Успехи современной биологии, 2021, T. 141, № 4, стр. 382-389

Импрегнация фиксированных препаратов

Объект исследования: каудальный брыжеечный узел взрослых животных (38 собак).

При исследовании применена методика импрегнации 2%-ным раствором азотнокислого серебра по Рассказовой. Для гистологических исследований узлы брали у животных, находящихся под эфирным наркозом, чтобы предотвратить аутолиз и уменьшить время нарушения кровоснабжения ганглия. Материал, предназначенный для импрегнации, фиксировали в 12%-ном растворе нейтрального формалина. Срезы изготавливали толщиной 20–30 мкм на замораживающем микротоме. Часть срезов дополнительно обрабатывали 0.2%-ным раствором золотохлористоводородной кислоты. Названными методами выявляли гистологическую структуру ганглия: нервные клетки, их отростки, нервные волокна и межнейрональные связи.

Структурная динамика живых нейронов

Для культивирования клеток взрослых моллюсков (80 животных) использовали специальные микрокамеры. Среду для культивирования готовили на основе маточной однократной среды RPMI-1640 путем разведения ее стерильным физиологическим раствором (ммоль): 75 NaCl, 5 KCl, 2.5 CaCl₂, 2.5 MgCl_2. Для стерилизации среду фильтровали, пропуская ее через миллипоровые мембраны с диаметром пор 0.22 мкм с помощью Peristaltic Miniflon Pump 304 (Польша). При фильтрации среды она достигала оптимального для культивирования значения pH – 7.8. Трансмиссионная микроскопия осуществлялась с помощью инвертированного фазово–контрастного видеомикроскопа МБИ-13 (ЛОМО). Использована видеокамера DCM310 (USB2.0).

Статическая морфология парных нейронов, соединенных комиссурами

Современная классическая нейроморфология, вслед за блестящими работами Рамон-и-Кахаля, основанными на импрегнационных методиках серебрения, исследовала многие детали строения ЦНС и ПНС (рис. 2). Эта методика открыла сущность обширной интеграционной взаимосвязи клеток нервной системы. Но ее естественным недостатком было то, что она допускала анализ только посмертных гистологических препаратов. Морфологическая функция, кинетика живых нейронов в значительной мере, поэтому, оставалась неизученной. Оказалось, что использование прижизненной фазово-контрастной микроскопии и видеосъемки открывает новые структурные и физиологические свойства препаратов. На рис. 2а, 2б, 2г четко видны толстые, одиночные, комиссурально связанные нейроны. Эти препараты никак не соответствуют предположению амитоза нейронов. Как отмечалось выше, это неподвижные фиксированные статические структуры. У них нет фигур митоза и деления клеток, реально нет движения, нет кинетики. Поэтому мы решили к прежним гистологическим препаратам присовокупить динамику поведения живых нейронов, выявленную с помощью видеосъемки, то есть, фактически, показать картину морфологической физиологии нейрона.

Рис. 2.

Комиссурально связанные нейроны фиксированного каудального брыжеечного узла нейронов собаки и живые связанные нейроны моллюска. а, г – утолщенные, одиночные комиссуры спаренных нейронов, как гипотеза незавершенного деления нейронов (амитоз); б – протоплазматические мостики спаренных нервных отростков; в – живые спаренные нейроны в культуре ткани; 1 – цитоплазматические мостики разного размера, связывающие нервные отростки; 2 – межклеточные утолщенные комиссуры; Н – тело нейрона; а, б, г – импрегнация азотнокислым серебром по Рассказовой; в – прижизненная фазово-контрастная видеомикроскопия. Oб. 40Ph, ок. 10.

