Вестник РАН, 2022, T. 92, № 8, стр. 731-736

В настоящий момент совершенно очевидно, что вакцинация – основной способ борьбы с пандемией, вызванной вирусом SARS-CoV-2. В нашей стране созданы эффективные вакцины, не уступающие, а, может быть, в чём-то и превосходящие зарубежные. При их разработке были использованы ранее полученные и опробованные платформы, которые позволили в рекордные сроки выпустить в гражданский оборот безопасные вакцинные препараты.

Пандемия продолжится, более того, вирусологи уверены, что мы столкнёмся и с другими зоонозными инфекциями, не один раз вирусы преодолеют межвидовой барьер, и человеческая популяция будет бороться с новым инфицирующими агентами. В связи с этим, безусловно, актуальна разработка новых платформ и панелей платформ для создания вакцин, которые позволят быстро реагировать на вызовы и бороться с вновь возникающими инфекциями [1]. В создание вакцинных платформ значительный вклад могут внести вирусы растений. Напомним, что в нашей стране около 40 лет назад академик И.Г. Атабеков создал школу молекулярной биологии вирусов растений. Она получила международное признание, были получены блестящие научные результаты, посвящённые фундаментальному изучению вирусов растений. Также успешно развивались прикладные работы, связанные с борьбой с вирусными инфекциями, наносящими значительный урон сельскому хозяйству.

За последние 10–15 лет ситуация в сфере фитовирусологии кардинально изменилась. Результаты исследований в области молекулярной биологии вирусов растений приобрели большое значение не только для фундаментальной науки и сельского хозяйства, но и для создания новых биотехнологий. Вирусы растений, обладая свойствами всех вирусных частиц (самосборка, иммуногенность, наноразмеры), абсолютно безопасны для человека, поскольку растения и млекопитающие не имеют общих инфекционных агентов [2]. Получение очищенных препаратов фитовирусов – процесс крайне малозатратный, так как не требует сложного оборудования, стерильности, культуральных сред и т.д. Кроме того, методики выделения вирусов растений из растительного материала давно и хорошо отработаны, что позволяет получать полностью очищенные препараты, не содержащие никаких примесей. В связи с этим вирусы растений изучаются и применяются в совершенно разных областях биотехнологии. Их используют в качестве носителей для функционально-активных молекул, они становятся базой для вакцин и могут рассматриваться как адъю-ванты, на их основе делаются микроэлектронные устройства, их используют как вирусные векторы для экспрессии целевых белков в растениях (рис. 1) [3].

Рис. 1.

Основные направления прикладных исследований вирусов растений в области биотехнологии и медицины

Представлены схематические изображения вируса табачной мозаики, Х-вируса картофеля, вируса мозаики костра (PDB: 1JS9), вируса мозаики коровьего горошка (PDB: 1NY7), вируса томатного кустарника (PDB: 2TBV)

Следует отметить, что благодаря научной школе И.Г. Атабекова мы находимся на передовой линии всех этих разработок, и те исследования, которые проводятся в нашей стране являются пионерскими. Конечно же, всё это время одним из объектов исследований был вирус табачной мозаики (ВТМ) – излюбленный объект фитовирусологов, первый вирус, который был обнаружен Д.И. Ивановским в 1892 г. На рисунке 2 представлено классическое изображение ВТМ, полученное с использованием метода просвечивающей электронной микроскопии. Нами было показано, что если ВТМ нагреть в течение нескольких минут при 94°С, то палочковидный вирион со спиральной структурой диаметром 18 нм и длиной 300 нм превращается в сферические частицы (СЧ), размеры которых можно регулировать в зависимости от исходной концентрации вирусного препарата от 50 до 1000 нм и больше [4]. На рисунке 3 показаны СЧ, сформированные при нагревании до 94°С в течение 10 с вируса табачной мозаики с начальной концентрацией 1 мг/мл, полученные методом сканирующей электронной микроскопии. В ходе термической перестройки вириона в сферическую частицу геном ВТМ освобождается от белковой оболочки и остаётся в растворе. Поэтому СЧ состоят только из белка оболочки вируса. Анализ ультратонких срезов сферических частиц позволил установить, что они однородны и не имеют полостей внутри [5]. Их плотность составляет 1.43 мг/мл, что значительно отличается от плотности вирионов ВТМ (1.31 мг/мл) [6]. То есть во время термической перестройки белок оболочки ВТМ претерпевает серьёзные конформационные изменения, что приводит к образованию более плотных, чем вирионы ВТМ, сферических частиц. СЧ обладают целым рядом удивительных свойств. Одно из самых важных – способность служить эффективным адъювантом (иммуностимулятором) [7].

