Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 6, стр. 798-816

ВВЕДЕНИЕ

Экспериментальная физиология подразумевает проведение опытов на животных. До начала XX в. моделями в различных исследованиях служили лягушки, обезьяны, кролики, кошки и собаки, а с начала XX в. – и грызуны [1]. При этом вклад различных уровней нервной системы в регуляцию физиологических процессов, как правило, изучался на редуцированных моделях – животных, декортицированных или децеребрированных на различных уровнях. Децеребрированные препараты до сих пор успешно применяются в нейробиологии [2–4]. Одним из преимуществ таких препаратов является возможность работы без анестезии [5], применение которой изменяет физиологические показатели работы организма: частоту дыхания и сердечных сокращений, кровяное давление [6], а также влияет на нейрональную активность [7].

В исследованиях локомоции традиционно, начиная с работ Тиле и Шеррингтона [8, 9], преимущественно использовались децеребрированные кошки [10]. Децеребрированный препарат, в отличие от интактной кошки, позволяет исследовать механизмы локомоции, управляемой спинальными и стволовыми нейронными сетями. Ходьба децеребрированной кошки в остром эксперименте более стабильна и хорошо координирована, чем у спинальной [11]. В настоящее время кошек все реже используют в качестве лабораторных животных по этическим соображениям [12] (тем не менее, см. работы [13, 14]). Хорошей альтернативой в таком случае могут стать децеребрированные препараты грызунов (крыс и мышей), обладающих рядом преимуществ, среди которых: бóльшая доступность животных, генетическая однородность линий, возможность использования трансгенных моделей [15].

Актуальность исследования обусловлена тем, что ряд методов посттравматического восстановления ходьбы у человека [16] направлен на модуляцию спинальных сетей, например, посредством электрической стимуляции спинного мозга, что диктует важность их изучения на животных моделях. Следует отметить, что степень восхождения спинного мозга крысы сходна с таковой у человека (сегменты спинного мозга крысы смещены относительно одноименных позвонков более рострально, чем у кошки). Кроме того, в отличие от кошки, которая является пальцеходящей, крыса, как и человек – стопоходящие [17]. Эти особенности могут быть существенны при выборе именно крысы в качестве животной модели для изучения спинальных нейронных сетей, а также трансляции в клиническую практику экспериментальных результатов применения электростимуляции спинного мозга.

Мы задались вопросом, возможно ли использование децеребрированных крыс в качестве замены кошек для исследования локомоторных сетей в острых экспериментах. Однако, в известных нам из литературных источников исследованиях локомоции широко используются преимущественно хронические спинальные крысы [17–20]. В отличие от спинальной, локомоторные способности децеребрированной крысы изучены лишь во время спонтанной ходьбы [21] или же при стимуляции мезэнцефалической локомоторной области (МЛО) [21–24]. Исследований ЭС поясничного утолщения для инициации локомоции на модели децеребрированной крысы до сих пор не проводилось.

Цель работы – изучение особенностей функционирования сенсомоторной системы децеребрированной крысы при электрической эпидуральной стимуляции (ЭС) поясничного утолщения спинного мозга в остром эксперименте. Практическая задача работы – оценка качества локомоции, потенциально возможной на модели децеребрированной крысы. Поскольку особенности локомоции кошки значительно зависят от уровня децеребрации [25], анализировали также зависимость различных показателей возбудимости спинальных и супраспинальных сетей крысы (тоническая активность, вызванные ответы мышц конечностей [26, 27]) от уровня децеребрации. Основное внимание уделялось активности задних конечностей как основной мишени ЭС поясничного утолщения.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выборка. Опыты были выполнены на 16-и децеребрированных крысах, самцах линии Вистар массой тела 250–300 г. Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с требованиями Директивы Совета Европы 2010/63EU Европейского парламента о защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Протокол исследования № 131-03-06 от 12 декабря 2022 г. был одобрен Этическим комитетом в области исследований на животных СПбГУ.

Хирургические процедуры. Животных наркотизировали смесью изофлурана (Laboratories Karizoo, S.A., Испания) на кислороде (4–5% для индукции и 1–2% для поддержания анестезии, скорость 0.8 л/мин, наркозно-дыхательный аппарат Зоомед, Россия). Производили билатеральную имплантацию биполярных миографических электродов в мышцы передних (двуглавую (mm. biceps brachii, Bi) и трехглавую (triceps brachii, Tr) мышцы плеча) и задних конечностей (переднюю большеберцовую (mm. tibialis anterior, TA) и медиальную икроножную (gastrocnemius medialis, GM) мышцы голени). Одному животному имплантировали электроды справа в большую приводящую (mm. adductor magnus, Add) и среднюю ягодичную (gluteus medius, Gl)) мышцы задних конечностей, а также в дорсальный аддуктор хвоста (m. abductor caudae dorsalis, ACD). Электроды представляли собой пару проводов из нержавеющей стали в тефлоновой изоляции (AS632, Cooner Wire, Chatsworth, CA, США) диаметром 0.15 и 0.3 мм (в зависимости от размера исследуемой мышцы) с участками без изоляции длиной 0.5 мм.

