Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2023, T. 109, № 7, стр. 946-953

ВВЕДЕНИЕ

Осмотическое концентрирование и разведение мочи являются адаптивными процессами, направленными на поддержание гомеостаза внутренней среды. Оба экскреторных механизма зависят от гормональной регуляции мочевыделительной функции почек и реализуются через изменение морфологических и биохимических свойств канальцевого аппарата. Эпителиальная выстилка почечных канальцев с внешней стороны тесно контактирует с базальной мембраной, образованной высокомолекулярными белками и протеогликанами. Белковая фракция представлена в основном коллагеном и ламинином. Фибриллярный коллаген формирует густую трехмерную сеть, выполняющую функцию поддерживающего скаффолда, стабилизирующего эпителиальную ткань, а водорастворимый ламинин осуществляет динамичное взаимодействие белков базальной мембраны с интегринами эпителиальных клеток. Белковые комплексы ламинина инициируют процесс формирования и реорганизации базальной мембраны, связываясь с рецепторным аппаратом клеток и другими молекулами внеклеточного матрикса, задействованными в регуляции барьерной и обменной функции [1, 2]. Молекула ламинина имеет структуру гетеротримера, состоящего из трех типов пептидных цепей, собранных в форме креста. Три коротких ветви представляют одноцепочечные N-концевые ответвления от альфа-, бета- и гамма- пептидных цепей, способные объединяться с другими молекулами ламинина при образовании светлой базальной пластинки. Наиболее длинная четвертая ветвь собрана из С-концевых отделов всех трех пептидов, и через данный фрагмент осуществляется взаимодействие с коллагеном темной базальной пластинки и клеточными интегринами [3]. Эпителиальные ткани экспрессируют преимущественно ламинин 332. Цифры в названии белка обозначают конкретные варианты цепей, входящие в состав тканеспецифичного ламинина. Изоформа ламинина 332 представляет гетеротример, собранный из альфа 3-, бета 3-, гамма 2-подтипов пептидных мономеров [4, 5]. Пептиды ламинина связаны между собой дисульфидными мостиками и распадаются на отдельные молекулы под действием восстановителей в денатурирующих условиях. Различные типы пептидных цепей кодируются гомологичными генами, локализованными в разных хромосомах [6]. Уровень экспрессии генов отдельных цепей ламинина изменяется при заживлении ран или канцерогенезе, а также в экстремальных физиологических условиях [5, 7, 8]. Актуальной задачей является анализ реакции ламинина почечной паренхимы на продолжительное функционирование в состоянии гипергидратации и дегидратации.

Корковое и мозговое вещество почки различаются по составу канальцев и строению эпителиальной выстилки. В коре локализованы структуры нефрона, преимущественно связанные с осмотическим разведением и начальными стадиями концентрирования первичной мочи. В мозговом слое преобладают собирательные трубки, в которых происходит факультативная реабсорбция воды за счет изменения проницаемости канальцевых стенок для воды и повышения осмолярности медуллярного интерстиция. В этой связи целью работы было исследование реакции ламинина базальной мембраны эпителия на действие продолжительной контрастной физиологической нагрузки на почку с учетом локализации белка во внешнем или внутреннем слое почечной паренхимы.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на взрослых крысах линий WAG и Brattleboro массой тела 200–250 г. На протяжении всего эксперимента животные находились в стандартных условиях вивария с 12-часовым световым режимом, температурой в пределах 20 ± 2°С и влажностью 40–60%. В каждой линии было задействовано по 20 самцов, представленных двумя группами по 10 крыс. Группы различались альтернативным режимом доступа к воде. Одна группа получала в качестве питья и еды только 4%-ный раствор сахарозы, другая была лишена доступа к питьевой воде и потребляла стандартный гранулированный корм для животных вивария. Лабораторные грызуны сравнительно безболезненно переносят такие нагрузки на мочевыделительную систему, мыши – продолжительностью двое суток, крысы – до трех суток [9]. В нашем эксперименте тестирование продолжалось в течение 60 ч и в итоге приводило либо к гипергидратации, либо к состоянию дегидратированности организма. В начале и конце срока испытания собирались пробы мочи, а в завершение эксперимента после анестезии тиопенталом натрия (10 мг/100 г массы тела, внутрибрюшинно) почки извлекались для последующего биохимического анализа. Осмолярность экскретируемой мочи измеряли криоскопическим методом [10] на криоскопическом миллиосмометре МТ-2 (“Буревестник” Санкт-Петербург). Из декапсулированной почки выделяли фрагменты коркового и мозгового вещества, взвешивали и гомогенизировали на льду в лизирующем растворе следующего состава (в мМ): 300 сахарозы, 25 имидазола, 1 ЭДТА, 1 PMSF, pH 7.2. Гомогенаты осветляли центрифугированием при следующих условиях: ускорение 2000 g, 10 мин при 0°C. Белки супернатанта фракционировали электрофорезом в полиакриламидном геле (5% концентрирующий 0.15 М Трис-HCl рН 6.8, 10% разделяющий 0.4 М Трис-HCl pH 8.8) в денатурирующих условиях [11]. Буфер для нанесения белковых проб содержал 2.5% додецилсульфата натрия, 0.5% β-меркаптоэтанола, 50% глицерола, 1% бромфенолового синего, 0.15 М Трис-HCl, pH 6.8. Белки денатурировали в водяной бане в течение 10 мин при 100°C. После электрофореза в 0.025 М Трис-глицин электродном буфере гели фиксировали в 70%-ном растворе изопропанола и окрашивали Coomassie G-250. Для оценки молекулярного веса использовали миозин (210 кДа), актинин (100 кДа) и бычий сывороточный альбумин (66 кДа). Все реагенты были фирмы Sigma-Aldrich. Количественная оценка белковых полос выполнена на сканере Umax Astra 3450 с использованием вычислительной программы Band Leader 3.00.

