Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 2, стр. 229-240

ВВЕДЕНИЕ

Классическими методами исследования процессов, происходящих на уровне концевой пластинки, являются электрофизиологические и биохимические методы, позволяющие изучить роль мембранных структур в регуляции функционирования синапса. В последнее время все большее внимание уделяется обсуждению трофической функции нервной системы и запуску сигнальных каскадов, регулирующих клеточный метаболизм. Известно, что ацетилхолин выделяется в синаптическую щель из двигательной нервной терминали в виде порций (квантов) и в “неквантовой” форме (активное тоническое выделение молекул) [1]. При квантовом выделении ацетилхолина его концентрация в синаптической щели достигает сотен мкмоль/л, в случае неквантового освобождения концентрация медиатора поддерживается на наномолярном уровне [2].

Исследования роли ацетилхолина в концентрации, сопоставимой с той, что достигается при его неквантовом выделении, в регуляции нервно-мышечной передачи начались в лаборатории нервно-мышечной физиологии НИИ физиологии им. А.А. Ухтомского в 90-х годах XX века. На френико-диафрагмальном препарате белой крысы был изучен антиутомляющий эффект низких концентраций ацетилхолина. Исследования показали, что этот эффект не связан с влиянием медиатора на никотиновые или мускариновые холинорецепторы. Кратковременная аппликация ацетилхолина вызывала гиперполяризацию внесинаптической мембраны мышечных волокон. Эта гиперполяризация сохранялась на протяжении длительного времени после удаления ацетилхолина из омывающего мышцу раствора, но отсутствовала на фоне оуабаина. Авторы сделали вывод о том, что в основе такой гиперполяризации лежит активация Na⁺,K⁺-АТФазы [3–8].

Исследования вопросов, связанных с изучением регуляторной роли ацетилхолина в нервно-мышечном соединении, осуществлялись параллельно в Санкт-Петербургском Университете, под руководством профессора И.И. Кривого, и в Казани в лаборатории биофизики клетки, под руководством академика Е.Е. Никольского. В работе Е.Е. Никольского и соавт. также было показано, что наномолярные концентрации ацетилхолина модулируют насосную функцию Na⁺,K⁺-АТФазы, что проявляется в локальной гиперполяризации мышечной мембраны [9].

Если вклад ацетихолина в наномолярных концентрациях в модуляцию нервно-мышечной передачи исследован достаточно подробно [1, 10, 11], то о трофотропных эффектах различных концентраций ацетилхолина сведений крайне мало. В 2020 г. вышла работа, свидетельствующая о том, что ацетилхолин в миллимолярной концентрации обеспечивает трофический сигнал, предотвращающий механизмы коннексин-опосредованной мышечной атрофии [12]. Вопрос о трофической функции низких концентраций ацетилхолина остается открытым.

Важнейшей группой природных регуляторов Na⁺,K⁺-АТФазы являются сердечные гликозиды. В высоких концентрациях эти стероиды являются ингибиторами Na⁺,K⁺-АТФазы, а в низких – модуляторами ее сигнальной функции. Эндогенные структурные аналоги этих соединений получили название эндогенные дигиталисоподобные факторы [13, 14]. Концентрация эндогенного оуабаина в плазме крови человека колеблется в наномолярном диапазоне (от 0.6 до 1.2 нМ) [13, 15]. У пациентов с кардиологической и нефрологической патологией зарегистрировано повышение уровня эндогенных дигиталисоподобных факторов в плазме крови [16].

