Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА», 2022, T. 3, № 1, стр. 8-14

ВВЕДЕНИЕ

В ряду лекарственных веществ (ЛВ) противоопухолевого действия важное место занимает доцетаксел (DTX) – полусинтетический алкалоид из группы таксанов (рис. 1) [1]. Оригинальным препаратом на основе DTX является Таксотер (Sanofi-Aventis) [2].

Рис. 1.

Структурная формула доцетаксела.

Препараты доцетаксела применяются при монотерапии различных видов злокачественных новообразований – рака молочной железы, яичников, легких, простаты и др. В некоторых схемах лечения используются комбинации DTX с другими противоопухолевыми ЛВ (фторурацил, цисплатин, гемцитабин и пр.). Лечение DTX может вызывать различные побочные токсические эффекты: анемию, нейтропению, лейкопению, тошноту, рвоту, стоматит и пр. [3–5].

Для повышения эффективности и уменьшения токсического действия препаратов DTX разрабатываются различные системы доставки, в том числе адресного (таргетного) действия [6]. Избирательность доставки ЛВ в подобных системах увеличивается за счет наличия в них векторных молекул (векторов), обладающих специфическим сродством к поверхностным рецепторам опухолевых клеток. Одним из таких векторов является фолиевая кислота, а также ее производные [7, 8].

В ряду систем доставки ЛВ заметную роль играют полимерные частицы на основе полилактидгликолидов – сополимеров молочной и гликолевой кислот (PLGA) [9, 10]. Они характеризуются биосовместимостью, биоразлагаемостью, отсутствием токсичности, обеспечивают пролонгированное действие ЛВ [11–13].

Ранее была разработана полимерная композиция (комплекс) для молекулярно-прицельной терапии, содержащая DTX, на основе частиц P-LGA, модифицированных производным фолиевой кислоты (ПКМПТ-Д) [14, 15]. Показаны высокая цитотоксическая активность данной полимерной композиции в отношении опухолевых клеток в исследованиях in vitro [16] и хорошая переносимость в токсикологических исследованиях на животных [17] по сравнению с DTX (субстанцией). В [18] изучались устойчивость композиции к гамма-облучению и стабильность в процессе хранения.

Цель настоящего исследования – разработка и валидация методики количественного определения доцетаксела с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием (ВЭЖХ-УФ) в полимерной композиции на основе частиц PLGA.

МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись образцы экспериментальной полимерной композиции DTX, представляющей собой лиофилизат для приготовления суспензии, состав которой представлен в табл. 1. В работе также использовались “холостые” образцы, содержащие те же вспомогательные компоненты полимерной композиции, но без действующего вещества DTX.

Хроматографическое разделение проводили при помощи системы Agilent 1200 Series, оснащенной диодно-матричным детектором G1315C, бинарным двуканальным насосом G1312B, аутосемплером G1367C, дегазатором, термостатом колонок (Agilent Technologies, США). Обработку данных выполняли, используя программное обеспечение Agilent ChemStation, ver. B 04.03 SP 1 (Agilent Technologies, США). Применяли хроматографические колонки с обращенной фазой: Kromasil^® 100-5-C18 4.6 × 250 мм (Nouryon, Швеция) и Agilent Eclipse XDB-C18 5 мкм 4.6 × 250 мм (Agilent Technologies, США). Образцы взвешивали на весах GR-202, дискретность – 0.01 мг, максимальная нагрузка – 210 г (A&D, Япония). Отмеривание жидкостей (растворителей, растворов) проводили пипеточным одноканальным дозатором переменного объема 100–1000 мкл Ленпипет Техно, Thermo Scientific (Россия). Вспомогательное оборудование: шейкер вибрационного типа Vortex (ELMI, Латвия); центрифуга Eppendorf 5424 R (Eppendorf, ФРГ); лабораторная система водоподготовки Milli-Q Integral S. Kit (Millipore, Франция); колбы мерные 1 класса точности вместимостью 10 и 200 мл, соответствующие ГОСТ 1770-74 (Shott Duran, ФРГ).

Стандартный образец: доцетаксел безводный (Docetaxel Anhydrous), чистота 99.72% (Xi’an Terra Biochem Co. Ltd., Китай). Растворители: ацетонитрил, класс HPLC-gradient (Panreac Quimica S.L.U, Испания); диметилсульфоксид (ДМСО), х.ч. (Компонент-реактив, РФ); метанол, класс HPLC (Macron, Польша); кислота уксусная ледяная, х.ч. (Компонент-Реактив, РФ); вода очищенная (Milli-Q).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При разработке методики количественного определения DTX в составе полимерной композиции за основу были взяты условия хроматографирования методом ВЭЖХ-УФ из Европейской Фармакопеи (Docetaxel Trihydrate, monograph 2449) [19]. Использованный метод пробоподготовки с применением ДМСО обеспечил полное растворение и возможность последующего количественного переноса пробы в процессе получения аналитической концентрации DTX в растворе исследуемого образца, а низкое значение рН анализируемого раствора положительно сказывалось на эффективности разделения и показателе симметрии пика DTX на хроматограмме.

Валидация осуществлялась в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0012.15 “Валидация аналитических методик” Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания (ГФ XIV) [20]. Полученные результаты показали пригодность разработанной методики для решения поставленных задач.

