Успехи физиологических наук, 2023, T. 54, № 1, стр. 91-104

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время активно обсуждается роль церамидов в патогенезе ожирения, сахарного диабета 2 типа (СД2), атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Предполагается, что церамиды представляют собой новые перспективные маркеры для выявления пациентов с высоким риском неблагоприятных сердечно-сосудистых событий. Показано, что при ожирении, которое является одной из основных причин развития кардиометаболических заболеваний, происходит накопление церамидов в жировой ткани (ЖТ) и эктопическое отложение в печени, сердце и мышцах [47]. Однако до сих пор нет единого мнения, что способствует чрезмерному, патологическому депонированию церамидов в адипоцитах – избыток питательных веществ, липотоксические условия, усиленный биосинтез или поступление из циркуляции [13].

В настоящее время охарактеризованы 3 пути синтеза церамидов: de novo, сфингомиелиназный и рециркуляции/“спасения”. Относительная значимость процессов, посредством которых клетки получают церамиды in vivo, изучена недостаточно [47]. Считается, что биосинтез de novo является преимущественным источником церамидов в клетке [79]. Основными продуктами биосинтеза по пути de novo являются церамиды, которые относятся к структурным предшественникам большого класса сфинголипидов и представляют собой амиды сфингозина и жирных кислот с 16–28 атомами углерода (у млекопитающих) [9, 48].

Показано, что путь de novo необходим для выживания клеток in vivo, так как его ингибирование влияет на рост и жизнеспособность [49]. В то же время, воздействие на ферменты биосинтеза церамидов de novo рассматривается как потенциальный метод лечения ожирения, СД2 и ССЗ [9, 19, 26, 31, 63, 66, 80]. При этом внимание большинства исследователей сосредоточено в основном на изучении отдельных ферментов этого пути в экспериментальных исследованиях [20, 25, 26, 44, 51, 61, 67]. Однако для понимания возможности избирательно модифицировать активность ферментов в клинической практике и стратификации риска необходимо комплексное изучение ферментов биосинтеза церамидов de novo.

Настоящий обзор содержит систематизированную информацию о физиологической и патофизиологической роли ферментов биосинтеза церамидов de novo, их генной и структурной организации, регуляции экспрессии и активности ферментов, особенностях функционирования в ЖТ, а также об эффектах церамидов в зависимости от длины цепи.

ЦЕРАМИДЫ И ИХ ФУНКЦИИ

Церамиды выполняют структурную, метаболическую, регуляторную, иммунную функцию, участвуют в синтезе сфингомиелина (компонента клеточных мембран), дифференцировке, пролиферации и апоптозе клеток [12], отвечают за поддержание сосудистого тонуса за счет ослабления эффектов адреналина и эндотелий-независимого расслабления сосудов, опосредованного фактором некроза опухолей α (TNF-α) [15]. Однако сообщается, что церамиды (C8:0, C16:0) и фермент, их продуцирующий (нейтральная сфингомиелиназа – NSMase) индуцировали устойчивое дозозависимое сужение артерий головного мозга у собак [87]. Нарушение регуляции сосудистого тонуса способствует формированию патологических изменений, приводящих к развитию атеросклероза [16].

Предполагается, что церамиды действует как вторичные мессенджеры, которые регулируют выживаемость и метаболизм клеток. Основным молекулярным механизмом действия церамидов считается активация ферментных белков, таких как протеинкиназа С, церамид-активируемая протеинфосфатаза, митоген-активируемая протеинкиназа, c-Jun-N-концевая протеинкиназа, киназа-супрессор Ras, протеаза катепсина D и ингибирование фосфолипазы D [40].

Известно, что определяющим фактором для реализации физиологических свойств церамидов является длина либо сфингоидной, либо N-ацильной цепи. Так, церамиды C14:0 ответственны за аутофагию, способствующую обмену белков и удалению поврежденных органелл в макрофагах, дендритных клетках, CD4⁺-клетках, облегчают презентацию антигена и уничтожение патогенов. Помимо указанных функций, С14:0 церамиды регулируют пролиферацию клеток печени. Церамиды C16:0 отвечают за метаболизм жирных кислот в митохондриях и играют центральную роль в развитии ожирения, резистентности к инсулину, метаболических нарушений [3, 20, 40, 72, 79]. Церамиды C18:0 необходимы для нормального метаболизма глюкозы, синтеза миелина, развития нейронов и мозжечка. Церамиды C22:0–24:0 регулируют функцию печени, синтез миелина олигодендроцитами, важны для развития волосяных фолликулов; церамиды C25:0–26:0 имеют решающее значение для поддержания барьерной функции кожи [14].

Имеющиеся данные литературы свидетельствуют, что для реализации физиологического или патологического эффекта имеет значение соотношение различных церамидов в клетках. Предполагается, что баланс между церамидами с длинной цепью (C14:0–C20:0) и с очень длинной цепью (C22:0–C26:0) важен для индукции аутофагии [69], а равновесие между церамидами C18 и C24:0–C26:0 необходимо для нормальной пролиферации клеток [23, 25, 34, 69, 80].