Перед выполнением децеребрации этилоном 4.0 (Ethicon, США) накладывали лигатуры на сонные артерии, затем голову крысы закрепляли в стереотаксис и производили разрез кожи головы по средней сагиттальной линии (рис. 1a). Далее удаляли надкостницу и выравнивали голову животного так, чтобы точка сращения затылочных и теменных костей (lambda) и точка сращения теменных и лобных костей (bregma) находились на горизонтальной линии (рис. 1b). При помощи микрощипцов Люэра выполняли билатеральную краниотомию, включающую удаление теменной и частично лобной костей, не затрагивая медиального шва между ними (рис. 1c). Для предотвращения кровотечения из переднего сагиттального синуса накладывали лигатуры этилоном 4.0 на краниальный и каудальный участки этих костей с подхватом синуса (рис. 1d). Далее костный мостик между лигатурами удаляли, как описано у Добсона и Харриса [28] (рис. 1e). После снятия твердой мозговой оболочки, кюреткой удаляли кору головного мозга так, чтобы открыть доступ к пластинке четверохолмия. Затем лезвием, закрепленным в держателе стереотаксиса под углом 65°–90°, выполняли отсечение части головного мозга рострально от передних холмиков (рис. 1f, g), эту часть затем удаляли при помощи шпателя. В полость черепа помещали ватные тампоны и, при необходимости, гемостатические губки. Температуру тела в процессе процедуры децеребрации поддерживали на уровне 34–35°C, как рекомендовано [29]. Вся процедура подготовки и собственно децеребрации занимала около 40 мин.

Рис. 1.

Методика проведения эксперимента. (a–g) Череп животного на различных этапах проведения децеребрации: (a) – местоположение разреза кожи и точек “lambda” и “bregma” на черепе, вид сверху; (b) – местоположение точек “lambda” и “bregma”, и горизонтальная линия между ними на черепе, вид сбоку; (с) – местоположение предполагаемых краниотомий (пунктиром) справа и слева относительно точек “lambda” и “bregma”; (d) – местоположение накладываемых лигатур (ligatures) и костный мостик (bone bridge) после выполнения краниотомий билатерально. (e) – Вид на поверхность коры головного мозга после удаления костного мостика. (f) – Положение децеребрационного среза относительно пластинки четверохолмия после удаления коры головного мозга, SC – передние холмики, IC – задние холмики; (g) – положение и угол децеребрационного среза относительно линии “лямбда–брегма”, вид сбоку; (h) – схема экспериментальной установки для регистрации вызванных потенциалов и вызова ходьбы.

Гистологический контроль. После окончания эксперимента животных глубоко анестезировали смесью изофлурана на кислороде (4–5%) и проводили транскардиальную перфузионную фиксацию головного и спинного мозга 4% раствором параформальдегида (Merck, USA) на 0.1 М фосфатном буфере (Росмедбио, Россия). После вскрытия позвоночного канала определяли точное положение точек ЭС относительно сегментов спинного мозга. Затем извлекали головной мозг и помещали в 30% раствор сахарозы. Для определения рострокаудального уровня децеребрации (у 10 животных) на замораживающем микротоме изготавливали парасагиттальные срезы головного мозга толщиной 50 мкм, которые затем монтировали на предметные стекла и окрашивали 4% крезилвиолетом (рН 4.5) по методу Ниссля. При микроскопии срезов билатерально отмечали положение красных ядер (nucleus ruber) и черной субстанции (substantia nigra, SN), а также оценивали степень их повреждения.

Электрофизиологическое исследование. Для проведения электрофизиологических экспериментов была разработана экспериментальная установка (рис. 1h). Позвоночник крысы закрепляли зажимами в области поперечных отростков позвонков VТ11-VТ12 и VL4-VL5 в специально сконструированной раме. Производили ламинэктомию позвонков VТ13–VL2, чтобы открыть доступ к сегментам L1–S3 спинного мозга. ЭС дорсальной поверхности спинного мозга осуществляли прямоугольными бифазными импульсами монополярно (Model 2100, A-M Systems, Sequim, WA, США) при помощи серебряного шарикового электрода диаметром 0.5 мм. Индифферентный электрод, изготовленный из иглы 21G, располагался под кожей живота. За 20–30 мин до начала эксперимента анестезию отключали, а температуру тела животного повышали до 37°C [29]. Эксперимент начинали через 40–50 мин после проведения децеребрации.

