Успехи современной биологии, 2021, T. 141, № 2, стр. 128-132

ВВЕДЕНИЕ

Поиск средств и методов терапии миастении (myasthenia gravis – далее MG) определяет необходимость совершенствования ее экспериментальных моделей. MG относят к аутоиммунным заболеваниям с образованием афинных к α-цепи Н-холинорецептора (Н-ХР) антител (Behin, Le Panse, 2018). Повреждение ХР может протекать через усиление скорости их деградации и облегчение фагоцитоза макрофагами, через активацию системы комплемента и через блокаду связывания с ацетилхолином (Mantegazza et al., 2016).

Проявления MG у животных сопряжены с мышечной слабостью, обратимой после применения ингибиторов ацетилхолинэстеразы, декрементом М-ответа и нарушением функций аксонов периферических нервов. Для животных с MG характерна поза с опущенной вниз головой, подгибающимися передними конечностями и сильно выгнутой спиной, наблюдают рывки головой и передними конечностями, прослеживают недержание мочи и отсутствие глотательных движений (Gilhus et al., 2016). Тяжелые формы MG сопровождают заболевания дыхательных путей, часто с гиперсекрецией и слезоточивостью. Шумное дыхание, обусловленное параличом гортани, пропадает после восстановления мышечной силы (Racca et al., 2020).

Экспериментальную MG на животных моделируют аутоантителами и лимфокинами, выделенными из крови и тимуса больных миастенией; сенсибилизацией ХР, выделенными из электрического органа Torpedo californiсa в полном адъюванте Фрейнда; введением пеницилламина (Fuchs et al., 2014). При введении крысам антител к ХР в больших дозах выделяют два периода мышечной слабости, сопровождающихся потерей массы тела. Первый острый период протекает с 7 по 12 сут, а восстановление мышечной силы обычно наступает уже на 15 сут. Второй период с прогрессирующей мышечной слабостью возникает между 26 и 35 сут, причем ему предшествует появление заболеваний дыхательных путей (Baggi et al., 2012).

Существуют также неиммунные модели миастенических синдромов, которые связаны с мутациями генов, кодирующих различные эпитопы субъединиц ХР, а также модельные состояния, связанные с десенсибилизацией Н-ХР при промежуточном синдроме и при отдаленных демиелинизирующих нейропатиях после отравления фосфорорганическими соединениями (Тюнин и др., 2017). MG у животных моделируют также нокаутом генов белков, ответственных за формирование иммунного ответа (Cao et al., 2017).

Н-ХР выявлены и в иммунокомпетентных клетках, что также необходимо учитывать в патогенезе MG. TCR/CD3-зависимый путь индуцирует экспрессию α4- и α7-субъединиц Н‑ХР в CD4-позитивных Т-лимфоцитах мышей (Qian et al., 2011). В T-клеточной линии CCRF-CEM лейкемии человека никотин ингибировал экспрессию мРНК всего спектра субъединиц Н-ХР и в присутствии внеклеточного Ca²⁺ запускал краткосрочное увеличение проницаемости мембраны для ионов Ca²⁺. Этот эффект отменяли агонисты α7-субъединицы Н-ХР (к примеру, α-бунгаротоксин), что подтверждает роль Н-ХР в Са²⁺-сигналинге Т‑клеток (Wang et al., 2004).

В макрофагах, α7-субъединицы Н-ХР играют роль негативных регуляторов синтеза и секреции TNF-α (Wang et al., 2003). Предполагают, что функция иммунных клеток частично регулируется холинергической системой посредством паракринных влияний по типу дистантного синапса через α7-субъединицу Н-ХР (Fujii et al., 2007). α7-Субъединица Н-ХР вовлечена в регуляцию продукции провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, модулируют продукцию антител. 

Цель исследования состояла в испытании химерной конструкции типа экстраклеточного домена α₁-субъединицы Н-ХР быка Bovis taurus, слитого с N-конца с субъединицей A₁ энтеротоксина Vibrio cholerae О1 для моделирования MG.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на беспородных белых крысах-самцах массой 180–220 г, полученных из питомника РАН “Рапполово”. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде в соответствии с правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и работе с животными, утвержденными ГОСТ Р 53434-2009.

Синтезировали рекомбинантную плазмидную ДНК (РПД ХР), кодирующую химерный ХР выбранной структуры (ООО “АТГ Сервис Ген”, г. Санкт-Петербург). Препарат представлял собой прозрачный раствор, который вводили в организм посредством метода гидропорации. Гидродинамическое воздействие представляло собой внутривенное (в/в) введение РПД в физиологическом растворе в течение 25–35 с из расчета 1 мг/кг в объеме, соответствующем 10% от массы тела. Экспериментальные животные получали РПД однократно и трехкратно (1 раз в день). Животным контрольной группы вводили РПД, кодирующую целевой белок, без последовательности, аналогичным способом. Всем животным подкожно вводили полный адъювант Фрейнда в дозе 0.2 мг/кг для стимуляции выработки антител.

