Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 2, стр. 241-251

ВВЕДЕНИЕ

Эпилепсия – хроническое заболевание головного мозга, которое часто сопутствует или провоцирует другие расстройства высшей нервной деятельности, в том числе волну распространяющейся депрессии. Абсансная эпилепсия чаще всего встречается среди детей и подростков, характеризуется потерей сознания на короткое время, иногда она имеет постепенное начало и окончание. У больных абсансной эпилепсией нет показаний для инвазивных исследований и хирургического вмешательства, что затрудняет получение информации о механизмах этого заболевания. Поэтому традиционно экспериментальную работу проводят на животных, у которых возможно производить хирургические вмешательства и записывать сигналы глубоких структур мозга. Самыми популярными в настоящее время являются крысы с генетической предрасположенностью к заболеванию линий WAG/Rij [1] и GAERS [2]. Для этих животных, начиная с некоторого возраста, характерны спонтанные пик-волновые разряды, средняя частота которых составляет 8–9 Гц у крыс WAG/Rij и 5–6 Гц у крыс GAERS [3], а медианная длительность разрядов – около 6 с [4].

Кроме того, исследования проводятся и на фармакологических моделях, которые хороши тем, что позволяют моделировать вызванные судороги абсансного типа у исходно здоровых животных путем однократной интенсивной стимуляции. Наиболее популярными моделями этого типа являются животные, пик-волновые разряды у которых вызваны введением низких доз пентилентетразола (ПТЗ), см. обзор [5]: крысы [6], мыши [7] и морские свинки [8]. При этом более высокие дозы того же вещества вызывают тонико-клонические судороги [9, 10]. Для нас эти модели имеют большое значение в том числе потому, что различные дозы и протоколы введения ПТЗ могут приводить как к эпилептическим приступам, так и к появлению волны распространяющейся депрессии [11–13].

Традиционно принято считать, что у крыс с индуцированными ПТЗ абсансами [12], как и у животных с генетической абсансной эпилепсией [1], а также и у пациентов [14], разряды в коре правого и левого полушарий головного мозга одинаковы. Поэтому, чтобы охватить как можно больше структур мозга, в той или иной степени вовлеченных в пик-волновую активность, все электроды ставят в одно полушарие. Тем не менее, вопрос о том, являются ли такие разряды действительно всегда первично генерализованными в обоих полушариях, систематически не исследовался. Известно, что при других формах эпилепсии, изначально фокальных, волна распространяющейся депрессии возникает только в одном полушарии [15], между тем ПТЗ в больших дозах также вызывает и тонико-клонические приступы, свойственные лимбической и аудиогенной вторично генерализованной эпилепсии, и волну распространяющейся депрессии. Поэтому потенциально можно ожидать, что асимметрия в распространении абсансов, вызванных системным введением ПТЗ, возможна.

Цель данной работы – по временным рядам локальных потенциалов коры двух полушарий проверить симметричность абсансов, вызванных системным введением ПТЗ.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на самцах крыс линии Wistar, в возрасте 6–7 мес., полученных из питомника “Столбовая” (Московская область). Электрическая активность неокортекса регистрировалась с помощью электродов (стальных винтов), имплантированных в симметричные области фронтальной коры обоих полушарий по координатам: AP 2; ML ± 2; DV 1 [16]. В качестве индифферентного электрода использовали стальной винт, расположенный над мозжечком. Электроды вживлялись под наркозом (хлоралгидрат, 380 мг/кг) за две недели до начала экспериментов. Электрическую активность коры регистрировали с помощью 4-канального усилителя и АЦП (E14-440, L-Card, Россия) у бодрствующих свободно подвижных животных. Для индукции пик-волновых разрядов использовалось внутрибрюшинное введение конвульсанта ПТЗ в дозе 40 мг/кг. По окончании эксперимента проводили гистологический анализ для определения локализации регистрирующих электродов. В данной работе рассматривались записи 9 животных, длительность всех записей составляла не менее 1 ч, в среднем около 90 мин. Типичный разряд представлен на рис. 1. Из спектрограмм (см. рис. 1b, d) видно, что колебания во время разряда очень нелинейные: можно надежно различить пять гармоник основной частоты.

Рис. 1.

Временные ряды (а, c) и спектрограммы (b, d) пик-волнового разряда, записанного в лобной коре правого (a, b) и левого (с, d) полушарий крысы № 8. Оси X – время в с (t, s), оси Y – напряжение (U, mV) на временных рядах или частота в герцах (f, Hz) на спектрограммах. На всех графиках черные вертикальные линии означают начало и конец разряда.