Для вызова ходьбы передние и задние конечности крысы помещали на движущуюся ленту моторизованного тредбана. Рандомизированно осуществляли ЭС (5–40 Гц, 25–300 мкА) различных точек поверхности спинного мозга внутри ламинэктомии. Расстояние между соседними точками ЭС составляло 2 мм. Поскольку положение поясничных и крестцовых сегментов спинного мозга крысы относительно позвонков варьирует (см. различия положений сегментов в [30] (рис. 1) и [31] (рис. 1b, Supplement)), точное определение стимулируемого сегмента производили post-mortem на основании положения дорсальных корешков. К ЭС последующей точки переходили в случае получения стабильной квадрипедальной ходьбы в данной точке или же после длительного безуспешного перебора различных сочетаний частоты и силы тока ЭС. Эксперимент прекращали, если стабильную квадрипедальную ходьбу при переборе всех точек ЭС вызвать не удавалось, или при ухудшении состояния животного. Длительность эксперимента не превышала 9 ч.

При записи тонической активности и вызванных потенциалов передние и задние конечности крысы касались неподвижной ленты тредбана. Вызванные потенциалы мышц регистрировали при ЭС (частота 1 Гц, длительность импульса 0.2–0.3 мс, сила тока 10–100 мкА, шаг 10 мкА) сегмента L2. На каждом токе регистрировали 10 ответов. Для анализа вызванных потенциалов использовали среднюю амплитуду сенсорного компонента, выделенного на основе своей латентности (более 6 мс), ответов TA и GM, полученную на субмаксимальном токе, 70 мкА. На этом токе сенсорный компонент был выражен у большинства животных. Сигналы от ЭМГ электродов усиливались (Model 1700, A-M Systems, Sequim, WA, США) и оцифровывались с частотой дискретизации 20 кГц (LTR-EU-16, АЦП LTR11, L-Card, Москва, Россия).

Для анализа тонической активности ректифицировали и усредняли ЭМГ-активность на протяжении 3–5 с, в течение которых крыса была неподвижна. При локомоции ЭМГ активность фильтровали в диапазоне 100–2000 Гц, ректифицировали и усредняли в рамках цикла ходьбы, определяемого на основе покадрового анализа видео. Нормировка осуществлялась в рамках каждой мышцы каждого животного так, чтобы площадь под кривой ЭМГ составляла 100%. Обработка ЭМГ проводилась в пакете прикладных программ для решения задач технических вычислений MATLAB (Mathworks, Natick, MA, США) с помощью специализированных скриптов, разработанных авторами статьи.

Исследование кинематики. Чтобы охарактеризовать кинематику локомоторных движений задних конечностей, на гребне подвздошной кости, головке бедра, латеральном мыщелке бедра, латеральной стороне лодыжки и пятом плюсневом суставе были установлены маркеры, а вид сбоку (слева и справа) шагающей крысы был записан на видео (100 кадров/с). Для расчета длины и длительности шага, а также объема движения в суставах видеозаписи анализировались покадрово. Углы в тазобедренном, коленном и голеностопном суставах измеряли в тот момент, когда конечность была максимально согнута во время фазы переноса, и в момент, когда она была максимально вытянута в фазе опоры. Диапазоны изменения углов были рассчитаны как разность между этими значениями для каждого сустава.

Аналогично [32], для оценки качества межконечностной координации и последующего сравнения с известными значениями показателей локомоции децеребрированных кошек, рассчитывали коэффициенты асимметрии длины и периода шага. Лучшей межконечностной координации отвечает меньший коэффициент асимметрии. Коэффициент асимметрии длины шага вычисляли как: $\left| {{{S}_{{{\text{left}}}}} - {{S}_{{{\text{right}}}}}} \right|{\text{/}}{{S}_{{{\text{left}}}}} + {{S}_{{{\text{right}}}}},$ где S_left и S_right – длины шагов левой и правой конечности соответственно. Длина шага рассчитывалась как расстояние между положением лапы в начале и в конце фазы опоры. Коэффициент асимметрии периода шага рассчитывали аналогично: $\left| {{{T}_{{{\text{left}}}}} - {{T}_{{{\text{right}}}}}} \right|{\text{/}}{{T}_{{{\text{left}}}}} + {{T}_{{{\text{right}}}}},$ где T_left и T_right – периоды шагов левой и правой конечности соответственно. От каждого животного для анализа брали одну пробу с минимальным значением асимметрии длительности шага.