Появление в крови IgG к ХР и IL-1α, отражающего воспалительную реакцию, оценивали количественно с применением соответствующих иммуноферментных тест-систем с помощью анализатора ChemWell Elisa 2910 (Awareness Technology, США). Формирование MG у животных подтверждали в ходе электронейромиографии (ЭНМГ) и тестов “Плавание с грузом” (10% до отказа) и “Сила хвата”, определяли клеточный состав крови (динамика лейкоцитов и их популяций, IL-1α и антитела к ХР). Мышечную утомляемость оценивали по времени плавания с отягощением (10% от массы тела) до отказа и в тесте, определяющем максимальную силу хватки лап (Grip Strength Meter, Columbus). Критерием мышечной утомляемости являлось статистически значимое снижение “длительности однократного плавания” и снижение силы хватки или невыполнение этого рефлекса.

Средние величины регистрируемых показателей рассчитывали общепринятыми статистическими методами с применением программы SigmaPlot 11.0. Полученные данные представлены в виде средних значений со стандартным отклонением (M ± SD). Для сравнения средних величин показателей и установления статистически значимых различий с группой сравнения проводили статистическую обработку по непараметрическому тесту Манна–Уитни. Для сравнения средних величин и установления достоверности различий с фоном использовали непараметрический критерий для парных сравнений Уилкоксона. Для оценки значимости межгрупповых различий альтернативных показателей применяли χ²-критерий Пирсона и точный метод Фишера. Различия по сравнению с контролем считали статистически значимыми при р < 0.05 и менее.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

У крыс, которым в/в однократно и трехкратно вводили РПД ХР гидродинамическим способом, при проведении ЭНМГ выявлены неврологические нарушения, характеристики которых приведены в табл. 1.

Изменения количества лейкоцитов в крови исследованных групп зависели от кратности применения РПД ХР и не были вызваны использованием метода гидродинамического введения (табл. 2). При однократном в/в введении РПД ХР этот показатель статистически значимо увеличивался только к окончанию периода наблюдения, тогда как при трехкратном введении образца количество лейкоцитов увеличивалось, начиная со 2-й нед. эксперимента, а к окончанию эксперимента наблюдали выраженную лейкопению. Из числа субпопуляций лейкоцитов через 2 нед. после однократного введения РПД ХР статистически значимо возрастало количество лимфоцитов и моноцитов, тогда как количество гранулоцитов снижалось с тенденцией к восстановлению к концу 4-й нед. При трехкратном введении РПД ХР прирост моноцитов отмечали до окончания периода наблюдения. В этот срок фиксировали резкое снижение при восстановлении популяции гранулоцитов к 3-й нед. наблюдения.

В пользу протекания воспалительного процесса у животных, получавших РПД ХР, указывали данные биохимических маркеров (табл. 3). При однократном гидродинамическом введении РПД ХР повышение количества антител к ХР прослеживали на 1–2 нед. эксперимента, и к его окончанию показатель соответствовал контрольным значениям. При трехкратном введении образца нарастание количества антител выявляли как на первой неделе эксперимента, так и через 3–4 нед. после его начала, что предполагало развитие аутоиммунного воспалительного процесса. Уровень IL-1α резко увеличивался через 1 нед. после введения РПД ХР, а в последующем отмечалась плавная динамика его снижения. Полученные данные позволяли сделать предположение о формировании аутоиммунного воспаления, при этом модель трехкратного введения РПД ХР обеспечивает более длительный и выраженный ответ.

Биологическое действие РПД ХР прослежено в тесте 10%-ным грузом до отказа и силы хвата. По результатам фонового заплыва средняя продолжительность плавания животных во всех группах составляла 143–154 с. После однократного в/в гидродинамического введения РПД (контроль) на 7-е сут фиксировали снижение продолжительности плавания на 11.7% относительно фоновых значений. В последующие сроки тестирования продолжительность плавания животных данной группы повышалась, и к 3-й нед. составила 195 ± 12.5 с. После однократного в/в гидродинамического введения РПД ХР к 3-й нед. продолжительность плавания была на 10% ниже значений контрольной группы. Установлено, что трехкратное гидродинамическое в/в введение РПД ХР способствовало снижению длительности плавания крыс на 24% к 3-й нед. эксперимента по сравнению с однократным введением РПД ХР.

На фоне однократного в/в гидродинамического введения РПД ХР показано снижение силы хвата лап крыс на 2-й нед. на 0.4 ± 0.83 Н по сравнению с фоновыми значениями и к 3-й нед. сила хвата была сопоставима с исходными значениями. Установлено, что трехкратное в/в гидродинамическое введение РПД ХР оказывало влияние на мышечный тонус крыс по сравнению с его однократным введением (рис. 1).

Рис. 1.

Мышечная утомляемость у крыс после трехкратного внутривенного гидродинамического введения РПД ХР в тестах “Плавание до отказа” и “Сила хвата”, (M ± SD, n = 8).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Посредством индукции экспрессии химерного холинорецептора разработана сохраняющая патогенетическое единство c экспериментальной моделью MG, предполагающая трехкратное внутривенное введение РПД ХР с применением гидродинамического введения. Предложенная схема введения образца обеспечивает выраженный аутоиммунный ответ, сохранение длительности воспалительной реакции на протяжении 4-х недель и снижение физической работоспособности и показателей электронейромиографии животных. Разработанная модель потенциально может быть использована при отборе лекарственных средств для терапии аутоиммунных заболеваний холинергической природы.