Непосредственно регистрируемые (необработанные) ряды не подходят для анализа из-за наличия трендов и помех. Поэтому, во-первых, с помощью извлечения скользящего среднего, рассчитанного на временном интервале 2 с, удалялся медленный тренд, обусловленный особенностями процедуры измерения. Затем сигнал дополнительно фильтровался: режекторным фильтром в полосе 49–51 Гц удалялась сетевая 50 Гц наводка, фильтром высоких частот – все частотные компоненты на частотах более 99 Гц: эти компоненты не принимают существенного участия в пик-волновых разрядах. При этом в сигнале сохранялись высокоамплитудные артефакты (движения, компенсации и т.д.), поскольку записи были достаточно длинными и проводились у свободно подвижных животных.

Чтобы быстро и непредвзято проверить гипотезу о симметричном распространении патологической активности, необходимо выделить разряды из фоновой активности и определить длительность разрядов с помощью автоматического метода. Мы использовали очень простой подход, частично основанный на ранее предложенных подходах [17, 18], но без использования спектральных свойств сигнала, так как у рассматриваемой фармакологической модели основная частота не так стабильна, как у крыс WAG/Rij, у которых основной временной масштаб сохраняется не только в течение всего разряда, но и возникает до него [19]. Поскольку мы искали пик-волновые комплексы, предложенный подход основан на обнаружении пиков и состоит в следующем.

Пусть имеется временной ряд значений {x_i} – скалярная запись локальных потенциалов поля, где i – номер момента времени. Среднее m_i рассчитывается для значений в ряде, предшествующих x_{i + 1} и расположенных после последнего обнаруженного разряда (либо с начала записи). Затем каждое (x_i + 1) сравнивается с (10|m_i|), где константа 10 подобрана эмпирически и является параметром метода. Если |x_{i + 1}| > 10|m_i|, считается, что x_i + 1 является началом пик-волнового комплекса. Если два пика находятся рядом и их разделяет не более τ значений, где τ определяется на основании спектральных свойств сигнала: основной период пик-волновой активности для данной модели абсансов составляет 6 Гц, то все значения между ними считаются частью пик-волнового разряда. Блок-схема алгоритма разряда изображена на рис. 2.

Рис. 2.

Блок-схема разработанного алгоритма для определения пик-волнового разряда.

Для проверки точности метода были рассчитаны специфичность и чувствительность. Чувствительность означает способность метода обнаруживать разряды, которые действительно присутствовали, и рассчитывается как N_tf/N_real, где N_tf – количество реальных пиков-волновых комплексов, найденных алгоритмом, а N_real – полное количество истинных пиков-волновых комплексов по разметке энцефалографиста. Специфичность – это способность метода избегать ложноположительных результатов. Хорошая специфичность означает относительно небольшое количество ложно выявленных разрядов. Специфичность рассчитывается как 1 – N_ff/N_real, где N_ff – число ложноположительных обнаружений. Результаты оценки специфичности приведены в табл. 1 и чувствительности в табл. 2.

Видно, что результаты отличаются для разных животных. В основном, при лучшей чувствительности мы получаем худшую специфичность и наоборот, что очень естественно и типично [18]. Однако среднего значения чувствительности и специфичности вполне достаточно, чтобы использовать метод для автоматического определения, если мы хотим получить общее впечатление и сравнить результаты по левому и правому полушариям.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Поскольку метод показал достаточную чувствительность и специфичность, для анализа использовалась длительность разрядов, полученная с помощью предложенного алгоритма автоматического детектирования. По результатам обнаружения были построены гистограммы длительности разрядов для каждого животного отдельно. Для примера, гистограммы для животных № 8 и № 9 показаны на рис. 3.

Рис. 3.

Гистограммы распределения длительности разрядов для крыс № 8 и № 9. Желтый цвет – оценка распределения для разрядов в правом полушарии, серо-голубой – в левом. По оси X отложена длина разрядов, по оси Y – их количество.

Результаты анализа оказались неоднозначными. Для крыс № 2, 4, 6 и 8 распределения длительности разрядов были очень похожи в обоих полушариях. Для остальных пяти крыс распределения в разных полушариях заметно отличались. Чтобы понять детали, дополнительно подробнее были проанализированы по 30 разрядов у крыс № 8 и № 9, то есть у одного животного, у которого заметных отличий в длине разрядов нет, и у одного, у которого длины разрядов в разных полушариях существенно различаются. Есть три типичные ситуации. Во-первых, в некоторых случаях разряды начинаются одновременно и имеют одинаковую длительность в обоих каналах, как видно из рис. 4. Для крысы № 8 все рассмотренные разряды относятся к этому типу.

Рис. 4.

Фрагмент записи электрической активности коры правого (a) и левого (b) полушарий крысы № 9. По оси X – время в с (t, s), по оси Y – напряжение (U, mV). Черным выделены участки, определенные алгоритмом как разряд.

Второй случай, когда в одном отведении разряды существенно менее выражены, чем в другом (в том числе по амплитуде, а также по форме и по наличию высших гармоник в спектре), поэтому они либо не обнаруживаются из-за недостаточно резких пиков, либо обнаруживаются с уменьшенной длиной (см. в качестве типичного примера рис. 5).