Ранее мы выявили, что такие характеристики вызванной ЭС локомоции, как длительность задержки ходьбы (время от начала стимуляции до начала ходьбы) и выраженность постэффекта (длительность ходьбы после прекращения стимуляции) различны у разных видов локомоции [33]. Поэтому в данной работе мы также оценили эти характеристики.

Статистический анализ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость отличий распределений различных параметров в зависимости от степени повреждения SN оценивали с помощью непарного критерия Манна–Уитни на уровне p < 0.05 (объектом исследования являлась задняя конечность животного) с помощью программного обеспечения для статистической обработки данных Prism 7.0 (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гистологическое исследование. Согласно описанию процедуры децеребрации, у всех животных передние холмики были интактными билатерально (преколликулярный уровень децеребрационного среза). Гистологическое исследование парасагиттальных срезов мозга децеребрированных крыс, у которых была возможность взять гистологический материал (n = 10), показало, что у 4-х животных мамиллярные тела были сохранены (премамиллярный уровень), у 5-ти разрез проходил по мамиллярным телам (трансмамиллярный уровень) и у одного животного мамиллярные тела были удалены (постмамиллярный уровень). У всех крыс были интактными красные ядра; у части животных (6/10) была в разной степени повреждена SN (трансмамиллярный и постмамиллярный уровень), тогда как у остальных (4/10) она оставалась интактной (премамиллярный уровень). Примеры гистологических срезов мозга крыс с разной степенью повреждения SN, а также схема положения децеребрационного разреза у всех животных относительно структур головного мозга, представлены на рис. 2.

Рис. 2.

Положение децеребрационного разреза относительно черной субстанции (SN) и других структур мозга. (a) – Рисунки парасагиттальных срезов среднего мозга отдельных крыс после децеребрации, SN отмечена черным. (b) – Положение децеребрационных разрезов всех исследованных крыс на схеме среднего мозга. SC – Передние холмики, IC – задние холмики, RN – красное ядро, MB – мамиллярные тела, VTA – вентральная тегментальная область, Hb – хабенула, Pn – ножки мозжечка.

Общие особенности поведения децеребрированных крыс. Все децеребрированные крысы, как с постмамиллярной, так и с трансмамиллярной и премамиллярной перерезкой, обнаруживали высокую степень активности после децеребрации: они проявляли способность к спонтанным ритмическим локомоторно-подобным движениям конечностей, перемежающихся с периодами покоя, у них частично оставались способности к установочным рефлексам (периодически они поднимали голову и плечевой пояс). В периоды активности они отвечали вздрагиванием, поворотом головы или локомоторной активностью на звуки, прикосновения и ноцицептивные стимулы (уколы), даже в более выраженной степени, чем интактные животные. Этим была вызвана необходимость продолжать ингаляционную анестезию после проведения процедуры децеребрации, во время закрепления животного в стереотаксической раме. Некоторые животные начинали спонтанно ходить при движении ленты тредбана или прикосновении к плантарной поверхности стопы или хвосту.

Локомоция под действием ЭС. Из 16-ти крыс вызов локомоции при ЭС был возможен у 13-ти. У различных животных, а также в различных пробах у одного животного, число задействованных при локомоции конечностей было разным, то есть наблюдалась квадрипедальная, трипедальная (участвовали две передние конечности и одна задняя), бипедальная (участвовали две передних, две задних или одна передняя и одна задняя конечности) или унипедальная (одна задняя конечность) ходьба. Конечности, не принимающие участие в ходьбе, как правило,были согнуты и прижаты к телу. На рис. 3а указано число крыс, у которых удалось хотя бы в одной пробе вызвать локомоцию с максимальным числом движущихся конечностей. Например, если у животного в 10 пробах с различными параметрами ЭС была вызвана трипедальная ходьба, а в одной – квадрипедальная, то оно отнесено в столбец “квадрипедально”, в табл. 1 указаны параметры ЭС, необходимые для вызова именно квадрипедальной ходьбы. Из рисунка видно, что бипедальную ходьбу задними конечностями удалось вызвать у 1 из 16 крыс (6%), квадрипедальную – у 5 из 16 крыс (31%). Число задействованных конечностей (в дальнейшем, режим ходьбы) не зависело от того, какой сегмент спинного мозга стимулировали (табл. 1).

