генов, а также оценивали массу адбоминального жира и рассчитывали его долю в общей массе тела.

Количественную ПЦР в реальном времени осуществляли, как описано ранее [20], для чего из семенников и гипофиза выделяли тотальную РНК, используя “ExtraRNA kit” (“Evrogen”, Россия). Обратную транскрипцию проводили, используя набор “MMLV RT Kit” (“Evrogen”, Россия). Амплификационный сигнал детектировали, используя прибор “7500 Real-Time PCR System” (“Thermo Fisher Scientific Inc.”, США). Для исследований использовали последовательности комплементарных кДНК прямого и обратного праймеров для генов крысы, кодирующих ЛГР (Lhr) и стероидогенные белки – холестерин-транспортирующий белок StAR (Star), цитохромы CYP11A1 (Cyp11a1), CYP17A1 (Cyp17a1) и CYP19A1 (Cyp19a1) в семенниках, и гены, кодирующие рецептор гонадолиберина (Gnrhr), β-субъединицы ЛГ (LHbeta) и ФСГ (FSHbeta) в гипофизе (табл. 1). В качестве референсных использовали гены 18S-рРНК (18S rRNA) и β-актина (Actb). Анализ результатов проводили с использованием метода ΔΔС_t. Значения RQ рассчитывали по отношению к контрольной группе, в которой их принимали за единицу.

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ “SPSS Statistics”, используя однофакторный дисперсионный анализ с попарным сравнением с помощью апостериорного критерия Бонферрони. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Масса тела и абдоминального жира, а также содержание в крови триглицеридов и общего холестерина у крыс с ожирением значимо превышали эти показатели в контрольной группе (табл. 2). В группе “ОЖ” отмечали повышенные уровни глюкозы, инсулина и лептина, как базальные, так и через 120 мин после глюкозной нагрузки, повышенное содержание гликированного гемоглобина, а также нарушенную толерантность к глюкозе, о чем свидетельствует повышенное значение AUC_0–120 для глюкозной кривой в ИГТТ (табл. 2). Лечение МФ приводило к нормализации массы тела, базального и стимулированного глюкозной нагрузкой уровней инсулина и лептина, значимо снижало массу жировой ткани и содержание HbA1c, восстанавливало глюкозную чувствительность и липидный профиль (табл. 2). В группе “ОЖ” базовая концентрация тестостерона в крови была снижена. Лечение МФ повышало ее, на что указывает рассчитанное значение AUC_{0–6(часы)} для тестостерона в 6-часовом временном промежутке (табл. 2). Тем самым четырехнедельное лечение МФ частично восстанавливало метаболические и гормональные показатели у крыс с ДИО, включая их андрогенный статус.

Однократная обработка крыс с ожирением с помощью ТП03 и ХГЧ, как и в случае контрольных животных, приводила к стимуляции продукции тестостерона (рис. 1), о чем свидетельствуют значения AUC_{1–5(часы)} (табл. 3). При этом приросты уровня тестостерона в группе “ОЖ” с обработкой ХГЧ были существенно ниже, чем в контроле, составляя через 3 и 5 ч после начала обработки 58 и 65% от таковых в группе “К + Г”, о чем также свидетельствует снижение на 39% значения AUC_{1–5(часы)} в группе “ОЖ + Г” в сравнении с группой “К + Г” (рис. 1a и 1b, табл. 3). Стероидогенные эффекты ТП03 были выражены слабее, чем в случае гонадотропина, и в группах “К + ТП” и “ОЖ + ТП” были сопоставимыми (рис. 1a и 1b, табл. 3). Лечение МФ, улучшая базовый андрогенный статус, не приводило к восстановлению стероидогенных эффектов ЛГР-агонистов (рис. 1c, табл. 3).

Рис. 1.

Уровни тестостерона в сыворотке крови в течение 5 ч после введения ТП03 и ХГЧ самцам крыс с ожирением, в том числе леченных метформином, в сравнении с таковыми в контрольной группе. Обозначения групп: (a): С (К) – контроль; C + TP (К + ТП) – ТП03, 15 мг/кг/сутки, в/б, 5 дней; C + + G (К + Г) – ХГЧ, 20 МЕ/крысу/сутки, п/к, 5 дней; (b): OB (ОЖ) – крысы с ожирением без лечения; OB +TP (ОЖ + ТП) – крысы с ожирением, с обработкой ТП03, 15 мг/кг/сутки, в/б, 5 дней; OB + + G (ОЖ + Г) – крысы с ожирением, с обработкой ХГЧ, 20 МЕ/крысу/сутки, п/к, 5 дней; (c): OBM (ОЖМ) – крысы с ожирением, обработанные метформином, 120 мг/кг/сутки, перорально, 5 недель; OBM + TP (ОЖМ + ТП) – крысы с ожирением, с обработкой метформином и ТП03; OBM + G (ОЖМ + Г) – крысы с ожирением, с обработкой метформином и ХГЧ.