Рис. 5.

Фрагмент записи электрической активности коры правого (a) и левого (b) полушарий крысы № 9. По оси X – время в с (t, s), по оси Y – напряжение (U, mV). Черным выделены участки, выделенные алгоритмом, серым – основной сигнал для сравнения.

В некоторых случаях, как это показано на рис. 6, разряд явно развивается только в одном полушарии, в то время как в другом нет эпилептиформной активности, отличной от фона, поэтому нельзя сказать, что алгоритм обнаружения недостаточно чувствителен или что разряд асимметричен и лучше выражен в одном полушарии. Поскольку все три рассмотренных на рис. 4–6 случая были записаны у одного и того же животного в течение одного часа записи в произвольном порядке, гипотезы о том, что эти различия обусловлены положением электродов или какими-то эффектами во время записи, должны быть отвергнуты.

Рис. 6.

Фрагмент записи электрической активности коры правого (a) и левого (b) полушарий крысы № 9. По оси X – время в с (t, s), по оси Y – напряжение (U, mV). Черным выделены участки, выделенные алгоритмом, серым – основной сигнал для сравнения.

Для количественного описания различий в продолжительности разрядов мы использовали два хорошо известных статистических теста: тест Колмогорова–Смирнова и тест Манна–Уитни. Программная реализация обоих тестов была взята из популярного пакета scipy [20]. Оба подхода проверяют гипотезу о том, что две выборки (в нашем случае это выборки длительности приступов в правом и левом полушариях) взяты из одного и того же распределения. Оба метода выдают значение p – вероятность ошибиться, опровергая гипотезу о том, что распределения одинаковы. Как правило, при малых значениях p делается вывод о значимых различиях, в то время как при относительно больших p, например, p > 0.05, исходная гипотеза принимается и выборки считаются принадлежащими одному и тому же распределению.

Для более удобного анализа данных значения p двух тестов были сведены в табл. 3. Для различных очень малых p < 10^–5 в таблицу записывалось значение 10^–5, поскольку различия между меньшими значениями на наших размерах выборки не имеют статистического смысла. Оба теста показали очень похожие результаты, четко различая две группы животных. Четыре крысы: № 2, 4, 6 и 8 имели симметричные разряды, и для них значения p большие – p > 0.2. Для пяти других животных: № 1, 3, 5, 7, 9 значения p < 10^–5 , то есть распределения достоверно различные (даже если мы допустим поправку на множественное тестирование, сделав оценку сверху умножением полученных значений на число животных, все равно оба метода дадут p < 10^–4). Как видно из рис. 4, это не означает, что все разряды у этих животных разные, но некоторые или многие из них либо разной длины (например, см. рис. 5), либо развиваются только в одном полушарии (например, см. рис. 6).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе анализировалась длительность пик-волновых разрядов у крыс с вызванными системным введением ПТЗ абсансами. Анализ производился по отдельности для правого и левого полушарий с целью выявить, в какой степени пик-волновые разряды симметричны. Для непредвзятого определения длины пик-волновых разрядов был предложен и реализован простой алгоритм обнаружения пик-волновых комплексов, для которого были определены специфичность и чувствительность, оказавшиеся достаточно высокими для решения поставленной задачи.

Было показано, что распределение длительности пик-волновых разрядов в разных полушариях отличается у пяти из девяти проанализированных животных и одинаково у остальных четырех. У животных с разным распределением наблюдаются как симметричные билатеральные, так и асимметричные (в одном полушарии короче, чем в другом) разряды и разряды, локализованные только в одном полушарии. Поскольку все животные принадлежат к одной и той же линии Wistar, сходны по массе тела, одного пола и возраста, оперировались одинаково, это означает, что существует индивидуальная предрасположенность к генерации двусторонних или односторонних разрядов. При этом сосуществование как симметричных, так и односторонних разрядов у одних и тех же животных может указывать на наличие как минимум двух различных механизмов запуска эпилептиформной активности абсансного типа, в то время как у четырех животных с симметричными разрядами один из этих механизмов не реализуется.

Выявленные особенности динамики эпилептиформной активности характеризуют именно рассмотренную фармакологическую модель абсансных судорог. По результатам данного исследования нельзя сказать, имеют ли пик-волновые разряды у генетических моделей (крысы WAG/Rij и GAERS) такие же индивидуальные свойства. Но если это так, то это может объяснить, почему эволюция связности во время абсансных приступов сильно различается в популяции, как это было показано в ранее опубликованных работах [21, 22] с использованием различных мер связанности. Кроме того, при рассмотрении распространяющейся депрессии, инициированной инъекцией ПТЗ, односторонний или двусторонний тип волны депрессии может основываться на одном и том же механизме индивидуальной предрасположенности, что и при возникновении симметричных или асимметричных пик-волновых разрядов. Эти вопросы, несомненно, требуют дальнейшего изучения.