Движение аксоплазмы – доказательство анастомоза

Прежде всего, оказалось, что аксоплазма – это не жидкость, а водный гель, который способен сокращаться в обе противоположные стороны одновременно (рис. 3). Следовательно, такие межклеточные отростки необходимо именовать не как комиссуры, а как интернейрональные цитоплазматические анастомозы, особые короткие, утолщенные, одиночные структуры, позволяющие току аксоплазмы смещаться вдоль нейритов и осуществлять электрофизиологическую и тинкториальную взаимосвязь клеток.

Рис. 3.

Перемещение массы аксоплазмы в двух противоположных направлениях (к соме и к концу волокна). Движение концов препарата – противоположное. a–г – стадии процесса; 1 – область адгезии волокна, образованная дополнительными клетками; 2 – медленная скорость сокращения аксоплазмы на периферическом конце препарата; 3 – варикозная деформация аксона; 4 – истончение массы аксоплазмы посередине препарата в результате движения аксоплазмы в оба конца от центральной точки адгезии. Прижизненная микроскопия. Фазовый контраст. Серийная фазовоконтрастная видеосъемка. Об. 40Ph, ок. 10.

Общебиологическое свойство адгезии и слияния живых нервных клеток

Важно продемонстрировать, что анастомозы образуются не путем амитоза, а в результате слияния волокон “конец-в-конец” (рис. 4а). Слияние “конец-в-бок” (рис. 4б) как бы блокирует видимую внешнюю регенерацию, но движение аксоплазмы продолжает перемещаться, причем в обе стороны от контакта слияния двух волокон. Как у всякой трубчатой структуры, у наших анастомозов существуют два отверстия, которые и являются дистантными синцитиальными межклеточными перфорациями.

Рис. 4.

Синцитиальное слияние нервных отростков с образованием кольцевидных анастомозов. а – слияние нервных отростков “конец-в-конец”; б – слияние нервных отростков “конец-в-бок”; 1 – отросток нейрона А; 2 – ламеллярный отросток нейрона Б; 3 – соединенные филоподии конусов роста клеток А и Б перед слиянием их ламеллярных отростков; 4 – формирующаяся единая цитоскелетная аксиальная структура, проникающая в ламеллоподии обеих клеток; 5 – поврежденный нейрон; 6 – синцитиальное образование сливающихся отростков; 7 – регенерирующие нейриты. Культура нейронов. Прижизненная видеомикроскопия. Фазовый контраст. Об. 20Ph, ок. 10.

Именно цитоплазматические слияния смежных волокон соединяют два нейрона, а анастомоз между ними, сокращаясь и впячиваясь в сомы клеток, превращается в дистантные синцитии (рис. 5).

Рис. 5.

Сближение и синцитиальное слияние нейронов в результате ретрактильной подвижности аксоплазмы их анастомозов. а – синцитиальный анастомоз сближает тела нейронов, регенерирующих отростки и общее передвижение дикариона; б – кинетика формирования дистантного синцития в результате ретракции аксоплазмы и слияния двух тел нейронов; в – слияние отростка с другим телом клетки, ретракция отростка и контакт тел двух нейронов перед слиянием; 1 – синцитиальный анастомоз двух нейронов; 2 – синцитиальная связь двух нейронов; 3 – дикарион; 4 – слияние тела в бок отростка. Культура ткани. Прижизненная видеомикроскопия. Фазовый контраст. Об. 20Ph, ок. 10.

Известно, что синцитий как самостоятельная структура существует у всех типов клеток. Но по предположению общебиологической НЕЙРОНАЛЬНОЙ ТЕОРИИ, нейроны не содержат синцитиев, что отличает их от ненервных клеток. Особенность представленного нами нервного синцития состоит в том, что он образуется у клеток с разветвленной арборизацией, поэтому мембранная адгезия чаще реализуется между нервными волокнами, а не между телами клеток. В этом уникальность описанной структуры и причина того, что она долгое время оставалась незамеченной в густых нервных сплетениях. Возможно поэтому, она не отмечена ни в монографиях нейронистов, включая Рамон-и-Кахаля, ни в трудах ретикуляристов – сторонников Камилло Гольджи.