Рис. 2.

Микрофотография вируса табачной мозаики

Изображение получено на кафедре вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова на просвечивающем электронном микроскопе Jem-1011 (Jeol, Япония)

Рис. 3.

Сферические частицы, полученные при термической перестройке ВТМ

Изображение получено на кафедре вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова с использованием сканирующего электронного микроскопа Merlin (Carl Zeiss, Германия)

Адъюванты активно используются в современной медицинской практике для усиления иммунного ответа организма при вакцинации против инфекционных агентов человека и животных. Адъювантную активность проявляют различные классы соединений, среди них: бактерии, минеральные соли, эмульсии, микрочастицы, небольшие молекулы, сапонины, липосомы. Однако только для некоторых из них удалось получить разрешение на использование в медицинской практике [8]. Основными проблемами адъювантов, используемых на данный момент в производстве вакцин, являются их низкая эффективность, способность негативно влиять на жизнедеятельность организма, затруднение при выведении адъювантных препаратов из организма после вакцинации. В связи с этим создание нового эффективного, биодеградируемого и дешёвого адъю-ванта – крайне актуальная задача современной молекулярной медицины, вакцинологии и вирусологии. Вирусы растений могут стать многообещающими иммуностимуляторами с такими свойствами. Некоторые особенности структурной организации и размеры фитовирусов позволяют им эффективно стимулировать иммунную систему млекопитающих [9].

Нами впервые проведено сравнительное исследование адъювантных свойств вирусов растений различных форм и размеров, содержащих разный генетический материал. В эксперименте использовались вирус табачной мозаики (палочковидный) и Х-вирус картофеля (нитевидный). Оба вируса содержат геном в виде РНК. Их иммуностимулирующие свойства сравнивали с вирусами с икосаэдрическим типом симметрии – вирусом мягкой мозаики фасоли с РНК-геномом и вирусом мозаики цветной капусты, генетический материал которого представлен в виде ДНК [10]. В этих же экспериментах участвовали и сферические частицы, полученные из ВТМ. В качестве модельных антигенов использовались овальбумин и лизоцим. Выяснилось, что по крайней мере два вируса из четырёх и СЧ могут работать как эффективные адъюванты, то есть активно стимулируют выработку иммуноглобулинов G (IgG) к целевым белкам по сравнению с титрами IgG у лабораторных животных, иммунизированных только модельными антигенами [10]. Следует отметить, что СЧ в сравнительных экспериментах значительно превосходили по своим иммуностимулирующим свойствам соединения алюминия, которые сейчас активно используются в существующих вакцинах, а также были сравнимы с таким адъювантом, как адъювант Фройнда, который разрешено использовать только в лабораторных условиях [7, 11]. Полученные результаты позволяют утверждать, что вирусы растений и их структурно модифицированные вирионы (сферические частицы) обладают значительными иммуностимулирующими свойствами и потенциально могут стать безопасными, эффективными и дешёвыми адъювантами.