Пятидневная обработка с помощью ЛГР-агонистов во всех изученных группах приводила к повышению уровня тестостерона в крови, но стероидогенные эффекты существенно различались как по величине, так и по динамике (рис. 2). В контрольной группе стимулирующие продукцию тестостерона эффекты ТП03 составляли 176% в первый день обработки и постепенно повышались, достигая 289% на 5-й день. В группе “ОЖ+ТП” стимулирующий эффект ТП03 существенно не менялся в течение 5-дневной обработки препаратом, а в группе “ОЖМ+ТП” эффект ТП03 снижался и на 5-й день обработки составлял 55% от стимулирующего эффекта, полученного в 1-й день обработки (рис. 2b и 2c, табл. 3). Стероидогенные эффекты ХГЧ в группах “К + Г” и “ОЖ + Г” были максимальны в первый день обработки (726 и 978% соответственно), затем на 3-й день достоверно снижались на 60 и 46% соответственно, после чего восстанавливались, и на 4-й день в группе “К + Г” были в 1.4 раза выше, а в группе “ОЖ + Г” в 1.7 раза выше, чем на 3-й день обработки. При этом в 4–5-й дни в контрольной группе они были ниже, а в группе с ожирением сходными с таковыми в первый день обработки (рис. 2a и 2b). Важно отметить, что в группе “ОЖМ + Г” снижение эффекта гонадотропина в 2–4-й дни отсутствовало, а на пятый день обработки ХГЧ содержание тестостерона в крови нарастало и было достоверно выше, чем в первый день (рис. 2c). Тем самым при ожирении динамика стероидогенных эффектов ТП03 и ХГЧ не претерпевало значимых изменений, а в группах с лечением МФ отмечалось ослабление стероидогенного эффекта ТП03 и изменение динамики соответствующего эффекта ХГЧ (рис. 2, табл. 3). Оценка интегрированных значений уровней тестостерона показала, что, в отличие от однократного введения, значение AUC_{1–5(дни)} для ХГЧ в группах “ОЖ + Г” и “ОЖМ + Г” значимо не отличались от такового в группе “К + Г”, что указывает на сохранение продукции тестостерона при длительном введении гонадотропина, в то время как в случае ТП03, напротив, начинало выявляться снижение значений AUC_{1–5(дни)}, в наибольшей степени в группе “ОЖМ + ТП” (табл. 3).

Рис. 2.

Уровни тестостерона в сыворотке крови в течение пятидневного введения ТП03 и ХГЧ самцам крыс с ожирением (b), в том числе леченных метформином (c), в сравнении с таковыми в контрольной группе (c). Различия по сравнению с первым днем введения (^a) и с третьим днем введения препаратов (^b) статистически значимы при p < 0.05. Обозначения групп как на рис. 1.

Анализ экспрессии тестикулярных генов показал, что в группе “ОЖ” снижена экспрессия гена Star, причем обработка МФ лишь частично восстанавливала его экспрессию (рис. 3). Пятидневная обработка контрольных крыс с помощью ТП03 существенно не влияла на экспрессию изученных стероидогенных генов, в то время как обработка ХГЧ в значительной степени снижала экспрессию гена Lhr и в среднем в два раза повышала экспрессию стероидогенных генов Star, Cyp11a1 и Cyp17a1 (рис. 3).

Рис. 3.

Экспрессия генов, кодирующих ЛГР и стероидогенные белки, в семенниках крыс с ожирением, в том числе леченных метформином, после введения им ТП03 и ХГЧ, в сравнении с контрольной группой. Обозначения групп как на рис. 1. Различия по сравнению с группами “К” (^a) и “ОЖ” (^b) статистически значимы при p < 0.05; различия между группами “К + Г” и “ОЖМ + Г” (^c), между группами с обработкой ТП03 и ХГЧ (“К + ТП”/“К + Г”; “ОЖ + ТП”/“ОЖ + Г”; “ОЖМ + ТП”/”ОЖМ + Г”) (^d) или между группами с лечением и без лечения МФ (“ОЖ + ТП”/“ОЖМ + ТП”; “ОЖ + Г”/“ОЖМ + Г”) (^e) статистически значимы при p < 0.05. Данные представлены как M ± SEM, во всех группах n = 6.