Рис. 3.

Ходьба, обусловленная эпидуральной стимуляцией. (a) – Число крыс, у которых удалось вызвать различные режимы ходьбы: no – отсутствие ходьбы, 1 hindlimb – одной задней конечностью, 1 hindlimb, 1 forelimb – одной передней и одной задней, two forelimbs – бипедальн передними, two hindlimbs – бипедально задними, tripedal – трипедально, quadripedally – квадрипедально. Для каждой крысы указан режим ходьбы с максимальным числом движущихся конечностей. (b) – ЭМГ мышц передних и задних конечностей, отвечающих преимущественно за флексию и экстензию, при квадрипедальной ходьбе крысы. Tr – triceps brachii, Bi – biceps brachii, TA – tibialis anterior, GM – gastrocnemius medialis. L – левая конечность, R – правая конечность, Stim – канал стимуляции, Step – периодичность фаз ходьбы, перенос (swing, белые прямоугольники) и опора (stance, черные прямоугольники). (c) – ЭМГ в цикле шага при квадрипедальной ходьбе или бипедальной ходьбе задними конечностями (n = 12 мышц). Среднее ± стандартное отклонение.

Следует отметить, что некоторые животные, у которых не удавалось вызвать квадрипедальную ходьбу при помощи ЭС, были способны к спонтанной координированной квадрипедальной ходьбе. Также отметим, что для разных животных использовали разную частоту ЭС: часть крыс могли ходить максимальным числом конечностей на более низких частотах (3–5 Гц, 69%), другие – на более высоких (20–40 Гц, 31%). При этом четкой зависимости между локомоторными способностями и частотой стимуляции мы не выявили: как в пределах индивидуального животного, так и при групповом сравнении.

Пример работы мышц передних и задних конечностей при квадрипедальной ходьбе приведен на рис. 3b. Как можно видеть, контрлатеральные экстензоры (Tr, GM) передних и задних конечностей работают в фазе с испилатеральными флексорами (Bi, TA), в то время как ипсилатеральные экстензоры и флексоры работают, как правило, в противофазе, что свидетельствует о сохранности межконечностной координации. При квадрипедальной или бипедальной ходьбе задними конечностями в среднем активность экстензора GM имеет менее выраженный максимум в фазу опоры по сравнению с активностью флексора TA, которая имеет ярко выраженный максимум в фазу переноса (рис. 3c). У животного, у которого были имплантированы электроды в мышцы Add и Gl, в фазу опоры регистрировалась не только активность GM, но и этих двух мышц; также наблюдались ритмические движения хвоста (ритмическая активность ACD) (рис. 4). Выявленная согласованная работа мышц приводит к стабильной ходьбе. Однако такую координированную ходьбу, продолжающуюся значительное количество проб подряд, удалось вызвать лишь у двух животных.

Рис. 4.

ЭМГ мышц, предположительно отвечающих за постуральный контроль, при квадрипедальной ходьбе крысы. Add – adductor magnus, GM – gastrocnemius medialis, Gl – gluteus, TA – tibialis anterior, ACD – abductor caudae dorsalis. R – правая конечность, Stim – канал стимуляции, Step – периодичность фаз ходьбы, перенос (swing, белые прямоугольники) и опора (stance, черные прямоугольники).

Длительность задержки квадрипедальной ходьбы была крайне вариабельной и составляла от 0.5 с до 10 с для различных животных. Постэффект практически отсутствовал; после отключения ЭС одна крыса совершила 2 шага, а пять крыс полностью прекращали ходьбу.

Усредненные характеристики кинематики задних конечностей 6-ти крыс, у которых наблюдалась квадрипедальная ходьба или бипедальная ходьба обеих задних конечностей, представлены на рис. 5. Средняя длина шага составила 5.9 ± 2.4 см, средняя длительность – 0.8 ± 0.3 с (длительность переноса: 0.3 ± 0.1 с, длительность опоры: 0.5 ± 0.3 с). Асимметрия длины и длительности шага составили 0.15 ± 0.12 и 0.06 ± 0.05 соответственно. Наибольший объем движения наблюдался в голеностопном суставе (93° ± 35°), наименьший – в коленном суставе (13° ± 10°), объем движения в тазобедренном суставе составил 20° ± 14°.

Рис. 5.

Характеристики локомоции задних конечностей децеребрированной крысы при эпидуральной стимуляции. (a) Длина шага, см (n = 12 задних конечностей). (b) – Длительность фаз ходьбы, с: Swing – перенос, Stance – опора, Step – шаг (n = 12 задних конечностей). (c) – Объем движения в суставах: Hip – тазобедренный, Knee – коленный, Ankle – голеностоп (n = 12 задних конечностей). (d) – Асимметрия длины (Length) и длительности (Duration) шага (n = 6 пар задних конечностей).