Кроме высоких иммуностимулирующих показателей, сферические частицы обладают ещё рядом особенностей, которые позволяют рассматривать их как многообещающую платформу для создания вакцинных препаратов. СЧ крайне стабильны, их можно повторно нагревать до температуры 94–98°С, замораживать в диапазоне –18––70°С, хранить при 4°С и даже при комнатной температуре в течение более шести месяцев, с ними ничего не происходит: форма, размеры и агрегационное состояние не изменяются. СЧ полностью биобезопасны. В большой серии экспериментов было продемонстрировано отсутствие их токсичности (острой, хронической, репродуктивной и иммуннотоксичности) на различных видах лабораторных животных [12, 13]. Выше упоминалось, что растения и млекопитающие не имеют общих патогенов, но сферические частицы не содержат и нуклеиновой кислоты – генома вируса, они состоят только из белка оболочки и поэтому не представляют никакой опасности для млекопитающих, прежде всего для человека [4]. В отличие от вирионов ВТМ СЧ биодеградируемы. Показано, что при обработке препарата СЧ в присутствии структурно не модифицированных вирионов ВТМ протеиназой К в поле зрения при анализе просвечивающей электронной микроскопией остаются только частицы ВТМ, а сферические частицы полностью гидролизуются [14].

Важнейшая особенность сферических частиц – их уникальные адсорбционные свойства. На их поверхности за счёт гидрофобных связей и электростатического взаимодействия могут адсорбироваться белки любого размера и аминокислотного состава. В ряде работ с помощью метода иммунофлуоресцентной микроскопии мы продемонстрировали возможность посадки на поверхность СЧ белка оболочки Х-вируса картофеля, полиэпитопа гемагглютинина и эпитопа М2 белка вируса гриппа, тетраэпитопа А гликопротеина Е1 вируса краснухи, а также рекомбинантного антигена вируса оспы сливы. Все адсорбированные белки сохраняли свою антигенную специфичность и были доступны для взаимодействия с соответствующими антителами в составе комплексов со сферическими частицами [7]. Помимо индивидуальных белков на поверхности СЧ могут быть адсорбированы целые вирионы небольших простых икосаэдрических вирусов (диаметром 26–50 нм) – инфекционных агентов человека, сельскохозяйственных животных и растений [15]. Более того, именно на эти целевые белки или полноразмерные вирионы вырабатывается эффективный иммунный ответ при использовании комплексов “СЧ – целевой белок (вирион)” в качестве вакцинных кандидатов.

После проведения первых экспериментов по оценке иммуногенности таких комплексов на лабораторных животных стало очевидно, что образование комплекса с СЧ не только не препятствует выработке антител к целевому антигену, но и повышает эффективность иммунного ответа по сравнению с иммунизацией тем же антигеном без СЧ. То есть сферические частицы не только выступают платформой для презентации целевых белков-антигенов, но и обладают свойствами эффективного адъюванта. Это означает, что СЧ способны усиливать выработку антител на белки-антигены вне зависимости от их структуры, размера и происхождения. Важно отметить, что во всех исследованиях с использованием значительного количества разнообразных антигенов иммунный ответ на них в составе комплекса с СЧ был выше по сравнению с иммунным ответом на соответствующие индивидуальные антигены. Мы предполагаем, что постепенная диссоциация антигенов с поверхности СЧ, вероятно выполняющих роль депо целевых белков, может усиливать стимуляцию иммунного ответа [15].

Кроме того, проведена работа по сравнению количества антител, вырабатывающихся на антиген и СЧ при иммунизации композициями “СЧ–антиген”. Оказалось, что иммунный ответ на целевой антиген в 6–40 раз выше в зависимости от вида антигена, то есть сферические частицы активируют иммунный ответ именно на антиген, находящийся в композиции с ними, а не на собственный белок [10, 11]. Ввиду того, что СЧ являются адъювантом белковой природы, способность индуцировать выработку более высокого титра антител на целевой антиген, а не на адъювант – важное свойство, которое обусловливает особую привлекательность их использования в качестве универсальной платформы-адъюванта.

