Успехи современной биологии, 2021, T. 141, № 3, стр. 265-270

Одно из наиболее приоритетных направлений в современной биологии и медицине – изучение механизмов регулирования многоклеточных систем и сложного равновесного состояния между двумя основными физиологическими процессами – пролиферацией и апоптозом. В Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии разработана технология выделения ряда полипептидных комплексов из различных органов и тканей телят. Эти полипептиды оказывают тканеспецифическое действие, стимулируя клеточную пролиферацию в органотипической культуре соответствующей ткани (Чалисова и др., 2004; Закуцкий и др., 2006; Милютина и др., 2007; Рыжак и др., 2015).

Полипептидный препарат кортексин широко применяется в лечении нарушений функций головного мозга у людей разного возраста (Хавинсон и др., 2012). В основе молекулярного механизма действия кортексина лежит его способность активировать экспрессию генов, отвечающих за синтез нейротрофических факторов – мозговой нейротрофический фактор BDNF (brain-derived neurotrophic factor) и фактор роста нервов NGF (nerve growth factor) (Хавинсон, Кветной, 2000; Рыжак и др., 2001; Умнов и др., 2014). На основе анализа аминокислотного состава полипептидного комплекса кортексина, выделенного из коры головного мозга, методом УЭЖХ-МС (ультраэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия) был выявлен и синтезирован трипептид EDR (Glu-Asp-Arg) (Хавинсон и др., 2012; Рыжак и др., 2015; Чернова и др., 2017; Kraskovskaya et al., 2017).

При анализе аминокислотного состава полипептидного комплекса эпифиза было установлено, что с наибольшей частотой в нем встречаются глутаминовая кислота (Glu), аспарагиновая кислота (Asp), аланин (Ala) и глицин (Gly). Из этих аминокислот был сконструирован и синтезирован тетрапептид AEDG (Ala-Glu-Asp-Gly), который впоследствии был выявлен в полипептидном комплексе эпифиза (Khavinson et al., 2017a). Установлено, что пептид AEDG обладает теми же биологическими эффектами, что и полипептидный комплекс эпифиза, но в меньших концентрациях (Хавинсон и др., 2012; Журкович и др., 2020). Эти пептиды оказывали стимулирующее влияние на пролиферацию в органотипической культуре тканей головного мозга крыс (Рыжак и др., 2001; Закуцкий и др., 2006; Милютина и др., 2007; Хавинсон и др., 2015а).

Пероральное применение пептида EDR было эффективным для коррекции психоэмоционального состояния у мужчин пожилого возраста, что проявлялось в улучшении нейрофизиологических функций ЦНС и памяти (Балашова и др., 2008).

Выявлена эффективность перорального применения пептида EDR в сочетании с другими короткими пептидами у спортсменов. В проведенном исследовании по изучению влияния пептида EDR в комплексе с короткими пептидами на резервные возможности борцов, гребцов и спортсменок, занимающихся художественной гимнастикой, было установлено, что на фоне применения пептидных биорегуляторов, в том числе EDR, происходит оптимизация функций иммунной системы, показателей сердечно-сосудистой и антиоксидантной систем, увеличение длины теломер (Ивко, Трофимова, 2008). Кроме того, важным результатом применения EDR является повышение экспрессии стресс-протекторного гена белка теплового шока HSPA1A (Хавинсон и др., 2010).

Установлено, что короткие пептиды играют такую же важную роль в передаче биологической информации, как, например, аутокринные гормоны и нейропептиды. Применение достижений фундаментальной науки в медицине привело к пониманию того, что прогресс клинической медицины во многом зависит от медицины молекулярной, то есть от исследований, проводимых на уровне генов и биологически активных молекул (Хавинсон и др., 2004, 2014; Козина и др., 2008; Федореева и др., 2011, 2013). Один высокомолекулярный белок может быть гидролизован различными путями, что приводит к возникновению нескольких коротких пептидов. Этот механизм может производить пептиды с биологическими свойствами, отличными от исходной макромолекулы (Хавинсон, Анисимов, 2003). Короткие пептиды – сигнальные молекулы, способные взаимодействовать с ДНК и гистонами, эпигенетически регулировать экспрессию генов и синтез белков, обеспечивая поддержание гомеостаза клеток, тканей и органов (Петрова, 2011; Fedoreeva et al., 2011; Russo et al., 2012; Khavinson et al., 2016). Установлено, что в диссоциированных культурах клеток коры головного мозга короткий пептид EDR снижал уровень апоптоза, оцениваемого по экспрессии белка р53 (Умнов и др., 2014). Короткие пептиды также стимулируют экспрессию серотонина в клетках коры головного мозга (Хавинсон и др., 2014).