Кроме того, действие церамидов зависит от микроокружения, регулируется их субклеточной/мембранной локализацией и наличием либо отсутствием прямых мишеней этих липидных молекул (например, ингибирование фосфолипазы Д, которое влечет за собой нарушение передачи сигнала инсулина) [1, 33]. Церамиды С14:0 при определенных условиях становятся цитотоксичными для гепатоцитов и рассматриваются в качестве потенциального биомаркера стеатоза печени [80]. C16-церамиды участвуют в апоптозе, ингибируют окисление жирных кислот, способствуя фрагментации митохондрий и пролиферации раковых клеток. Церамиды C18 могут вовлекаться в аутофагический клиренс митохондрий (митофагию), что приводит к снижению окислительной способности митохондрий в отношении жирных кислот [57, 70]. Анализ ранее проведенных исследований показывает, что длинноцепочечные церамиды (С14:0, C16:0, C18:0, С20:0) взаимосвязаны либо с неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями и повышенной смертностью от ИБС, либо с такими состояниями, как ожирение, СД2, рассеянный склероз, стеатоз печени, деменция, сердечная недостаточность, цереброваскулярные микрососудистые заболевания и инсульт. В то время как очень длинноцепочечные церамиды (С22:0–С26:0) отвечают за поддержание барьерной функции кожи [20, 44, 46, 57, 70, 72, 79, 80].

Краткая характеристика основных процессов, в которых показаны физиологические и патологические эффекты церамидов в зависимости от длины цепи, приведена в табл. 1.

СИНТЕЗ ЦЕРАМИДОВ В ЖИРОВОЙ ТКАНИ

Показано, что адипоцит-специфический дефицит биосинтеза сфинголипидов de novo приводит к липодистрофии и резистентности к инсулину [45]. Данные относительно синтеза церамидов в адипоцитах немногочисленны, несмотря на обширный спектр эффектов церамидов в ЖТ. Накопление церамидов в ЖТ строго регулируется путем уменьшения/увеличения размера адипоцитов, соизмеримого с накоплением/мобилизацией липидов [13, 47].

Экспериментальные исследования показали, что в адипоцитах церамиды образуются либо de novo из жирных кислот (основным субстратом является пальмитиновая кислота) на цитозольной поверхности мембран эндоплазматического ретикулума (ЭПР), либо путем гидролиза сфингомиелина сфингомиелиназой в лизосомах [33] (рис. 1).

Синтез церамидов de novo состоит из четырех последовательных реакций и является основным путем образования длинноцепочечных церамидов в адипоцитах. Учитывая, что при синтезе церамидов по этому пути образуются церамиды, обладающие неблагоприятными сердечно-сосудистыми эффектами, все ферменты метаболизма церамидов должны быть четко скоординированы [79].

ФЕРМЕНТЫ СИНТЕЗА ЦЕРАМИДОВ DE NOVO

1. Первым ферментом является серин-пальмитоилтрансфераза (SPT), который относится к пиридоксаль-5'-фосфат-зависимым трансферазам, в частности, к ацилтрансферазам. SPT эукариот представляет собой мембраносвязанный гетеродимер, состоящий из трех основных субъединиц (SPTLC1, 2 и 3), имеющих взаимную гомологию: SPTLC2 на 68% идентичен SPTLC3, тогда как SPTLC1 более отличен (примерно 21% идентичности) от SPTLC2 и SPTLC3. Молекулярная масса SPT составляет приблизительно 480 кДа [85].

Фермент был впервые идентифицирован у дрожжей Saccharomyces cerevisiae, но поскольку субъединицы связаны с мембраной, его изоляция и характеристика была затруднена до настоящего времени [11].

SPT катализирует первую реакцию биосинтеза церамидов de novo – конденсацию пальмитоил-кофермента A и серина с образованием 3-кетосфинганина [31]. Основной функцией SPT является перенос ацильной группы (R-C=O) на молекулу субстрата (серина) с образованием 3-кетосфинганина. SPT считается ключевым ферментом синтеза церамидов de novo, а реакция с его участием является скорость-лимитирующей, без которой невозможно дальнейшее образование церамидов по этому пути [85].

Гены субъединиц SPTLC1, SPTLC2 и SPTLC3 локализованы на различных хромасомах (на 9 хромосоме в локусе 9q22.31, на 14 хромосоме в 14q24.3 и на 20 хромосоме в локусе 20p12.1 соответственно), содержат разное количество экзонов (22, 13 и 14, соответственно). Гены SPTLC1 и SPTLC2 субъединиц экспрессируется повсеместно на достаточно высоком уровне, тогда как экспрессия SPTLC3 сильно варьирует между тканями, ее наибольший уровень отмечается в плаценте и щитовидной железе [39].

Регуляция экспрессии генов основных субъединиц SPT осуществляется индукторами стресса ЭПР, к которым относятся ряд физиологических (диета с высоким содержанием жиров – избыточное накопление липидов) и патологических состояний (ожирение, воспаление, инфекции), определенные внутриклеточные изменения (недостаток глюкозы, дисбаланс кальция или окислительно-восстановительного потенциала), условия микроокружения (гипогликемия, гипоксия и ацидоз), природные соединения (тапсигаргин, туникамицин и гельданамицин) а также фармакологические препараты (бортезомиб/велкейд, целекоксиб/целебрекс и нелфинавир/вирасепт) и УФ-излучение, которые повышают уровни мРНК SPTLC1, SPTLC2 и SPTLC3 [39, 85].