Чувствительность различных изоформ α-субъединицы Na⁺,K⁺-АТФазы к кардиотоническим стероидам может различаться, но у грызунов это различие выражено в наибольшей степени. У этих животных α₁-изоформа малочувствительна к оуабаину (константа блокирования составляет десятки и сотни мкМ), напротив, изоформы α₂- и α₃-высокочувствительны к оуабаину (константа блокирования составляет десятки и сотни нМ). У других млекопитающих, включая человека, чувствительность α₁-изоформы к оуабаину лежит в наномолярном диапазоне концентраций [17, 18]. Классическим объектом при изучении свойств сердечных гликозидов является куриный и утиный эмбрион [19]. Предполагается существование двух пулов Na⁺,K⁺-АТФазы, один из которых функционирует как ионный насос. Другой пул, преимущественно локализованный в кавеолах, образует молекулярный комплекс с EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) и Src-киназой [20–22] и участвует в мембранной и внутриклеточной сигнальной трансдукции [23]. Выявлен участок α-субъединицы (так называемая NaKtide последовательность), отвечающий за реализацию сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы и предположительно специфичный для α₁-изоформы Na⁺,K⁺-АТФазы в скелетной мышце [20]. В области концевой пластинки никотиновый холинорецептор колокализован с Na⁺,K⁺-АТФазой, фосфолемманом и кавеолином-3 [24, 25]. В настоящее время интенсивно изучается участие эндогенных оуабаин-подобных соединений в механизмах регуляции, реализуемых через сигнальную функцию Na⁺,K⁺-АТФазы [26].

Помимо регуляции ионного транспорта Na⁺,K⁺-АТФаза в качестве трансдуктора сигнала участвует в модуляции клеточного метаболизма, стимулирует рост и пролиферацию клеток разных тканей. Продемонстрирована роль сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции роста ткани сердца [27, 28], сетчатки [29], сенсорных нейронов [30]. Вклад сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы и эндогенных дигиталисоподобных факторов в регуляцию трофических процессов скелетной мышцы не исследован.

Цель работы: оценка участия ацетилхолина и Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции роста скелетных мышц куриного эмбриона в условиях органотипического культивирования ткани.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись эксплантаты ткани скелетной мышцы голени 10–12-дневных куриных эмбрионов породы белый Леггорн. Каждая серия эксперимента включала 120 контрольных и 120 экспериментальных эксплантатов на каждую исследованную концентрацию действующих веществ. Фрагменты эмбриональной мышечной ткани размером 0.5–1 мм переносили в чашки Петри на коллагеновую подложку. Каждая чашка Петри содержала 20 эксплантатов ткани мышцы голени. Добавляли питательную среду, состоящую из раствора Хенкса (50 об. %) (Биолот, Россия), среды Игла (40 об. %) (Биолот, Россия), эмбриональной телячьей сыворотки (9.5 об. %) (Thermo Fisher Scientific, Бразилия), глюкозы 40% (0.5 об. %) (Производственная фармацевтическая компания Обновление, Россия) ципрофлоксацина (2 мг/мл) (Красфарма, Россия), и культивировали в CO₂-инкубаторе (Binder, Германия) при 37°С и 5% СО₂. В питательную среду экспериментальных эксплантатов добавляли ацетилхолин (Sigma, США), оуабаина октагидрат (Sigma, США) и d-тубокурарина гидрохлорид (Sigma, США) согласно протоколу эксперимента. Через трое суток культивирования чашки Петри извлекали из CO₂-инкубатора и исследовали с использованием морфометрии.

Влияние исследуемых веществ на рост эксплантатов мышечной ткани оценивали при помощи морфометрического критерия – индекс площади, который рассчитывали, как отношение площади всего эксплантата к площади центральной зоны. За условную единицу площади принимали квадрат оккуляр-сетки микроскопа. Значение индекса площади контрольных эксплантатов принимали за 100%. Контрольными являлись эксплантаты, развивающиеся в условиях питательной среды стандартного состава.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA 10.0. При сравнении контрольной и экспериментальной групп использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок. Множественные сравнения проводили с применением дисперсионного анализа ANOVA. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего, выраженные в %. Различия считали достоверными при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние ацетилхолина на рост эксплантатов ткани скелетной мышцы исследовали в диапазоне концентраций от 10^–10 до 10^–4 М. Действие ацетилхолина было дозозависимым. Концентрации ацетилхолина 10^–10 и 10^–8 М проявили трофотропный эффект. Добавление в питательную среду ацетилхолина в концентрации 10^–10 М стимулировало рост эксплантатов на 56.0 ± 1.8% (n = 120, p < 0.05) по сравнению с контролем. Максимальный трофотропный эффект ацетилхолин проявил в концентрации 10^–8 М: индекс площади экспериментальных эксплантатов был выше контрольного значения на 70.0 ± 2.4% (n = 120, p < 0.01). В дозе 10^–6 М ацетилхолин не оказывал действия на рост исследуемой ткани. Ацетилхолин в концентрации 10^–4 М ингибировал рост мышечной ткани на 35.0 ± 1.2% (n = 120, p < 0.01) (рис. 1).