Обнаружено нарушение морфологии дендритов, включая изменение количества шипиков, при развитии нейродегенеративных и психических заболеваний. Эти нарушения наблюдаются в головном мозге людей при болезни Альцгеймера (БА) и болезни Хантингтона (БХ) и при моделировании БА и БХ на животных (Ostrovskaya et al., 2007; Zhang et al., 2008; Popugaeva, Bezprozvanny, 2013). Изучено влияние пептида EDR на формирование шипиков в нейронах стриатума в смешанной кортико-стриатной культуре, полученной от мышей линии YAC128 (модель БХ), и в нейронах гиппокампа в культуре, полученной от мышей линии C57BL/6 и линии PS1-M146V-KI (модель БА) (Khavinson et al., 2016; Vanyushin, Khavinson, 2016; Kraskovskaya et al., 2017). Установлено, что пептид EDR оказывал нейропротекторное действие в моделях БХ и БА. При исследовании влияния пептида EDR на количество шипиков в нейронах кортико-стриатной культуры мышей линии YAC128 было установлено, что пептид в концентрации 200 нг/мл достоверно увеличивал количество шипиков на 35%, по сравнению с этим же показателем у мышей с геном мутантного хантингтина человека на 21-е сутки культивирования без добавления пептида.

Механизм действия коротких пептидов показывает возможность взаимодействия пептида EDR с ДНК в растворе (Федореева и др., 2011). При этом пептид EDR оказывает дестабилизирующий эффект на вторичную структуру макромолекулы ДНК и компактизующее влияние на объем ее молекулярного клубка. Таким образом, в случае контакта пептида EDR с молекулой ДНК в клетке возможно его влияние на функциональные и структурные свойства этой важнейшей биологической макромолекулы. Установлено, что сайт-специфическое взаимодействие пептидов с ДНК приводит к изменению характера экспрессии генов (Федореева и др., 2011; Умнов и др., 2014). Методом молекулярного моделирования были подобраны два предполагаемых сайта связывания для пептида EDR: d(CCTGCC)2 и d(CCAGC)2. С обоими сайтами пептид образует стабильные комплексы (Хавинсон и др., 2012; Khavinson et al., 2013). Дальнейшие исследования показали, что короткие пептиды могут не только сайт-специфично связываться с ДНК, но и распознавать их по статусу метилирования (Guryanov et al., 2006; Vanyushin, Khavinson, 2016). Такое специфическое связывание пептидов с ДНК, вероятно, может конкурировать со связыванием ДНК с разными ферментами, например с ДНК-метилтрансферазой. Один из наиболее вероятных механизмов активации генов пептидами – селективное связывание пептидов с промоторными сайтами генов. Таким образом, специфические пептид–ДНК взаимодействия могут эпигенетически контролировать генетические функции клетки.

Однако, чтобы ускорить процесс тестирования препаратов для лечения заболеваний нервной системы человека, в том числе нейродегенеративных заболеваний, целесообразно использовать простые модельные организмы с кратким жизненным циклом, не подпадающие под законодательные ограничения по защите позвоночных животных (Bonini, Fortini, 2003; Doronkin, Reiter, 2008; Pfleger, Reiter, 2008). В частности, насекомые могут использоваться в качестве модельного объекта изучения влияния пептидов на условно-рефлекторную деятельность вследствие того, что имеется биохимическая и физиологическая общность механизмов формирования памятного следа в нервной системе у позвоночных и беспозвоночных организмов.