Экспериментально показано, что в условиях физиологического стресса ЭПР, вызванного диетой с высоким содержанием жиров (60% калорий), уже через 2 дня наблюдалась активация Sptlc1 и Sptlc2-субъединиц у мышей дикого типа, что приводило к увеличению продукции церамидов [39].

Известно об ингибирующем влиянии на экспрессию SPT d-серина в тканях головного мозга, где обнаружен этот стереоизомер. Предполагается, что в таких специфических типах клеток d-серин образуетсятся из l-серина и влияет на синтез церамидов, хотя необходимы дальнейшие исследования для выяснения физиологической значимости ингибирования SPT d-серином [28].

Кодируемые SPTLC1 и SPTLC2 белки представляет собой длинноцепочечные аминокислотные последовательности 1 и 2 субъединиц SPT. Считается, что у млекопитающих для функциональной активности фермента SPT необходимы две субъединицы (SPTLC1 и SPTLC2), образующие димер. SPTLC1 может связываться и с SPTLC3, позволяющей использовать миристоил-КоА вместо пальмитоил-КоА [88]. Показано, что экспрессия и функция SPTLC3 связаны с измененным плазменным профилем церамидов и повышенным риском кардио-метаболических заболеваний [39].

Предполагается, что SPTLC1 субъединица играет регуляторную роль в димере SPT, тогда как SPTLC2 необходима для каталитической активности фермента. Данная гипотеза высказана на основе результата анализа субъединиц SPTLC1 и SPTLC2 у Saccharomyces cerevisiae, показавшего, что SPTLC2 содержит остаток лизина в активном сайте, необходимый для связывания пиридоксаль-5'-фосфата, тогда как в SPTLC1 лизин отсутствует. Несмотря на очевидную некаталитическую роль SPTLC1 в гетеродимере млекопитающих, было показано, что мутации одной аминокислоты в высококонсервативной области этой субъединицы снижают активность фермента SPT [85].

На скорость протекания первой реакции синтеза церемидов de novo влияет наличие субстрата. В связи с чем избыток циркулирующих насыщенных жирных кислот, особенно пальмитата, значительно повышает образование церамидов и их накопление в клетках [73]. Поскольку SPT является высокоселективным ферментом в отношении ацил-КоА с 16 ± 1 атомом углерода, другие жирные кислоты могут оказывать ингибирующее действие in vivo, возможно, путем конкуренции за пул КoA. Выделенные из микроорганизмов сфингофунгины, липоксамицин, мириоцин и циклосерин также ингибируют SPT [50].

Кроме того, имеются данные о регуляции активности фермента SPT малыми мебранными оросомукоид-подобными белками-регуляторами биосинтеза сфинголипидов (ORMDL, orosomucoid-like) путем образования стабильных комплексов [17].

У человека семейство ORMDL состоит из 3 белков (ORMDL1, ORMDL2 и ORMDL3), одновременный нокдаун которых усиливает биосинтез церамидов de novo, в то время как их сверхэкспрессия снижает образование церамидов [16].

Ген оросомукоид-подобного белка был идентифицирован ранее у дрожжей и назван Orm, поэтому ген человека назвали ORMDL. Полноразмерная кДНК для ORMDL1 человека была обнаружена в сетчатке на хромосоме 2q31 [30]. Используя кДНК для ORMDL1, обнаружены гомологи – ORMDL2 (расположенный на хромосоме 12q13) и ORMDL3 (расположенный на хромосоме 17q21) [16].

Гены ORMDL кодируют белки, состоящие из 153 аминокислот с небольшими вариациями последовательности между изоформами. Белки ORMDL не имеют известных функциональных доменов, информация об их клеточной роли практически отсутствует. Предполагается, что их общебиологическая функция заключается в регуляции активности SPT, которая зависит от субъединицы SPTLC1 [17]. ORMDL реагирует на повышенные уровни церамидов, вызывая сдвиг в относительном положении субъединиц SPT (нарушая стереоспецифичность) для снижения его каталитической активности [10]. Такая регуляция необходима для обеспечения продукции церамидов на достаточном уровне и предотвращения накопления церамидов до проапоптотических уровне [10].

“Выключение” SPT способно влиять на физиологические процессы в адипоцитах, в том числе дифференцировку. Одни научные группы сообщают о сохранности дифференцировки адипоцитов [83], другие свидетельствуют о нарушении данного процесса при ингибировании субъединицы SPTLC2 мириоцином, изопротеренолом, форсколином [45, 47]. Кроме того, блокировка синтеза церамидов de novo на этом этапе оказывает патологическое воздействие на адипоциты, так как фермент необходим для нормального функционирования клеточной мембраны и внутриклеточных сигнальных путей [13].

Экспериментальные исследования показали эффективность ингибирования синтеза церамидов de novo на уровне SPT для нивелирования их патофизиологических эффектов [28]. Высказано предположение, что данный подход может быть использован при терапии ожирения, метаболического синдрома, атеросклероза, кардиомиопатии, стеатоза и ИР [37, 45, 82].