Зависимость характеристик ходьбы децеребрированной крысы от рострокаудального уровня децеребрации. Распределение крыс по режимам ходьбы не зависело от того, повреждена ли SN. И при поврежденной, и при интактной SN у ряда крыс удавалось вызвать квадрипедальную, а у иных – лишь унипедальную ходьбу (рис. 6g). ЭМГ активность TA и GM в цикле шага при би- или квадрипедальной ходьбе также не зависит от повреждения SN (рис. 6h, i). Между тем в группе крыс с поврежденной SN длительность шага выше, чем в группе крыс с интактной SN (0.66 ± 0.14 с и 1.05 ± ± 0.23 с соответственно, p < 0.01), за счет увеличения длительности опоры, которая составляет 0.64 ± 0.30 c, по сравнению с 0.31 ± 0.08 с у крыс с интактной SN (p < 0.01).

Рис. 6.

Влияние повреждения substancia nigra (SN) на сенсорный компонент вызванного ответа, тоническую активность мышц и режим ходьбы. (a) – Пример усредненных вызванных ответов при интактной (intact) и поврежденной (damaged) SN. Амплитуда сенсорного компонента вызванного ответа TA (b) и GM (c) при электрической эпидуральной стимуляции сегмента L2 (сила тока 70 мкА) при интактной (n = 8 мышц) и поврежденной (n = 12 мышц) SN. (d) – Пример тонической ЭМГ. Тоническая активность TA (e) и GM (f) при интактной (n = 8 мышц) и поврежденной (n = 12 мышц) SN. (g) – Число лап, активных при локомоции. ЭМГ в цикле шага TA (h) и GM (i) при квадрипедальной ходьбе или бипедальной ходьбе задними конечностями при интактной (n = 8 мышц) и поврежденной (n = 12 мышц) SN. Stance – опора, Swing – перенос, L – левая конечность, R – правая конечность, TA – tibialis anterior, GM – gastrocnemius medialis. Среднее ± Стандартное отклонение. * – p < 0.05

Вызванные мышечные потенциалы и тоническая активность. Амплитуда сенсорного компонента вызванных ответов TA и GM при стимуляции сегмента L2 (рис. 6a) у крыс с поврежденной SN несколько выше по сравнению с крысами с интактной SN (рис. 6b, 6c). У крыс с поврежденной SN амплитуда ответов TA составляет 0.30 ± 0.27 мВ, у крыс с интактной SN 0.21 ± 0.25 мВ (p = 0.63); в группе крыс с поврежденной SN амплитуда ответов GM составляет 0.85 ± 0.84 мВ, у крыс с интактной SN 0.15 ± 0.18 мВ (p = 0.03). Сходным образом, у крыс с поврежденной SN тоническая активность этих мышц (рис. 6d) выше, чем у крыс с интактной SN: как у TA (1.19 ± 0.62 и 0.58 ± 0.37 мкВ соответственно, p = 0.01), так и у GM (1.45 ± 1.15 и 0.66 ± ± 0.42 мкВ соответственно, p = 0.22) (рис. 6e, f).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Общие особенности поведения децеребрированных крыс. Децеребрированные крысы рассматриваются как модель для изучения пищевого поведения [34], регуляции дыхания [29, 35], работы сердечно-сосудистой [36, 37] и мочевыделительной системы [38]. Однако при изучении локомоторной системы децеребрированный препарат крысы применяется не так широко, как препарат децеребрированной кошки [3–5, 39–42]. Это может быть связано с тем, что децеребрированные крысы обладают высоким уровнем спонтанной активности. Они совершают локомоторные движения и даже “попытки” бега [29], часто непредсказуемо реагируют на различные внешние раздражители, такие как укол [43] или прикосновение [44]. Высоким уровнем спонтанной активности эти препараты напоминают преколликулярный-премамиллярный препарат кошки [45], который способен к спонтанной локомоции при свободно движущейся ленте тредбана в остром эксперименте. Однако, как в нашей работе, так и в работах других авторов, спонтанную активность проявляли крысы не только с премамиллярной [36, 46], но и с постмамиллярной [21, 44] перерезкой. Отсутствие спонтанной активности у преколликулярно-постмамиллярно децеребрированной кошки делает ее моделью, более удобной для управления путем внешних воздействий, по сравнению с преколликулярно-постмамиллярной крысой. Тем не менее модель преколликулярно-постмамиллярной децеребрированной крысы позволила провести картирование мышечных сенсорных и моторных потенциалов, вызванных с помощью предложенного нами метода чрескостной стимуляции спинного мозга [47].