Обоснование свойств дистантных синцитиев

Таким образом, малозаметная и безымянная, предполагаемая многими как элемент амитоза, волоконная комиссура предстает как неопознанная ранее органелла: толстый, одиночный, короткий, неветвистый сегмент нервного волокна, являющийся анастомозом, заполненным подвижной аксоплазмой, который сокращается, сближая тела нейронов вплоть до их контактов и слияния. Главным отличием этой структуры, видимо, является ее образование путем адгезии, ретракции и слияния смежных нервных отростков между собой или с телом клетки и формирование анастомоза двух дистантных мембранных фибросоматических синцитиев, связывающих электрически и тинкториально оба тела нейрона. Особенностью этой структуры является то, что она подобна электрическому синапсу, обладает крайне низким электрическим сопротивлением, проводит нервный импульс от обоих синцитиальных концов и пропускает ток в двух противоположных направлениях.

Сравнение электрических синапсов и синцитиев

Еще в 1959 г. Фёршпан и Поттер (Furshpan, Potter, 1959) физиологически доказали возможность электрической взаимосвязи между нейронами, минуя медиаторные синапсы. С тех пор, исследование электрических синапсов приобрело большую популярность (Сотников, 2019; Сергеева и др., 2020; Nagy et al., 2019; Peng et al., 2019). Было установлено увеличение численности одиночных электрических синапсов при патологии (Belousov, 2012; Belousov, Fontes, 2013). Удалось продемонстрировать также механизм превращения электрических синапсов в одиночные синцитии (Сотников, 2019). Наконец, в этой статье мы впервые попытались продемонстрировать новый биологический феномен сдвоенных дистантных синцитиальных анастомозов.

Утверждая новую структуру и ее значение для нейрона, необходимо продемонстрировать полноценное, четкое, статическое, морфологическое описание, доказать на живых нейронах механизм возможного функционирования структуры. Мы впервые попытались продемонстрировать все эти свойства предполагаемой новой структуры – дистантного анастомоза. Отсутствие всех этих условий в прошлом возможно и не позволяло реализовать и осмыслить указанную структуру необычного синцития. Основным недостатком обоснования дистантных синцитиальных межнейронных анастомозов могло считаться отсутствие доказательств значительного числа этих структур, полученных одним исследователем однотипным методом.

Неожиданные доказательства дистантных синцитиев в книгах Рамон-и-Кахаля

Мы считали возможным найти доказательства синцитиев при анализе многочисленных прекрасных трудов самого великого Рамон-и-Кахаля, который требовал от ретикуляристов массовости доказательства наличия цитоплазматической связи нейронов (Ramon y Cajal, 1954). Для этого, мы проанализировали иллюстрации давно опубликованных и уже неоднократно цитированных монографий Кахаля. Чтобы уменьшить естественную маскировку запутанных нервных сплетений в мозге, был использован метод демаскирования, позволяющий снизить оптическую плотность тонких второстепенных нервных ветвей, оставляя четкими только истинные, утолщенные межклеточные связи (рис. 6). Анализ каждой из 10 иллюстраций книги выявил массу, ранее скрытых в нервных сплетениях мозга, дистантных синцитиальных анастомозов, соединяющих чаще два, но иногда до пяти и более нейронов. Авторы считают, что этим методом, с помощью препаратов Кахаля, выполнено требование об убедительном количестве дистантных синцитиев в нервной системе.

Рис. 6.

Синцитиальные межнейронные анастомозы нервных препаратов из книги “Гистология нервной системы человека и позвоночных” (Ramon y Cajal, 1911), и те же демаскированные препараты с уменьшенной интенсивностью неконтактирующих арборизаций. а, б – мозг кошки; в – обонятельные нейроны и кольцевые синцитиальные анастомозы затылочного отдела мозга мыши; г – промежуточный мозг крысы. Импрегнация на основе “черной реакции” Гольджи.