2. Вторым ферментом синтеза церамидов de novo является кетосфинганинредуктаза (3KSR) [2]. 3KSR имеет молекулярную массу 36 кДа, локализован в ЭПР с активным центром, обращенным к цитозольной мембране [6, 65].

Ген 3KSR впервые идентифицирован более 20 лет назад у дрожжей, затем было показано, что 3KSR млекопитающих кодируется геном, ранее описанным как ген транслокации-1 варианта фолликулярной лимфомы (FVT-1) [38].

Во время второй реакции пути de novo происходит восстановление 3-кетосфинганина 3KSR с образованием сфинганина. Учитывая, что по данным липидомики промежуточный 3-кетосфинганин в клетках встречается редко, считается, что эта реакция происходит очень быстро, причем уровень 3-кетосфинганина не влияет на скорость ее протекания, так как активность 3KSR in vitro выше, чем SPT [88]. Так, на культуре клеток Hek (Human Embryonic Kidney 293), полученной из почек эмбриона человека и характеризующихся 4–8-кратным увеличением биосинтеза церамидов de novo, при масс-спектрометрическом анализе 3-кетосфинголипидов обнаружено не было. При инкубировании клеток Hek с добавлением серина и пальмитиновой кислоты 3-кетодигидроцерамиды были выявлены [50].

Ген 3KSR расположен на 18 хромосоме в локусе 18q21.33, содержит 10 экзонов, повсеместно экспрессируется в различных тканях человека и мышей, в том числе жировой. Максимальная экспрессия наблюдается в плаценте, высокая – легких, почках, желудке и тонком кишечнике, низкая – в сердце, селезенке и скелетных мышцах [2].

Белок 3KSR состоит из 332 аминокислот и, предположительно, имеет три трансмембранных домена, N-конец локализован в просвете ЭПР, а остатки активного сайта и C-конец – в цитозоле [38].

Регуляция экспрессии гена 3KSR и активности кодируемого белка in vivo недостаточно изучена из-за отсутствия животных моделей, но предполается их активация при стрессе ЭПР [38]. На основании полученных данных липидомики Merrill A.H. Jr. (2005) [50] высказано предположение, что при избытке 3-кетосфинганина он скорее ацилируется, чем накапливается в виде сфингоидных оснований. Однако имеются сообщения о выявлении церамидов на основе 3-кетосфинганина в митохондриях, при этом 3KSR остается практически неуловимым [4].

Показано, что хромосомные аберрации с участием 3KSR являются причиной фолликулярной лимфомы, вариабельной и прогрессирующей эритрокератодермии, спинальной мышечной атрофии. Данные о влиянии нарушений функций/экспрессии 3KSR в адипоцитах на развитие кардиометаболических заболеваний отсутствуют, что, вероятно обусловлено высокой скоростью протекания реакции, катализируемой этим ферментом [38].

3. Третим ферментом пути de novo является церамидсинтаза (CerS). У млекопитающих выявлено 6 типов CerS (CerS1–CerS6), кодируемых шестью генами (также известными как гены гомологов обеспечения долголетия – Lass) [46].

Первоначально предшественник семейства генов Lass был обнаружен в дрожжах более 25 лет назад, в 2002 г. был определен первый CerS млекопитающих [46].

Фермент CerS катализирует ацилирование сфинганина с образованием дигидроцерамида. В физиологических условиях in vivo эта стадия протекает быстро из-за отсутствия накопления промежуточных соединений [24]. Известно, что дигидроцерамиды обладают способностью индуцировать аутофагию и стресс ЭПР [71].

Сравнительная характеристика генов CERS человека представлена в табл. 2.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о клеточной специфичности церамидсинтаз [8, 49]. Показано, что каждая ткань имеет уникальный профиль экспрессии CerS [46]. Более того, экспрессия CerS различается между типами клеток даже в пределах одного и того же органа, но патофизиологические причины необходимости такого четкого распределения CerS среди органов и типов клеток до сих пор неизвестны [60]. При помощи количественной полимеразной цепной реакции было показано, что среди всех CerS наиболее широкое распространение в тканях и высокий уровень экспрессии имеет CerS2, локализованная в ЭПР (по данным иммунофлуоресценции) [44].

Имеются немногочисленные сведения об адипоцит-специфической экспрессии CerS. Так, в адипоцитах обнаружены CerS5 и CerS6, в связи с чем их рассматривают в качестве потенциальных мишеней при лечении ожирения и СД2 [22, 64]. Другие авторы свидетельствуют о широкой экспрессии в ЖТ и адипоцитах CerS2 [44]. Отличительной особенностью гена CerS2 является его организация, характерная для гена “домашнего хозяйства” и расположение в хромосомных областях, которые реплицируются на ранних стадиях клеточного цикла [60].

Хотя регуляция экспрессии генов церамидсинтаз до конца еще не охарактеризована, показано, что уровень мРНК CerS5 повышается при повреждении ДНК [59], гипоксии/реоксигенации [35] и применении ингибитора AMPK (AMP-активируемой протеинкиназы) C [36]. В другой работе уровни CerS3 и CerS6 увеличивались за счет активации каннабиноидных рецепторов в клеточной линии лимфомы из мантийных клеток [27]. Лептин, напротив, снижал экспрессию CerS2 и CerS4 в белой ЖТ крыс [8].