В группах с ожирением ТП03 повышал экспрессию гена Star в сравнении с группой “ОЖ” (но не с контролем), не влияя на экспрессию гена Lhr (рис. 3). Стимулирующие эффекты ХГЧ на экспрессию генов Star, Cyp11a1 и Cyp17a1 в группах “ОЖ + Г” и “ОЖМ + Г” сохранялись, причем обработка МФ усиливала эффект ХГЧ в отношении гена Cyp17a1. В то же время отмечалось значительное ингибирование экспрессии гена Lhr (рис. 3). Оба ЛГР-агониста существенно не влияли на экспрессию гена ароматазы, которая во всех группах была близка к таковой в контроле. Тем самым ТП03 повышал экспрессию гена Star, но слабо влиял на экспрессию генов, кодирующих ЛГР и другие стероидогенные белки. В то же время ХГЧ значительно (на 80–89%) подавлял экспрессию гена Lhr, но усиливал экспрессию генов стероидогенных белков, причем величина его эффекта у крыс с ожирением, в том числе леченных МФ, не уступала таковой в контроле, и эти данные согласуются со стероидогенными эффектами ЛГР-агонистов.

На заключительном этапе исследовали экспрессию гипофизарных генов, кодирующих рецептор гонадолиберина, через который этот рилизинг-фактор осуществляет стимуляцию секреции и экспрессии гонадотропинов в гонадотрофах, а также β-субъединиц ЛГ и ФСГ, которые определяют специфичность гетеродимерных гонадотропинов, поскольку их α-субъединицы по первичной структуре идентичны. При ожирении и лечении крыс с ожирением МФ экспрессия изученных гипофизарных генов существенно не менялась по сравнению с контролем, но обработка МФ значимо снижала экспрессию гена Gnrhr в сравнении с группой ОЖ (рис. 4). ТП03 и ХГЧ снижали экспрессию генов Gnrhr и LHbeta, причем в случае гена LHbeta различия между контролем и группами “К + ТП” и “К + Г” были значимыми. В свою очередь, ингибирование экспрессии гена FSHbeta было показано только в случае воздействия ХГЧ на группы “К + Г” и “ОЖ + Г” (рис. 4).

Рис. 4.

Экспрессия генов гонадотропинов и рецептора гонадолиберина в гипофизе самцов крыс с ожирением, в том числе леченных метформином, после введения им ТП03 и ХГЧ, в сравнении с таковой в контрольной группе животных. Обозначения групп как на рис. 1. Различия по сравнению с группами “К” (^a) и “ОЖ” (^b) статистически значимы при p < 0.05; различия между группами “К + ТП” и “К + Г” (^c) статистически значимы при p < 0.05. Данные представлены как M ± SEM, во всех группах n = 6.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