Рис. 1.

Ацетилхолин дозозависимо регулирует рост эксплантатов ткани скелетной мышцы. * – p < 0.05, ** – p < 0.01 по сравнению с контрольным значением.

Для оценки вклада никотиновых холинорецепторов в обнаруженный нами трофотропный эффект ацетилхолина провели серию экспериментов с использованием d-тубокурарина гидрохлорида (рис. 2). В концентрациях 10^–8 и 10^–6 М препарат достоверно ингибировал рост эксплантатов ткани скелетной мышцы на 37.0 ± 3.3% (n = 120, p < 0.01) и 37.0 ± 4.0% (n = 120, p < 0.01) соответственно. В концентрации 10^–10 М d-тубокурарин не влиял на рост экспериментальных эксплантатов. Поэтому для культивирования эксплантатов ткани скелетной мышце в питательной среде, содержащей ацетилхолин и d-тубокурарин, была выбрана концентрация блокатора 10^–10 М. При культивировании экспериментальных эксплантатов в среде, содержащей блокатор никотиновых холинорецепторов d-тубокурарин (10^–10 М) и ацетилхолин (10^–8 М), трофотропный эффект ацетилхолина отсутствовал.

Рис. 2.

Влияние тубокурарина на рост эксплантатов ткани скелетной мышцы. ** – p < 0.01 по сравнению с контрольным значением.

Участие Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани скелетной мышцы в аналогичных условиях было исследовано в следующей экспериментальной серии. Влияние оуабаина на рост экспериментальных эксплантатов оценивали в диапазоне концентраций от 10^–10 до 10^–4 М. В концентрации 10^–4 и 10^–6 М оуабаин проявил миотоксический эффект, индекс площади экспериментальных эксплантатов был на 95.0 ± 2.0% (n = 120, p < 0.001) и 48.0 ± 1.4% (n = 120, p < 0.01) ниже контрольного значения. Максимальный трофотропный эффект препарат обнаружил в концентрации 10^–8 М, индекс площади экспериментальных эксплантатов был выше контрольного значения на 33.0 ± 1.3% (n = 120, p < 0.05) (рис. 3). В концентрации 10^–10 М оуабаин стимулировал рост на 20.0 ± 1.5% (n = 120, p < 0.05).

Рис. 3.

Оуабаин дозозависимо регулирует рост эксплантатов ткани скелетной мышцы. * – p < 0.05, ** – p < 0.01, *** –p < 0.001 по сравнению с контрольным значением.

Для того чтобы оценить возможность регуляции сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы ацетилхолином в концентрации, сопоставимой с той, что достигается при неквантовом выделении, были поставлены отдельные серии экспериментов. Эксплантаты ткани скелетной мышцы культивировали в питательной среде, содержащей совместно ацетилхолин 10^–8 М и оуабаин 10^–6 М. Оказалось, что ацетилхолин нивелирует миотоксический эффект оуабаина. Индекс площади экспериментальных эксплантатов не отличался от контрольного значения (рис. 4).

Рис. 4.

Ацетилхолин в концентрации, сопоставимой с неквантовым выходом (10^–8 М), нивелирует миотоксический эффект оуабаина (10^–6 М). ** – p < 0.01 по сравнению с контрольным значением.