Модельным объектом может служить медоносная пчела Apis mellifera L. Эти насекомые способны осуществлять высшие формы нервной деятельности: ассоциативное обучение, долговременное хранение в памяти приобретаемого в процессе пищедобывательной деятельности индивидуального опыта. При этом они используют те же рецепторные, сигнальные, трансдукционные механизмы, которые выявляются и у млекопитающих (Лопатина и др., 1997; Bitterman et al., 1983; Menzel, 2014; Asok et al., 2019). У пчелы в головном отделе располагаются парные грибовидные тела, представляющие у этих насекомых высшие отделы ЦНС, которые обеспечивают обонятельное обучение и память при пищевом подкреплении. В экспериментах на пчелах (Хавинсон и др., 2015б) исследовано образование пищевого условного рефлекса вытягивания хоботка на обонятельный раздражитель (методика PER – proboscis extension response conditioning). Был выработан условный рефлекс вытягивания хоботка при однократном сочетании запаха гвоздики с пищевым подкреплением 50%-ным раствором сахарозы. По окончании процедуры обучения исследованы: через 1 мин – кратковременная память и через 180 мин – долговременная память. За 30 мин до обучения пчелам экспериментальной группы дорзально в торакс вводили 2 мкл раствора EDR в ряду концентраций 10^–11–10^–4 М, а пчелам контрольной группы – 2 мкл физиологического раствора. Введение EDR в эффективной концентрации 10^–7 М при исходном низком условно-рефлекторном уровне оказывало стимулирующее воздействие на сохранение в памяти выработанного условного рефлекса. Количество пчел, сохраняющих в кратковременной памяти условную реакцию, увеличивалось на 36% по сравнению с контрольной группой. На сохранение в долговременной памяти выработанного рефлекса у пчел с исходно низким условно-рефлекторным уровнем EDR не оказывал влияния. Однако при исходном высоком условно-рефлекторном уровне количество пчел, сохраняющих как в кратковременной, так и в долговременной памяти условно-рефлекторную реакцию, снижалось на 17–35%.

EDR, обладая выраженной модулирующей способностью, зависящей от исходного условно-рефлекторного фона, оказывается способным поддерживать функциональный баланс в нервной ткани высших отделов ЦНС пчел. Данные о влиянии EDR на когнитивную функцию у насекомых аналогичны данным о стимулирующем влиянии EDR на культуру ткани головного мозга млекопитающих (Рыжак и др., 2015). Таким образом, выявлен параллелизм действия EDR у двух групп организмов – влияние на пролиферативную активность клеток в культуре нервной ткани головного мозга крыс и на когнитивную деятельность медоносной пчелы.

Изучено также влияние тетрапетида AEDG на функциональные характеристики нервной ткани медоносной пчелы Apis mellifera L. (Чалисова и др., 2020). У пчел вырабатывался условный рефлекс на обонятельный раздражитель по стандартной методике. Воздействие AEDG в концентрации 10^–5 М увеличивало сохранение условного рефлекса в кратковременной памяти на 20% и в долговременной памяти – на 27%, по сравнению с контролем (рис. 1).

Рис. 1.

Влияние инъекций пептида AEDG (10^–5 М) на сохранение в кратковременной (КП) и долговременной (ДП) памяти выработанного пищевого обонятельного условного рефлекса у пчел. * – р < 0.01, по сравнению с контролем.

Полученные данные свидетельствуют о том, что тетрапетид AEDG влияет стимулирующим образом как на клеточную пролиферацию в подкорковых структурах головного мозга млекопитающих, так и на функцию высших отделов ЦНС, ответственных за когнитивную деятельность.

Нейропротекторное действие EDR было также исследовано у другого вида насекомых – мух Drosophila melanogaster. После завершения программы “геном человека” было выяснено, что 75% генов человека и дрозофилы обладают высокой степенью гомологии.

Для создания экспериментальной модели нейродегенеративных заболеваний важно наличие следующих диагностических признаков: 1) дефекты памяти и обучения, проявляющиеся в виде прогрессивной потери памяти; 2) локомоторные дефекты, которые выражены при болезни Паркинсона (БП) и БХ; 3) амилоидоподобные включения в нейронах, локализованные в цитоплазме при БА и БП и в ядре – при БХ. При экспериментах на дрозофилах имеется возможность уже на 5 сутки провести анализ локомоторных нарушений.