У мужчин патологическое ожирение и другие метаболические расстройства, обусловленные нарушениями углеводного и липидного обмена, нарушенной толерантностью к глюкозе и инсулиновой резистентностью, ассоциированы с андрогенным дефицитом и репродуктивными дисфункциями, что требует разработки эффективных подходов для нормализации продукции тестостерона и восстановления репродуктивного потенциала [1–7]. Такие подходы могут быть использованы превентивно, на ранних стадиях нарушений метаболического и гормонального статуса, для предотвращения тяжелых форм ожирения, метаболического синдрома и СД2, поскольку андрогенная недостаточность может быть не только следствием, но и триггером этих эндокринных расстройств [3, 8, 28]. В экспериментальных условиях для изучения нарушений тестикулярной функции при ожирении и поиска путей их восстановления наиболее подходящей является модель ДИО у грызунов, в том числе у крыс. Самцы крыс с ДИО имеют сниженный уровень тестостерона и нарушенный сперматогенез [3, 8, 29]. Эти данные в целом согласуются с нашими результатами, полученными на модели ожирения у самцов крыс, вызванного длительной (23 нед.) диетой, обогащенной насыщенными животными жирами. Нами продемонстрировано снижение у крыс с ожирением базового уровня тестостерона в крови и экспрессии белка StAR, катализирующего первую, скорость-лимитирующую стадию стероидогенеза в семенниках, а также показано значимое ослабление стероидогенного эффекта ХГЧ при его однократном введении животным. В то же время в семенниках крыс с ожирением нами не было показано значимого изменения экспрессии генов, кодирующих ключевые стероидогенные ферменты – цитохромы CYP11A1 и CYP17A1 и фермент ароматазу (CYP19A1), осуществляющую конверсию андрогенов в эстрогены. Другие авторы на основе анализа транскриптома в семенниках андроген-дефицитных крыс Wistar с ожирением, индуцированным восьминедельной высокожировой диетой, показали повышение экспрессии гена ароматазы, результатом чего было снижение соотношения тестостерон/эстрадиол в семенниках и ухудшение сперматогенеза [30]. В этой связи следует отметить, что продолжительность ожирения, как и особенности диеты, существенно влияют на выраженность изменений андрогенного статуса и на паттерн экспрессии компонентов системы тестикулярного стероидогенеза. В нашем случае продолжительность диеты составила 23 нед., вследствие чего, как мы полагаем, длительное, хотя и умеренное снижение продукции тестостерона могло компенсаторно снизить экспрессию гена ароматазы, которая стимулируется повышенным уровнем андрогенов. Отсутствие повышения экспрессии гена ароматазы было показано нами ранее в семенниках самцов крыс с моделью СД2 с ожирением, причем среди других генов тестикулярного стероидогенеза только экспрессия гена Star имела тенденцию к снижению, в то время как экспрессия генов, кодирующих цитохром CYP11A1 и дегидрогеназы HSD3b и HSD17b, не менялась, а экспрессия гена Cyp17a1 была повышена [21]. Необходимо отметить, что при потреблении самцами крыс Sprague Dawley диеты с высоким содержанием холестерина, приводящей к сильно выраженной гиперхолестеринемии, в семенниках снижалась экспрессия не только гена Star, как в нашем случае, но и генов обоих цитохромов, CYP11A1 и CYP17A1 [31, 32], что указывает на зависимость изменений в системе тестикулярного стероидогенеза от природы и степени нарушений липидного метаболизма, в том числе уровня холестерина, предшественника тестостерона и других стероидных гормонов.

Ослабление стероидогенной функции было ассоциировано с такими метаболическими и гормональными нарушениями, как повышение массы тела и жировой ткани, нарушенная толерантность к глюкозе, инсулиновая и лептиновая резистентность, дислипидемия, которые в настоящее время рассматриваются как основные патогенетические факторы репродуктивных расстройств при ожирении, метаболическом синдроме и СД2 с ожирением [2, 29, 33, 34]. Одним из подходов для улучшения метаболического статуса при СД2 и метаболическом синдроме является длительная терапия МФ. При этом имеются сведения о том, что МФ способен также нормализовать репродуктивные функции, хотя не все авторы это подтверждают [23–26]. Нами и другими авторами ранее было показано, что обработка МФ грызунов с различными формами диабета восстанавливает продукцию тестостерона и нормализует сперматогенез [21, 33–38]. В настоящем исследовании нами установлено, что, наряду с нормализацией ряда метаболических и гормональных показателей, МФ восстанавливает базовый уровень тестостерона у самцов крыс с ожирением, но при этом существенно не влияет на экспрессию стероидогенных генов и на стероидогенные эффекты ХГЧ и аллостерического ЛГР-агониста ТП03. В этой связи необходимо отметить, что, как ранее было показано, терапия МФ повышала стероидогенный эффект ХГЧ и ТП03 при их однократном введении самцам крыс с СД2, вызванным высокожировой диетой и низкой дозой стрептозотоцина, у которых выраженность метаболических расстройств превосходила таковую у крыс с ожирением [21]. Можно полагать, что эффективность МФ терапии в отношении чувствительности системы тестикулярного стероидогенеза к стимулирующему действию ЛГР-агонистов зависит от тяжести метаболического расстройства и выявляется в условиях более выраженных метаболических и гормональных нарушений [24]. Большое значение может играть и стратегия применения МФ, включая дозу препарата и продолжительность терапии [24, 38].