Отсутствие спонтанной ходьбы кошки связано с тем, что некоторые структуры головного мозга оказываются отсечены более каудальной плоскостью децеребрации. Между тем большая часть структур рассматриваемой зоны у крысы занимает приблизительно такое же, как у кошки, положение по отношению к плоскости среза. Немногими исключениями, согласно литературным данным, являются красные ядра и вентральная область покрышки (VTA) (см. [25, рис. 1; 48]). Гистологический анализ показал, что при используемых уровнях децеребрации крысы красные ядра, влияющие на активность флексоров передних и задних конечностей [49, 50], остаются интактными (рис. 2). Между тем красные ядра не влияют на возможность инициации локомоции как таковой. Напротив, VTA, которая, согласно некоторым литературным данным, отвечает за возникновение спонтанной локомоции [48], повреждается у части крыс выборки при проведении постмамиллярной и (у части крыс) трансмамиллярной децеребрации. Однако повреждение VTA незначительно влияет на их спонтанную активность, возможно, из-за небольшого объема этого повреждения (рис. 2). Результаты позволяют предполагать бо́льшую, по сравнению с кошкой, функциональную роль стволовых и мезэнцефальных структур головного мозга крысы в инициации и управлении локомоторной активностью.

Локомоция, обусловленная ЭС. При рассечении головного мозга на преколликулярном уровне, спинальная зона вызова ходьбы вперед с помощью ЭС у крыс столь же широка в рострокаудальном направлении (сегменты L2-S1, см. табл. 1), как и у кошек [32], но несколько смещена рострально, так как мотонейронные пулы задних конечностей у крысы расположены в более ростральных, чем у кошки, сегментах спинного мозга [51, 52]. Параметры ЭС для вызова ходьбы децеребрированных крыс и кошек [32] сходны (как правило, частота 5 Гц, сила тока 50–200 мкА, см. табл. 1). Также у этих двух моделей сходен период шагов.

Распределение децеребрированных крыс по режимам вызываемой ЭС ходьбы отличается от такового для децеребрированной кошки. Во-первых, наш собственный опыт показывает, что вызвать бипедальную ходьбу вперед задними конечностями у децеребрированной кошки значительно легче, чем у децеребрированной крысы (обеими задними конечностями ходило лишь 38% крыс, и то – если засчитывать единичные успешные попытки).

Во-вторых, при ЭС поясничного утолщения децеребрированные кошки, как правило, ходят бипедально [53], а не квадрипедально (квадрипедальная ходьба вызывается стимуляцией шейного отдела [53–55]). Напротив, среди способных к локомоции крыс, пять ходили квадрипедально и лишь одна – бипедально задними конечностями.

Структуры, частично ответственные за контроль локомоции передних конечностей (поля Фореля, субталамическое ядро) [56], расположены у крысы и у кошки приблизительно на одинаковом уровне по отношению к плоскостям децеребрации. Однако у кошки при премамиллярной децеребрации спонтанная квадрипедальная ходьба наблюдается менее, чем у половины животных [57]; при движении передних конечностей нередко заметно нарушение координации [58]. При более каудальных положениях плоскости децеребрации у кошки спонтанная локомоция отсутствует, а ходьбу передних конечностей, вызванную стимуляцией МЛО или движением ленты тредбана, возможно получить только после дополнительной спинализации препарата в нижнегрудном отделе [59, 60].

Известно, что восходящая проприоспинальная система значительно модулирует активность локомоторных сетей шейного утолщения [61, 62]. Одно из возможных объяснений вышеупомянутых феноменов – бóльшее возбуждающее влияние проприоспинальных волокон крысы по сравнению с кошкой, у которой при тех же уровнях децеребрации доминируют тормозные проприоспинальные влияния [59]. Принимая во внимание небольшой размер крыс, можно предположить, что у них во время ЭС происходила активация этих волокон, локализованных в пределах латерального канатика [63], и как следствие – активация шейного генератора шаганий.