Данные представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего (M ± SEM). Корреляционный анализ выполнен с использованием пакета программ STATISTICA 10. Уровень достоверности различий между линиями крыс и между функциональными состояниями почек оценивали по t-критерию Стьюдента для независимых переменных с учетом поправки Бонферрони. Нормальность распределения проверяли критерием Shapiro–Wilk, проверку на равенство дисперсий не проводили, так как использованы равные по размеру выборки. Различия считали значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Осмолярность экскретируемой мочи является интегральным количественным параметром, адекватно характеризующим комплексную работу почек в процессе поддержания водного гомеостаза. Данные по осмолярности мочи, полученные во всех экспериментальных группах, представлены в табл. 1. У крыс линии WAG уже в исходном состоянии наблюдалось выделение умеренно концентрированной мочи. Уровень концентрирования снижался примерно вдвое при дальнейшем содержании на диете с повышенным поступлением раствора сахарозы в организм и, наоборот, повышался более чем в два раза в ответ на продолжительное отсутствие питьевой воды. Менее выраженные изменения осмолярности зафиксированы у крыс Brattleboro. Изоосмотическая в начале эксперимента моча при избыточном потреблении раствора сахарозы без твердой пищи имела тенденцию к дальнейшему разбавлению. У животных, не имевших доступа к питьевой воде, образовывалась и отделялась гипертоническая моча, но значительно меньшей осмолярности, чем у крыс WAG. Различия в диапазоне изменения осмолярности экскретируемой мочи (n = 10, р < 0.001), наблюдаемые в условиях действия противоположных нагрузок на концентрирующую систему, свидетельствуют о неодинаковом функциональном состоянии почек в исследованных линиях крыс.

Кора и мозговое вещество почки различаются по структуре и клеточному составу канальцевых отделов, но общим свойством всех типов почечного эпителия является наличие базальной мембраны. Ламинин относится к главным водорастворимым белкам базальной мембраны. Белок присутствует в высокой концентрации, достаточной для прямой детекции в окрашенных полиакриламидных гелях [12]. В денатурирующих условиях гетеротример ламинин представлен тремя полосами в области 160, 127 и 100 килодальтон [6, 7, 13]. Анализ фракционированных пептидных мономеров ламинина не выявил существенных межлинейных различий по уровню альфа- и гамма-цепей в исследованных экспериментальных группах (n = 10, p > 0.05). По этим пептидам также не обнаружено различий между животными, находившимися на распаивании 4%-ным водным раствором сахарозы, либо на альтернативном кормлении сухим кормом (n = 10, p > 0.05). Более информативные данные были получены при рассмотрении бета-цепей ламинина. Количественная оценка содержания бета-ламинина, сделанная в относительных единицах, представлена на рис. 1.

Рис. 1.

Содержание бета-ламинина в условных единицах в пересчете на глобулярный актин в корковом и мозговом веществе. Достоверность различий: между крысами WAG и Brattleboro: * – р < 0.01; между гипергидратированными и дегидратированными крысами: # – р < 0.01.