Интересен тот факт, что уровень экспрессии гена рецептора гонадолиберина в гипофизе группы “ОЖМ” значимо снижался в сравнении с группой “ОЖ”, что может быть обусловлено повышением продукции гонадолиберина при обработке крыс МФ и компенсаторным снижением рецептора компонента гонадолиберин-компетентной системы в гонадотрофах. Так, известно, что МФ, подобно лептину, активирует проопиомеланокортин-экспрессирующие нейроны, вовлеченные в позитивную регуляцию синтеза и секреции гонадолиберина, и, напротив, ингибирует нейроны, экспрессирующие нейропептид Y и агути-подобный пептид, которые негативно влияют на высвобождение гонадолиберина [39–42]. Обработка ХГЧ существенно подавляла экспрессию генов, кодирующих рецептор гонадолиберина и β-субъединицы ЛГ и ФСГ в гонадотрофах, что обусловлено запуском отрицательных обратных связей, в том числе вследствие повышения уровня тестостерона в крови. В то же время ТП03, для которого был характерен сравнительно мягкий стероидогенный эффект, в меньшей степени влиял на экспрессию генов LHbeta и FSHbeta, хотя и значимо снижал экспрессию гена рецептора гонадолиберина. Сравнительно давно ряд авторов, исследуя самцов крыс различного возраста, показали, что их обработка с помощью ХГЧ приводила к снижению экспрессии гена LHbeta в гипофизе и к значительному снижению уровня эндогенного ЛГ в крови, причем этот эффект зависел от дозы гонадотропина и степени повышения продукции андрогенов [43, 44].

В настоящем исследовании в семенниках всех изученных групп крыс с обработкой ХГЧ нами показано значительное подавление экспрессии гена, кодирующего ЛГР, что может быть обусловлено запуском даун-регуляции ЛГР при их длительной стимуляции экзогенными гонадотропинами с ЛГ-активностью [21, 44]. При этом ТП03, как и другие ранее изученные нами аллостерические ЛГР-агонисты, слабо влияет на экспрессию ЛГР [20, 21]. Это может быть обусловлено их более высокой селективностью в отношении внутриклеточных сигнальных каскадов, поскольку мишенями ТП03 и его аналогов являются в основном цАМФ-зависимые сигнальные пути (ЛГР/G_s-белок/аденилатциклаза/протеинкиназа А) [45, 46], в то время как другие пути, включая β-аррестиновые, ответственные за эндоцитоз и деградацию лиганд-активированных ЛГР, активируются аллостерическими ЛГР-агонистами в существенно меньшей степени [46, 47].

Таким образом, впервые показано, что ТП03, аллостерический агонист ЛГР на основе тиено[2,3-d]-пиримидина, демонстрирует умеренно выраженный стимулирующий эффект на тестикулярный стероидогенез у самцов крыс с ДИО, не оказывая ингибирующего влияния на экспрессию гена ЛГР в семенниках и умеренно снижая экспрессию гена ЛГ в аденогипофизе. Если при однократном введении ТП03 ДИО-крысам его стероидогенный эффект сопоставим с таковым в контрольной группе, то при длительном (5 дней) введении он существенно ему уступает. Стероидогенный эффект ХГЧ при его однократном введении крысам с ожирением значимо ниже, чем таковой в контроле, но сопоставим с ним при длительном введении гонадотропина, и существенно превосходит стероидогенные эффекты ТП03. В отличие от ТП03, ХГЧ значительно снижает экспрессию ЛГР в семенниках и в большей степени ингибирует экспрессию гена ЛГ в гонадотрофах, что указывает на отчетливо выраженную активацию отрицательных обратных связей в гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси при обработке животных ХГЧ. Длительная МФ терапия частично восстанавливает андрогенный статус, при этом существенно не влияя на экспрессию генов стероидогенеза в семенниках. В условиях МФ терапии стероидогенные эффекты обоих изученных ЛГР-агонистов не повышаются, что указывает на отсутствие потенцирующего влияния на них длительной МФ обработки. Полученные результаты указывают на перспективы применения аллостерических и ортостерических ЛГР-агонистов для стимуляции тестикулярного стероидогенеза и на эффективность длительной МФ терапии для нормализации продукции тестостерона при ДИО, что может быть транслировано в клинику для коррекции репродуктивных расстройств, ассоциированных с ожирением и метаболическим синдромом. При этом совместное применение МФ и ЛГР-агонистов при ДИО представляется нецелесообразным, в отличие от СД2 с ожирением и характерными для него более тяжелыми метаболическими и гормональными нарушениями.