В-третьих, наши собственные данные показывают, что при ЭС дорсальной поверхности спинного мозга децеребрированные кошки, как правило, не демонстрируют ходьбу вперед только одной задней конечностью; даже латеральное смещение электрода от центральной линии незначительно влияет на качество бипедальной ходьбы вперед [33], что отражает сохранность межконечностной координации. Унилатеральная ходьба возможна, например, при интраспинальной микростимуляции – у спинальных кошек [64, 65] или же при унилатеральной стимуляции дорсального корешка спинного нерва – у децеребрированных [66] или спинальных [65] кошек. Напротив, в настоящем исследовании, из 12 крыс, способных к локомоции задними конечностями, половина демонстрировали нарушения межконечностной координации: четыре крысы ходили трипедально, одна – унипедально и одна – одной задней и одной передней конечностями. Подобные данные получены и на хронических спинальных крысах во время ЭС [17]. Число спинальных крыс, способных к координированной ходьбе при ЭС сегмента L2, стимуляция которого наиболее часто приводила к вызову локомоции, составляло лишь 74%; остальные крысы при такой ЭС ходили унилатерально. Латеральное смещение электрода при ЭС хронических спинальных крыс также приводит к унипедальной ходьбе [18]. Предположительно полученные данные свидетельствует о большем вкладе в вызванную ЭС локомоцию децеребрированной крысы спинальных нейронных сетей, даже незначительный дисбаланс в активности которых приводит к нарушению межконечностной координации и локомоции в целом.

В пользу этого предположения также свидетельствует то, что и асимметрия длины, и асимметрия длительности шага децеребрированной крысы выше, чем у децеребрированной кошки [67]. Отметим, что у спинальных кошек асимметрия ходьбы при интраспинальной микростимуляции также выше, чем при ходьбе, обусловленной щипанием хвоста [65].

Важно отметить, что длительность задержки вызванной ЭС ходьбы крысы выше, а длительность пост-эффекта ниже, чем у кошки [33], что, вероятно, говорит о меньшей степени рекрутируемости спинальных сетей крысы в используемом экспериментальном дизайне.

Поддержание равновесия при локомоции, обусловленной ЭС. Объем движения в тазобедренном суставе у децеребрированной крысы был подобен объему движения интактной крысы, известному из литературных данных [68]. При этом объем движения в коленном суставе был ниже, а в голеностопе – выше, чем при ходьбе интактного животного [68]. Иной объем движения в суставах может быть связан с особенностями закрепления животного в стереотаксической раме, равно как и активность GM в фазе опоры, которая была выражена в меньшей степени, чем активность TA в фазу переноса. Однако при этом в фазу опоры наблюдалась активность мышц Add и Gl, подобная той, что наблюдается у интактной крысы [21]. Такая активность, присущая и децеребрированной кошке при незакрепленном тазе [40], может быть связана с тем, что крыса в нашем эксперименте фиксировалась в стереотаксической раме только за остистые отростки позвонков; таз при этом оставался свободным. Вместе с выявленной нами циклической активностью мышц хвоста (ACD), аналогичной функции хвоста у кошек [69] и собак [70], активность Add и Gl может использоваться для поддержания равновесия децеребрированной крысы при ходьбе.

Влияние ростро-каудального уровня децеребрации на характеристики модели крысы. Поскольку децеребрация неизбежно приводит к нарушению целостности ряда структур головного мозга, в частности тех, что отвечают за моторный контроль, мы сравнили локомоторные способности у двух групп: с поврежденной и интактной SN. Ретикулярная часть SN (SNr) оказывает модулирующее действие на активность локомоторных сетей (см. [22, 71, 72]). При повреждении SN вследствие преколликулярно-постмаммиллярной децеребрации вызов локомоции во время стимуляции МЛО у крысы [22] и кошки ([25], см. рис. 1, наиболее каудальная плоскость децеребрации) невозможен. Между тем другим авторам [21] удалось вызвать локомоцию крысы при таком же экспериментальном дизайне. Нам удалось инициировать локомоцию и при поврежденной SN, что, возможно, еще раз свидетельствует о большем вкладе спинальных нейронных сетей в локомоцию, обусловленную ЭС спинного мозга.

Мы также обнаружили разный уровень тонической активности мышц и амплитуды сенсорного компонента вызванного ответа мышц у животных с поврежденной и интактной SN. Более высокий уровень тонической активности и бóльшая амплитуда сенсорного компонента при повреждении SN хорошо согласуются с данными об увеличении как тонической активности [73], так и амплитуды ответа TA и GM, вызванного пассивным движением [74], при разрушении нигростриарных путей при инъекции оксидопамина в SN крысы.

Таким образом, для использования крысы, децеребрированной на преколликулярном уровне, в задаче изучения контролируемой локомоции необходимо проведение дополнительных исследований. При этом имеющаяся модель позволяет успешно исследовать общую тоническую активность мышц и их вызванные ответы.