Для того чтобы исключить участие никотиновых холинорецепторов в обнаруженном нами эффекте, экспериментальные эксплантаты культивировали в питательной среде, содержащей ацетилхолин (10^–8 М), оуабаин (10^–6 М) и d-тубокурарин (10^–10 М). В присутствии d-тубокурарина ацетилхолин устранял миотоксический эффект оуабаина (10^–6 М) не полностью. Индекс площади эксплантатов был ниже контрольного значения на 17.0 ± 1.0% (n = 120, p < 0.05) и отличался от индекса площади эксплантатов, культивируемых в присутствии только оуабаина на 31.0 ± 1.1% (n = 120, p < 0.001) (рис. 5). Полученные результаты свидетельствуют о том, что ацетилхолин устраняет ингибирующее рост эксплантатов скелетной ткани действие оуабаина как прямо, действуя на Na⁺,K⁺-АТФазу, так и рецептор-опосредовано через никотиновый холинорецептор.

Рис. 5.

Вклад никотинового холинорецептора в модуляцию сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы ацетилхолином в концентрации 10^–8 М. * – p < 0.05, ** – p < 0.01 по сравнению с контрольным значением. # – p < 0.001 по сравнению с индексом площади эксплантатов, культивируемых в присутствии ацетилхолина и оуабаина.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Физиологическое значение низких концентраций ацетилхолина связывают с поддержанием мембранного потенциала покоя, характерного для иннервированной мышцы [31]. Кроме того, было показано, что неквантовое выделение ацетилхолина из двигательных нервных окончаний в начале иннервационного процесса является обязательным условием перехода от полинейронального характера иннервации к мононейрональному [32]. Описана также шунтирующая роль неквантового ацетилхолина, при которой его выделение из нервного окончания в состоянии покоя препятствует аллостерическому ингибированию фермента, синтезирующего медиатор избытком продукта [31]. Нам удалось показать, что ацетилхолин дозозависимо влияет на рост эксплантатов скелетной мышцы. Максимальный миостимулирующий эффект ацетилхолин проявил в концентрации 10^–8 М. При культивировании эксплантатов ткани скелетной мышцы в питательной среде, содержащей ацетилхолин (10^–8 М) и d-тубокурарин в концентрации 10^–10 М трофотропный эффект ацетилхолина отсутствовал, что свидетельствует о вовлеченности никотиновых холинорецепторов в реализацию трофотропного действия препарата. В условиях органотипического культивирования ткани сердца было обнаружено аналогичное действие ацетилхолина. Также ацетилхолин в концентрации 10^–8 М устранял кардиотоксическое действие оуабаина 10^–8 М [33].

Na⁺,К⁺-АТФаза участвует в регуляции клеточного роста и пролиферации во многих тканях организма [27–30]. Рядом авторов описана роль Na⁺,K⁺-АТФазы в регуляции метаболизма скелетной мышцы. В опытах на скелетных мышечных клетках человека показана возможность Src-зависимой регуляции синтеза гликогена наномолярными концентрациями оуабаина [34], обсуждается также участие Src-киназы в реализации сигнальной функции оуабаин-чувствительной α₁-изоформы Na⁺,K⁺-АТФазы в мышцах [35]. Участие α₂- и α₃-изоформ α-субъединицы в сигнальной трансдукции в ткани скелетной мышцы подвергается сомнению [20, 21]. Необходимо отметить, что в скелетной мышце куриного эмбриона зарегистрирована экспрессия α₁-изоформы Na⁺,K⁺-АТФазы [36]. Результаты других исследований демонстрируют, что фукционирование скелетных мышц необходимо для поддержания насосной функции α₂-изоформы Na⁺,K⁺-АТФазы, а изменению ее активности, в свою очередь, предшествует атрофия мышц, индуцированная краткосрочной функциональной разгрузкой камбаловидной мышцы [37].