На основании свойств сферических частиц нами была создана схема получения вакцинного кандидата (рис. 4). Предложенный подход полностью универсален. Используя эту технологию, можно создать вакцину против практически любого патогена человека вирусной или бактериальной природы. Схема получения вакцинного кандидата достаточно проста. Специально выращенные листья табака обыкновенного (Nicotiana tabacum) механически заражают ВТМ, после инкубации в течение приблизительно трёх недель листья собирают и замораживают. Из заражённого растительного материала методом дифференциального центрифугирования выделяют очищенный препарат вируса табачной мозаики. Для получения СЧ исходный препарат вируса с заданной концентрацией инкубируют в термостате при 94°С в течение 5 мин. В результате образуются сферические частицы контролируемого размера. Параллельно с помощью генно-инженерных подходов создаётся генетическая конструкция рекомбинантного белка – целевого антигена. Экспрессия генетической конструкции может происходить в клетках любой природы. На рисунке 4 представлена экспрессия антигенов в бактериальных клетках кишечной палочки (Escherichia coli). При инкубации антигены за счёт уникальных адсорбционных свойств сферических частиц располагаются на их поверхности. В итоге мы получаем практически готовый вакцинный кандидат. Кроме того, нами была показана возможность одновременной посадки на поверхность СЧ трёх и более антигенов, что свидетельствует о перспективе создания поливалентных вакцин на основе сферических частиц [7, 16]. Предложенную технологию можно сравнить с детским конструктором. Есть основа – сферические частицы, на поверхности которых располагаются “кубики”-антигены. Их можно убрать, добавить или заменить, не затрачивая много времени и ресурсов.

Рис. 4.

Схема получения вакцинного кандидата на основе структурно модифицированного вируса табачной мозаики

На основе структурно модифицированного вируса табачной мозаики (СЧ) мы создали несколько прототипов вакцинных кандидатов против различных инфекций как вирусной, так и бактериальной природы (см. табл.), а также образцы кандидатных вакцин против ротавирусной инфекции человека, сибирской язвы, птичьего гриппа и др. Вакцинный кандидат против вируса краснухи на основе сферических частиц для женщин репродуктивного возраста, детей и людей с иммунодефицитом уже успешно прошёл доклинические испытания. С помощью метода иммуноэлектронной микроскопии, используя поликлональную сыворотку, полученную против вирионов краснухи, и частицы золота, конъюгированные со вторичными антителами в качестве маркера, мы увидели архитектуру комплекса “СЧ – антиген краснухи”. Оказалось, что в этом случае практически имитируется вирион вируса краснухи. Антиген регулярно покрывает поверхность СЧ так же, как поверхностный гликопротеид Е (основной антиген вируса краснухи) располагается на поверхности вириона [11]. Только вакцинный кандидат на основе СЧ абсолютно безопасен и нереактогенен по сравнению с аттенуированной вакциной, содержащей частицы вируса краснухи, кроме того, цена аттенуированной вакцины несравнимо выше.

В условиях пандемии, имея определённый опыт создания вакцинных кандидатов, мы начали работать над созданием вакцины против COVID-19, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2. На основе сферических частиц в качестве платформы-адъюванта создан поливалентный вакцинный препарат: три рекомбинантных антигена, включающие RBD-домен и консервативные эпитопы из S1 и S2 доменов S-белка, одновременно адсорбированы на СЧ. Одним из этих антигенов является консервативная аминокислотная последовательность, общая для ряда бетакоронавирусов. Такой подход, возможно, позволит заранее получать вакцинный препарат для борьбы с теми коронавирусами, которые в будущем могут перейти межвидовой барьер. Методом иммунофлуоресцентной микроскопии продемонстрировано, что на поверхности сферических частиц адсорбируются все три антигена [19]. Все антигены на поверхности СЧ легко заменить на другие, отличные по аминокислотному составу. Также можно изменить количество антигенов на поверхности СЧ. Такие корректировки могут быть внести в вакцинный препарат в короткие сроки в зависимости от эпидемической ситуации: появления новых штаммов SARS-CoV-2 или в случае перехода межвидового барьера другими бетакоронавирусами.

В настоящее время показана высокая иммуногенность таких комплексов и вируснейтрализующая активность сывороток животных, иммунизированных вакцинным кандидатом. Эксперименты проводились на мышах и хомяках, на этих же животных получены предварительные результаты по биобезопасности препарата [19]. Сейчас ведётся подготовка к исследованию вакцины на приматах. Всемирная организация здравоохранения внесла вакцинный кандидат против SARS-CoV-2 на основе вирусов растений в список перспективных [22].