Кодируемые CerS белки имеют различную молекулярную массу, которая составляет 39.5–46.4 кДа в зависимости от их вида (табл. 2). Все ферменты CerS имеют общий домен из шести трансмембранных спиралей (у CerS6 – 5), необходимый для их ферментативной активности при синтезе церамидов. CerS2-6 также содержат домен гомеобокса (Hox), называемый так, поскольку кодируемые ими белки, факторы транскрипции, содержат консервативный сцепленный с ДНК участок, обязательный для развития многоклеточных организмов [52].

Предполагается, что активность CerS регулируется не только доступностью жирных кислот в качестве субстратов для синтеза специфических церамидов с ацильной цепью, но и на уровне транскрипции, посттрансляционной модификации и деградации [55, 56].

Одним из путей посттрансляционной регуляции CerS1 является протеолиз [75]. Показано, что часть CerS1 подвергается транслокации из ЭПР на аппарат Гольджи в ответ на стрессорные агенты, такие как цисплатин и доксорубицин – препараты, обладающие цитотоксическим, цитостатическим и противоопухолевым действием, а также УФ-излучение. Транслокация и протеолиз зависят от каталитической активности CerS1 и контролируются протеинкиназой C. Существует мнение, что регуляция путем протеолиза специфична именно для CerS1, так как ни CerS4, ни CerS5 не деградировали после стресса [74].

Еще одним механизмом регуляции CerS может являться фосфорилирование: CerS2–CerS6 фосфорилируются на С-концевых участках [68].

Помимо этого, активность CerS2 и CerS5 может модулироваться путем образования димера в специфических условиях in vitro: активность CerS2 усиливается за счет коэкспрессии с каталитически активной формой CerS5 или CerS6 [43]. Димеры CerS образуются и при быстрой стимуляции синтеза церамида куркумином [43]. Физиологическая роль этих регуляторных механизмов еще до конца не определена и требует дальнейшего изучения. Предполагается, что путем образованием димеров CerS может регулироваться синтез церамидов, в результате чего образуются новые композиции ацильных цепей, которые зависят от взаимодействий CerS друг с другом [43, 68].

Считается, что церамидсинтазы имеют различные функции в зависимости от длины ацильных цепей продуцируемых ими церамидов [56]. Церамидсинтазы, используя жирные кислоты с разным количеством углеродных атомов, продуцируют церамиды с определенной длиной ацильной цепи: CerS1 включает жирную кислоту С18, CerS2 – C20–C26, CerS3 – C22–C26, CerS4 – C18–C20, CerS5 – C16, CerS6 – С14 и С16 [46]. Одной из самых примечательных особенностей CerS млекопитающих является то, что каждый фермент CerS может регулировать синтез церамидов, содержащих ацильные цепи определенной длины. Таким образом, ацильный состав церамидов зависит от ферментов CerS, а сверхэкспрессия одного из них приводит к повышенному синтезу церамидов с определенной длиной ацильной цепи [77].

Было продемонстрировано, что CerS5 и CerS6 участвуют в регуляции апоптоза в ответ на УФ- и ионизирующее излучение [26]. Как CerS5, так и CerS6 ответственны за радиационно-индуцированную продукцию церамидов C16:0 в ассоциированных с митохондриями мембранах ЭПР, что приводит к накоплению митохондриальных церамидов [46]. Известно наличие проапоптозной активности всех CerS, что используется при лечении онкологических заболеваний, так как фермент повышает чувствительность клеток к химиотерапевтическим препаратам [49].

Экспериментальные исследования с различными моделями нокаутов отдельных CerS продемонстрировали их значимость. Так, у мышей с дефицитом CerS1 наблюдалась мозжечковая атаксия, недостаток CerS2 приводил к развитию канцерогенеза печени, дефицит CerS4 – к изменению барьерной функции кожи, а недостаток CerS6 предотвращал развитие ожирения и ИР, вызванной ожирением [20, 80].

Несмотря на изучение CerS5 и CerS6 в экспериментальных исследованиях на нокаутных грызунах, характеристика CerS in vivo до сих пор отсутствует [26, 55]. Используя мышей с нокаутом CerS5, показана важность для поддержания клеточного пула церамидов C16:0 в белой ЖТ. Потеря CerS5 была ассоциирована со снижением прибавки в весе и улучшением общего состояния, включая гомеостаз глюкозы, наблюдалось уменьшение воспалительной активации белой ЖТ при диете с высоким содержанием жиров [26]. На основании полученных результатов высказано предположение, что снижение эндогенных церамидов C16:0 за счет генетического ингибирования CerS5 может помочь при лечении ожирения и сопутствующих ему заболеваний [26, 80].

Ранее была продемонстрирована возможность использования специфического ингибирования CerS6 как потенциального метода лечению ожирения и СД2, позволяющего избежать побочных эффектов глобального ингибирования синтеза церамидов [80]. Однако, несмотря на общепринятое мнение о том, что главная роль в развития ожирения принадлежит именно Cers6, необходимо проведение дальнейших исследований для оценки роли различных церамидсинтаз в развитии метаболических нарушений [13, 20, 46, 80].