В качестве модели БП использовались дрозофилы с деменцией и тельцами Леви – мутант Agnst3 локуса agnostic, несущего дефектный ген для LIM-киназы 1 (LIMK-1) – ключевого фермента ремоделирования актина. Для регистрации локомоторного поведения личинок дрозофил использовали автоматизированную установку, позволяющую одновременно регистрировать показатели у 20 мух. Для исследования активности движения осуществляли запись видеосигнала с камеры. В пищевую изюмно-дрожжевую среду экспериментальной группы мух добавляли EDR в наномолярных концентрациях. При действии EDR в 2 раза возрастала общая локомоторная активность личинок мух. При этом способность личинок ориентироваться в пространстве также повышалась в 1.9 раза. Таким образом, EDR модулирует локомоторную активность у дрозофилы Agnst3 с выраженными симптомами БП. По результатам RealTime PCR-анализа выявлено, что у Agnst3 изначально повышенные уровни экспрессии limk1 и rok под действием EDR снижаются, причем уровень limk1 почти возвращается к показателю нормы дикого типа. Полученные данные позволяют предположить, что пептид EDR оказывает свое влияние на локомоторное поведение и память через уменьшение уровня экспрессии limk1, а также восстанавливает краткосрочную память у мутанта Agnst3 (Savvateeva-Popova et al., 2017; Khavinson et al., 2017b).

Необходимо отметить, что в последние десятилетия появился ряд работ о чувствительности человека и животных к ультрамалым концентрациям биологически активных веществ. Эффективность сверхмалых доз биологически активных веществ продемонстрирована в опытах на всевозможных биологических моделях (Бурлакова, 1999; Чалисова и др., 2002). Эти эффекты проявляются при концентрациях в диапазоне от 10^–11 до 10^–17 моль/л, то есть они на 4–6 порядков ниже минимальных наблюдаемых констант диссоциации лиганд-рецепторных комплексов, лежащих в диапазоне 10^–11–10^–10 М (Чалисова и др., 2004). Все эти данные свидетельствуют о том, что для развития эффекта важно не абсолютное количество действующего биологически активного вещества, а необходим сдвиг концентрации, способствующий развитию эффекта. При усложнении степени организации ткани требуются все меньшие концентрации биологически активных веществ. Поскольку активирующее память действие пептидов EDR и AEDG у пчел выявлено в диапазоне 10^–10–10^–7 М, а в коре головного мозга крыс – в диапазоне меньших концентраций 10^–12–10^–11 М, можно также полагать, что по мере усложнения строения и функций нервной ткани, она становится все более чувствительна к малым концентрациям эффективно действующих EDR и AEDG. Таким образом, выявлено, что короткие пептиды эффективны в наномолярных дозах при действии на нервную ткань как млекопитающих, так и насекомых. Создается база для разработки на их основе лекарственных ноотропных препаратов, причем с отсутствием побочных эффектов за счет эффективного действия ультрамалых концентраций.

Выявление стимулирующего влияния пептидов EDR и AEDG на функцию высших отделов ЦНС пчел создает базу тестирования препаратов для лечения патологических процессов в ЦНС. Проведенные исследования влияния пептидов на кратковременную и долговременную память у пчел и мух подчеркивают модулирующие свойства этих коротких пептидов. Так как EDR повышает локомоторную активность у дрозофилы Agnst3 с выраженными симптомами болезни Паркинсона, это позволяет тестировать препараты для лечения данной патологии, используя модель на мухах.

Параллелизм действия пептидов у двух видов организмов, а также данные об эпигенетических возможностях действия пептидов в ультрамалых концентрациях свидетельствуют о том, что существует единый механизм пептидергической регуляции экспрессии генов и синтеза белков в живой природе (Хавинсон, 2020). Сходство действия пептида EDR на нервную систему млекопитающих и насекомых позволяет предположить существование общего, возможно, древнейшего в эволюции механизма пептидной регуляции жизнедеятельности организмов.