Специфичность аналитической методики характеризует ее способность однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов [20]. Для установления специфичности анализировали стандартный образец DTX, образцы полимерной композиции, содержащие DTX, “холостые” образцы полимерной композиции, не содержащие действующего вещества. Анализировали также образцы полимерной композиции DTX, подвергшиеся гамма-облучению, полученные в [18] при проведении исследований на стабильность, с целью получения характеристик хроматографического разделения DTX и примесей (продуктов распада). На хроматограммах стандартного и испытуемого растворов время удерживания DTX совпадало и составляло ~27.5 мин (рис. 2, 3). На хроматограммах растворов “холостых” образцов пики со временем удерживания DTX отсутствовали (рис. 4). На хроматограммах растворов испытуемых образцов, содержащих пики DTX, а также примеси, наблюдалось их полное разделение (рис. 5).

Рис. 2.

Хроматограмма раствора стандартного образца доцетаксела.

Рис. 3.

Хроматограмма раствора полимерной композиции, содержащей доцетаксел.

Рис. 4.

Хроматограмма раствора “холостого” образца полимерной композиции (содержание доцетаксела 0%).

Рис. 5.

Хроматограмма раствора полимерной композиции доцетаксела, содержащей примесь (продукт разложения).

Линейность методики характеризуется наличием линейной зависимости величины площади пика на хроматограмме от концентрации определяемого вещества в анализируемом образце в пределах аналитической области. Аналитическая область (аналитический диапазон) методики, для которой была подтверждена линейность, составила от 4.25 до 425.06 мкг/мл DTX в растворе, что соответствует его содержанию в исследуемом образце от ∼0.2 до 20 мас. % (табл. 3). Полученный график линейной зависимости описывается уравнением y = 16.564 х + 13.843, параметр r² равен 0.9999 (рис. 6). Отклонение рассчитанной концентрации калибровочного раствора DTX от фактического значения укладывалось в норму (модуль значений отклонения для пяти точек не превышал 2%). Ожидаемое содержание DTX в образцах полимерной композиции находилось в диапазоне от 2 до 6%, в испытуемых образцах оно составляло от 2.4 до 2.8% (табл. 1). Таким образом, найденный аналитический диапазон соответствует требованиям, предъявляемым к разработанной методике.

Рис. 6.

Калибровочный график зависимости величины площади хроматографического пика доцетаксела от концентрации в растворе.

Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное [20]. Для оценки правильности рассчитывалась относительная ошибка (Е, %) отдельного определения для трех различных концентраций стандартного раствора (низкой, средней, высокой), по пять анализов для каждой концентрации. Полученные значения модуля величины E не превышали 2%, что соответствует норме (табл. 4).

Прецизионность методики оценивали как повторяемость (сходимость). Для полученных значений трех различных концентраций стандартного раствора (по пять анализов для каждой концентрации) были рассчитаны величины RSD. Полученные значения составили не более 2%, что находится в пределах нормы. Результаты определения правильности и прецизионности методики представлены в табл. 4.

Предел количественного определения (ПКО) методики определяли на основании данных линейности и прецизионности. За ПКО методики принимали минимальную концентрацию DTX в растворе, для которой возможно определение DTX со значениями относительного стандартного отклонения не более 2% в диапазоне линейной зависимости. ПКО методики составил 4.25 мкг/мл (соответствует ∼0.2% действующего вещества в испытуемом образце). Хроматограмма стандартного раствора DTX в концентрации, соответствующей ПКО, приведена на рис. 7.

Рис. 7.

Хроматограмма стандартного раствора доцетаксела в концентрации, соответствующей пределу количественного определения.

Для оценки устойчивости (робастности) методики (степени ее чувствительности к влиянию небольших изменений в параметрах, способных возникнуть при практическом использовании) провели исследование стандартного раствора DTX с использованием двух обращенно-фазовых хроматографических колонок разных производителей (Kromasil^® 100-5-C18 4.6 × 250 мм и Agilent Eclipse XDB-C18 5 мкм 4.6 × 250 мм). В результате исследования не было выявлено значительной разницы в величинах площадей пиков DTX (RSD суммарной выборки из равного количества измерений с использованием каждой колонки составило 0.72%), а также в критериях приемлемости хроматографической системы.

Особый интерес представляют результаты анализа полимерных композиций DTX, содержащих продукты его разложения. Основными посторонними примесями, образующимися в процессе воздействия гамма-радиации на композицию DTX, являются его изомеры, обладающие иной хроматографической подвижностью. Также было отмечено появление набора примесей, которых не было в исходной субстанции и в продукте (ПКМПТ-Д) [18]. Согласно полученным данным DTX в составе изучаемой полимерной композиции достаточно стабилен и не подвержен деструкции в процессе пробоподготовки.

Достигнутые значения параметров валидации хроматографической методики в полной мере удовлетворяли требованиям нормативных документов [20, 21]. Таким образом, подтверждены правильность подхода к выбору и разработке аналитической методики, а также ее эффективность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведена разработка методики определения доцетаксела c помощью метода ВЭЖХ-УФ в композиции на основе сополимера молочной и гликолевой кислот, содержащей производное фолиевой кислоты. Хроматографическая методика была валидирована в соответствии с требованиями ГФ XIV (ОФС.1.1.0012.15). Подтвержденный аналитический диапазон методики составил от 4.25 до 425.06 мкг/мл DTX в растворе. По всем валидационным характеристикам методика соответствует критериям приемлемости и пригодна для контроля качества полученных образцов полимерной композиции DTX по показателю “количественное определение”.