4. Последним ферментом синтеза церамидов de novo является дигидроцерамид-десатураза (Degs) [49].

Ген, кодирующий Degs, был впервые клонирован в 1996 году у Drosophila melanogaster группой, которая исследовала роль этого гена (известного в то время как “дегенеративный сперматоцит 1 дрозофилы” или des-1) в инициации мейоза во время сперматогенеза. В настоящее время ген дигидроцерамид-десатуразы известен как DES1 или DEGS1 [5].

Degs катализирует добавление характерной 4,5-транс-двойной связи в дигидроцерамиды, которая придает церамидам уникальные свойства [49]. Последняя стадия пути de novo считается не менее важной, поскольку именно церамиды, а не дигидроцерамиды, являются конечными продуктами, участвующими в индукции апоптоза, аутофагии и окислительного стресса. Все эти процессы могут приводить к нарушению развития, дифференцировки и функционирования адипоцитов [5].

Существует мнение, что единственной дигидроцерамид-десатуразой в клетках человека является DEGS1 [41]. Ген DEGS1 расположен на 1 хромосоме в локусе 1q42.11, содержит 5 экзонов, повсеместно экспрессируется в различных тканях. Длина DEGS1 человека составляет 2058 пар оснований с кодирующей областью около 1100 пар оснований [21]. Однако имеются сведения об экспрессии DEGS2 в коже, почках, желудке, тонкой и двенадцатиперстной кишке. Ген DEGS2 локализован на 14 хромосоме в локусе 14q32.2, имеет 5 экзонов [58].

Хотя молекулярный механизм, приводящий к нарушению экспрессии DEGS1 в ЖТ людей до сих пор неизвестен, имеются данные, что TNF-α снижает транскрипционную активность гена Des1 в культивируемых адипоцитах мышей [5]. На основании чего считается, что хроническое воспаление слабой активности может способствовать дисфункции DEGS1 у лиц с ожирением. Кроме того, окислительный стресс и гипоксия, связанные с ожирением, также снижают активность Des1 в адипоцитах мышей [78].

Белок DEGS человека существует в двух изоформах (DEGS1 и DEGS2). В большинстве тканей, в том числе в ЖТ, двойная связь введена DEGS1, тогда как DEGS2 обнаружена лишь в эпителиальных клетках кишечника, почек и кожи, где она катализирует синтез фитоцерамидов [58]. Предполагается, что это множественный трансмембранный белок, локализованный в ЭПР [46, 76].

Фармакологическое ингибирование фермента DES1 в экспериментах на мышах in vivo подтвердило результаты, полученные in vitro, и гипотезу о том, что функционально активный фермент необходим для дифференцировки адипоциты [5]. Ингибиторами данного фермента является противораковое и противодиабетическое средство фенретинид, циклопропен-содержащий сфинголипид GT11 и соединение XM642 [53].

При помощи жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии показано, что ингибирование функции фермента DEGS сопровождается последующим накоплением эндогенных дигидроцерамидов, что приводит к остановке клеточного цикла. На основании полученных данных предполагается, что дигидроцерамиды обладают цитотоксическими эффектами в большей степени, чем церамиды [41].

При анализе аналогов дигидроцерамида, отличающихся длиной цепи, стереохимией и типом головной группы, было показано, что активность фермента DES у крыс in vitro снижается по мере увеличения длины алкильной цепи сфингоидного основания (т.е. С18/8>С18/12>С18/18), предположительно из-за большей нерастворимости гомологов с длинной цепью. Стереохимия сфингоидного основания также оказывала большое влияние на активность фермента: активность d-эритро-С18-сфинганина была примерно в 10 раз выше, чем l-трео-изомера жирной кислоты [53]. Кроме того, активность фермента зависит не только от структурных особенностей, но и от температуры, длительности хранения и рН среды (буфера) [21, 53].

Недавно Des1 был идентифицирован в качестве гена-кандидата, связанного с накоплением жировой массы у мышей, что свидетельствует о его потенциальной роли в адаптивном увеличении ЖT [61]. Показано, что Des1 экспрессируется преимущественно в зрелых адипоцитах мышей [5]. Экспериментальные исследования с использованием фармакологического или генетического удаления Des1 в преадипоцитах продемонстрировали нарушение адипогенеза и снижение накопления липидов, что было связано с повышенным окислительным стрессом, гибелью клеток, блокированием клеточного цикла, нарушением дифференцировки адипоцитов и базального липолиза (по данным липидомики) в зрелых адипоцитах мышей [5]. Наблюдаемые эффекты сочетались с повышением содержания дигидроцерамидов. При этом экспрессия Des1 в адипоцитах подавлялась в большей степени у мышей с генетическим и алиментарным ожирением по сравнению со здоровыми мышами. Одним из объяснений наблюдаемых изменений могут быть данные, согласно которым экспрессия Degs1 in vivo положительно коррелировала с массой белой ЖT у здоровых мышей, чего не наблюдалось у мышей с ожирением, у которых экспрессия Degs1 была снижена по сравнению с контролем. Экспрессия Degs1 in vivo положительно коррелировала с массой белой ЖT у здоровых мышей, чего не наблюдалось у мышей с ожирением, у которых экспрессия Degs1 была снижена по сравнению с контролем. Более того, подавление экспрессии DEGS1, аналогичное таковому в белой ЖT у мышей ob/ob, наблюдалось в висцеральной ЖT у пациентов с морбидным ожирением [66]. Полученные результаты позволяют рассматривать DEGS1 как новую потенциальную мишень для восстановления функции ЖТ и предотвращения метаболических нарушений, связанных с ожирением у людей [5].