В ходе работы обнаружено трофотропное действие оуабаина в концентрациях, сопоставимых с эндогенными (10^–8 и 10^–10 М). В высоких дозах (10^–6 и 10^–4 М) оуабаин ингибирует рост эксплантатов скелетных мышц на 48 и 95% соответственно. Полученные результаты сочетаются с данными, обнаруженными Oliveira с соавт. при изучении роли Na⁺,K⁺-АТФазы в миогенезе куриных эмбрионов [36]. Оказалось, что оуабаин в концентрации 10^–5 М ингибирует рост клеток мышечной ткани на 45%, а также уменьшает образование многоядерных миотрубочек. Ингибитор MEK–ERK сигнальных путей U0126 не влиял на выживаемость клеток и не устранял миотоксическое действие оуабаина. Ингибирующий эффект оуабаина также сохранялся на фоне блокатора p38 SB202190. Таким образом, ингибирующий эффект 10^–5 М оуабаина не связан с сигнальной функцией фермента, а опосредован блокированием насосной функции Na⁺,K⁺-АТФазы. Авторы не обнаружили изменений в количестве одноядерных клеток, количестве ядер внутри мышечных трубочек и общего количества ядер при действии 10^–6 М оуабаина, хотя количество мышечных трубочек уменьшилось. Интересно отметить, что в отличие от оуабаина в дозе 10^–5 М 24-часовая инкубация клеток в питательной среде, содержащей оуабаин 10^–6 М и блокатор p38, приводила к увеличению числа миотрубочек и одноядерных клеток, хотя общее количество ядер и количество ядер в миотрубочках не изменялось. Дозозависимый эффект оуабаина может быть опосредован различием в механизме действия [36].

Na⁺,К⁺-АТФаза может образовывать ансамбли с рецепторами и ионными каналами [38]. Одними из первых были выявлены структурно-функциональные взаимодействия между Na⁺,К⁺-АТФазой и никотиновым холинорецептором. Исследования под руководством И.И. Кривого показали, что ацетилхолин в концентрации 100 нМ вызывает гиперполяризацию постсинаптической мембраны на 4 мВ. Этот эффект наблюдался в присутствии ингибитора ацетилхолинэстеразы – армина и негидролизуемых агонистов Н-холинорецепторов: карбамилхолина и никотина. Введение специфических агонистов d-тубокурарина и бунгаротоксина устраняло ацетилхолин-вызванную гиперполяризацию. Введение проадифена, который не связывается с сайтом связывания ацетилхолина, а блокирует натриевый ток через канал, не влияло на ацетилхолин-вызванную гиперполяризацию мышечной мембраны. Выявленная зависимость ацетилхолин-вызванной гиперполяризации от концентрации ацетилхолина позволила предположить, что эффект обусловлен связыванием ацетилхолина со специфическим сайтом связывания рецептора, а не с каким-либо другим белком. Оуабаин ингибировал ацетилхолин-вызванную гиперполяризацию в наномолярном диапазоне, что указывает на участие именно α₂-изоформы Na⁺,К⁺-АТФазы в модуляции электрогенеза постсинаптической мембраны [22]. Также доказано, что ацетилхолин не влияет на активность Na⁺,K⁺-АТФазы, если она не представлена в едином комплексе с никотиновым холинорецептором [4]. Предполагают, что физиологическая роль данной гиперполяризации заключается в тонкой настройке мембранного электрогенеза, а, следовательно, более эффективной нервно-мышечной передаче возбуждения.

Для установления возможности прямой активации Na⁺,К⁺-АТФазы ацетилхолином было проведено исследование электрогенной активности Na⁺,К⁺-АТФазы при действии ацетилхолина в ткани почки ягненка и эритроцитах – системах, где отсутствует никотиновый холинорецептор. Изменение активности фермента не обнаружено [11]. Однако в этом исследовании оценивали только насосную функцию Na⁺,К⁺-АТФазы, запуск сигнальных каскадов, опосредуемый активацией сигнальной функции Na⁺,К⁺-АТФазы, не изучался. Обнаруженное нами нивелирование миотоксического эффекта оуабаина ацетилхолином на фоне блокады никотинового холинорецептора d-тубокурарином указывает на возможность прямой регуляции сигнальной функции Na⁺,K⁺-АТФазы ацетилхолином. Что касается внутриклеточных процессов, запускаемых ацетилхолином, механизмы, лежащие в основе зарегистрированного нами эффекта, требуют дальнейшего изучения.