У крыс WAG выявлена изменчивость содержания пептида в мозговом слое почки. Зафиксирован достоверно более высокий уровень бета-ламинина в условиях дегидратации по сравнению с гипергидратированными животными той же линии (n = 10, р < 0.01). У крыс Brattleboro аналогичная реакция на дегидратацию отсутствовала (n = 10, p > 0.05). Также не выявлено каких-либо достоверно значимых межлинейных различий бета-ламинина в корковом веществе почки в группах с повышенным потреблением воды.

В табл. 2 представлены коэффициенты корреляции между осмолярностью экскретируемой мочи и содержанием бета-ламинина в почечных слоях. Очевидно, что высокая корреляция, свидетельствующая о достоверной взаимосвязи параметров, отмечена только у крыс линии WAG в мозговом веществе почки.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В процессе мочеобразования можно выделить несколько разнонаправленных фаз. Первичная изотоничная моча образуется в результате ультрафильтрации в почечных клубочках, локализованных в коре. При прохождении в корковых проксимальных канальцах происходит интенсивная обратная реабсорбция воды. Дальнейшее продвижение по нефрону сопровождается реабсорбцией ионов и приводит к разбавлению внутриканальцевой жидкости вплоть до гипоосмотичного уровня в водонепроницаемых отделах петли Генле. Конечная моча представляет результат факультативной реабсорбции воды в собирательных трубках мозгового вещества и полностью зависит от гормональной регуляции вазопрессином [14]. Почечный эпителий на всем протяжении почечных канальцев представляет одинарный слой, все клетки которого непосредственно контактируют с базальной мембраной. Вследствие тесного взаимодействия, изменения в структуре базальной мембраны могут иметь прямое отношение к характеру процессов, происходящих в эпителиальных клетках. Показано, что базальная мембрана обладает трофической функцией, избирательно пропуская питательные вещества к клеткам. Белки базальной мембраны участвуют в восстановлении почечной функции после различных нарушений, связанных с повреждением структуры эпителия. Взаимодействие коллагена, ламинина и интегринов инициирует внутриклеточные механизмы репарации [15]. Связывание ламинина изменяет конформацию цитоплазматического сегмента интегрина и активирует киназу фокальной адгезии FAK. Внутриклеточная трансдукция распространяется на rho GTP и МАРК-сигнальные пути [16]. Отдельные цепи ламинина по-разному участвуют в сигнальной трансдукции. Альфа- и гамма-пептиды ламинина 332 задействованы в регуляции адгезии и миграции клеток [13, 17]. Бета-пептид оказывает более выраженные тканеспецифичные эффекты. Повышенная концентрация локализуется в базальной мембране мышечной и почечной ткани. Трансгенная инактивация бета-ламинина приводит к нарушению функции почки [4]. Результаты нашего эксперимента подтверждают узкую направленность эффектов бета-ламинина, связанную с концентрирующей функцией почек. Одним из возможных механизмов действия бета-ламинина может быть изменение структуры белков цитоскелета эпителиальных клеток [18].

Выявленные межлинейные различия свидетельствуют о том, что повышенное содержание бета-пептида ламинина в почке реализуется только при наличии нормально экспрессирующегося гена вазопрессина. У мутантных крыс Brattleboro, неспособных синтезировать и секретировать гормон, стимулирующий эффект дегидратации не проявляется. Физиологическое действие вазопрессина заключается в быстрой гормональной регуляции концентрирующей функции и адекватной коррекции метаболизма воды. В условиях дегидратации концентрация вазопрессина, циркулирующего в крови, стабильно возрастает в несколько раз [19–21]. Помимо антидиуретической реакции, реализуемой через V2-рецепторы собирательных трубок мозгового вещества, при продолжительном воздействии вазопрессина включаются дополнительные регуляторные механизмы, связанные с другими типами рецепторов. Вазопрессин активирует V1А-рецепторы в тромбоцитах, печени, гладкомышечной ткани [22, 23] и V2-рецепторы в эндотелии кровеносных сосудов [24]. Минорные эффекты вазопрессина направлены на стимуляцию синтеза и секреции ряда белковых факторов роста и адгезии, имеющих прямое отношение к пролиферации клеток. Известно, что введение препаратов вазопрессина купирует симптомы острой почечной недостаточности, развивающейся при септическом шоке [25]. Можно предположить, что именно пролонгированная повышенная секреция вазопрессина, вызванная дегидратацией, является причиной повышения уровня бета-ламинина в мозговом веществе почки.

Таким образом, состояние дегидратации приводит к активации синтеза бета-ламинина в почке. Данный эффект наблюдается только в случае нормальной экспрессии гена вазопрессина.