Высказано предположение, что ферменты биосинтеза церамидов de novo существуют как мультимерный комплекс, который может напрямую регулироваться церамидами [17]. Так, церамидсинтазы способны образовывать гомо- и гетеродимеры, а активность одной из них может зависеть от другой [43, 46]. Учитывая, что SPT и CerS расположены на цитозольной поверхности мембраны ЭПР, 3-кетосфинганинредуктаза и дигидроцерамид-десатураза, возможно, тесно взаимосвязаны с SPT и CerS, образуя “комплекс синтеза церамидов”. Наличие такого комплекса обеспечило бы не только эффективное распределение субстратов между 4-мя ферментами, но и регуляцию пути de novo для снижения накопления церамидов в ЭПР. Период полураспада церамидов в ЭПР неизвестен, однако считается, что церамиды, образованные de novo, метаболизируется или быстро удаляются из ЭПР, транспортируясь в аппарат Гольджи [86].

Церамиды доставляются в аппарат Гольджи из ЭПР с использованием везикулярного и белок-опосредованного переноса при помощи транспортного белка CERT (белок транспорта церамидов). Активность белка CERT в последнее время широко изучается при атерогенезе [42, 49]. CERT представляет собой цитозольный белок массой 68 кДа с доменом, который катализирует межмембранный перенос церамидов, но не сфингозина, сфингомиелина или насыщенных и ненасыщенных диацилглицеролов, структурно напоминающих церамиды. CERT эффективно переносит церамиды C14, C16, C18 и C20, в отличие от церамидов с более длинными ацильными цепями [42].

В аппарате Гольджи церамиды могут далее метаболизироваться до сфингомиелина, церамид-1-фосфата, сложных гликосфинголипидов или гидролизоваться до сфингозина [29]. Механизмы, регулирующие уровни церамидов в ЭПР, до конца не определены, что требует дальнейшего изучения.

ЗНАЧИМОСТЬ ЦЕРАМИДОВ, СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПО ПУТИ DE NOVO, ДЛЯ АДИПОЦИТОВ

Предполагается, что в нормальных условиях путь de novo является обязательным для поддержания энергетического и метаболического гомеостаза адипоцитов, в отличие от других клеток [32]. Церамиды, синтезированные de novo, необходимы адипоцитам для быстрой реакции на изменение системного энергетического гомеостаза посредством уменьшения/увеличения своего размера в соответствии с усиленным накоплением/мобилизацией липидов. Кроме того, устойчивые к детергентам сфинголипидные домены, содержащие церамиды, защищают мембрану адипоцитов от неблагоприятного воздействия высоких концентраций жирных кислот во время их транспорта и метаболизма [79, 81].

С другой стороны, несмотря на то, что мембрана ЭПР является центром синтеза церамидов, их избыток приводит к гибели клеток [76]. Результаты экспериментальных работ демонстрируют, что церамиды вызывают гибель клеток тогда, когда они образуются в митохондриях [7]. Обнаружение церамидсинтазы в митохондриях позволяет предположить, что митохондриально-опосредованный апоптоз реализуется именно за счет пути de novo [7, 46]. Было высказано предположение, что церамиды являются одними из самых токсичных липидов, которые накапливаются у людей с ожирением, поэтому, чтобы защитить клетки от неблагоприятных эффектов церамидов, их уровни строго регулируются [86].

Одним из доказательств важности синтеза церамидов de novo в адипоцитах являются результаты, полученные при изучении роли синтезированных сфинголипидов адипоцитов в функционировании ЖТ мышей с нокаутом SPT – ключевого фермента пути de novo [13]. Показано, что у мышей с “выключением” SPT в адипоцитах наблюдалась значительная потеря массы ЖТ с возрастом, снижение жизнеспособности адипоцитов, повышенная инфильтрация макрофагами и фиброз ЖТ. Из-за потери ЖТ в качестве альтернативного места хранения липидов у таких мышей использовалась печень, о чем свидетельствовало ее окрашивание специфическим красителем липидов Oil Red O. Специфическое окрашивание продемонстрировало повышенное накопление липидов по сравнению с контрольными мышами. Кроме того, отмечалось нарушение толерантности к глюкозе и ИР, а также адипоцитокин-продуцирующей функции, проявляющееся значительным снижением сывороточных уровней лептина и адипонектина относительно группы контроля. При этом концентрации холестерина, триглицеридов, СЖК и глицерина существенно не различались. Уровни сфингомиелина в сыворотке мышей с делецией SPT также были снижены по сравнению с контролем [13]. Учитывая, что у мышей с делецией SPT адипоцитов наблюдается липодистрофия, а гены, участвующие в адипогенезе, метаболизме липидов и образовании кавеол, были идентифицированы как вызывающие семейные липодистрофии у людей, снижение продукции церамидов de novo может быть потенциальной причиной липодистрофий [13]. Высказанное предположение имеет важное клиническое и практическое значение, однако требуется дальнейшее изучение церамидов в локальных жировых депо человека.

РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ СИНТЕЗА ЦЕРАМИДОВ DE NOVO В РАЗВИТИИ КАРДИОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Кардиометаболическими заболеваниями называют группу взаимосвязанных заболеваний и факторов риска, включая сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), СД2, гиперхолестеринемию, атеросклероз и лежащие в их основе ИР, эндотелиальную дисфункцию и воспаление [54, 84].

Ранее проведенные экспериментальные исследования продемонстрировали повышенную экспрессию SPT у мышей ob/ob с генетическим ожирением, сопровождающимся гиперинсулинемией и повышенным TNF-α [73]. Предполагается, что увеличение уровня церамидов в адипоцитах людей, страдающих ожирением, также обусловлено повышенной экспрессией и активностью SPT [81]. Так, активация субъединицы SPTLC2 при ожирении подавляет инсулиновый ответ печени, что ведет к развитию ИР [39].

Считается, что в патогенезе кардиометаболических заболеваний основная роль принадлежит CerS5 и CerS6. Показано, что продуцируемый CerS5 C14:0 церамид необходим для индукции аутофагии и миристат-индуцированной гипертрофии кардиомиоцитов, ведущих к развитию сердечной недостаточности диабетической кардиомиопатии [67]. Хотя и CerS5, и CerS6 могут продуцировать C14-церамид in vitro [77], экспрессия CerS6 в сердце чрезвычайно низка, что подразумевает, что CerS5 является наиболее вероятным кандидатом для образование кардиальных C14:0 церамидов. Нокдаун CerS5 полностью блокирует индукцию гипертрофии кардиомиоцитов, вызванную миристатом; однако точный механизм, лежащий в основе индукции аутофагии с помощью CerS5 и C14:0-церамидов в сердце еще предстоит выяснить [44, 55].

Делеция CerS6 специфически снижает уровень C16:0-церамидов, увеличивает β-окисление и улучшает метаболизм глюкозы [80]. Недостаточность CerS2 приводит к компенсаторному увеличению количества длинноцепочечных C16:0-церамидов, ингибирующих IV комплекс дыхательной цепи и усиливающих окислительный стресс in vivo, что приводит к ИР. Сверхэкспрессия CerS6 ингибирует активность комплекса II дыхательной цепи [63].

Показано, что CerS2 и CerS5 могут по-разному регулировать чувствительность клеток к ионизирующему излучению, вызывающему апоптоз. Сверхэкспрессия CerS2 задерживает радиационно-индуцированный апоптоз в клетках HeLa, тогда как избыточная экспрессия CerS5 способствует ему [51]. Обнаружено, что индукция белка-супрессора опухоли p53 в клетках лейкемии Molt-4 с помощью γ-облучения увеличивала экспрессию CerS5, но не CerS6 в течение 4–10 ч после воздействия [59]. На основании полученных данных авторы предположили, что гибель клеток ограничивается CerS5-зависимой продукцией церамидов de novo [51, 59].

Продемонстрировано адипоцит-специфическое снижение экспрессии DES1 в ЖТ пациентов с ожирением и Des1 у мышей с генетическим и алиментарным ожирением [5]. Более того, эксперименты с использованием фармакологического или генетического удаления Des1 в преадипоцитах in vivo предотвращали адипогенез и уменьшали накопление липидов (по данным липидомики). Наблюдаемые изменения сопровождались окислительным стрессом, гибелью клеток, ингибировани клеточного цикла и увеличением содержания дигидроцерамидов, что свидетельствует о нарушении дифференцировки адипоцитов [5].

Вышеперечисленные исследования подтверждают роль CerS5, CerS6 и DEGS1 в развитии кардиометаболических заболеваний, что позволяет рассматривать ферменты биосинтеза церамидов de novo в качестве новых потенциальных мишеней для восстановления функции ЖТ и предотвращения метаболических нарушений, ассоциированных с ожирением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, биосинтез церамидов по пути de novo является необходимым и очень сложным процессом. Неоспоримыми преимуществами образования церамидов по пути de novo являются возможность увеличения содержания церамидов до более высоких уровней за счет изобилия пальмитоил-КоА и серина; возможность целенаправленного транспорта биологически активных соединений непосредственно на внутриклеточные мембраны, где они играют важную роль в поддержании специализированных функций (передача клеточных сигналов, сортировка липидов и белков, отток холестерина и воспалительная реакция) и целостности мембран. Образование и удаление церамидов может регулироваться активностью митохондрий при помощи образования церамидных каналов во внешней мембране митохондрий, по которым проапоптотические белки высвобождаются из митохондрий во время фазы индукции апоптоза. Предполагается, что этот путь может использоваться также для клеточной регуляции. Понимание биосинтеза церамидов de novo в физиологических и патологических условиях требует дальнейшего изучения для разработки новых терапевтических мишеней и стратегий при лечении ожирения и ассоциированных с ним заболеваний.