Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА», 2022, T. 3, № 1, стр. 15-19

ВВЕДЕНИЕ

Серебро известно с древних времен благодаря своим антисептическим свойствам. Его применяли в медицинских целях еще в Древнем Египте и Месопотамии. Так, в индусской аюрведической литературе упоминается об обеззараживании воды путем погружения в нее раскаленного серебра либо при длительном контакте с металлическим серебром при нормальных условиях [1]. Также упоминается эффективное использование свойств серебра рыцарями ордена Госпитальеров в XVI веке во время неудачной попытки захвата острова Мальта турками-османами [2]. Госпитальеры особое внимание уделяли гигиене: они отдавали предпочтение большим проветриваемым помещениям и посуде из серебра, в то время как турецкая армия использовала деревянную посуду. Рыцари намеренно отравили питьевую воду в колодцах на подступах к их территории трупами мертвых животных и турецких воинов. Среди османов начали распространяться кишечные инфекции, которые значительно ослабили их военный потенциал, в итоге туркам пришлось отступить, оставив остров. Так, до 1800 г. известны факты использования исключительно металлического серебра. Однако позднее стали применять его соли и коллоидные растворы (аргирол, протаргол). С начала 2000-х гг. в связи с развитием нанотехнологий начали активно использовать наночастицы серебра (НЧ Ag) в пищевой, фармацевтической и легкой промышленности, а также в медицине [3]. В настоящее время особенно востребованными являются биологически активные добавки и раневые повязки на основе НЧ Ag [4, 5].

В целом серебро в любых формах проявляет антибактериальные, противовирусные и фунгицидные свойства. Однако токсические свойства серебро и, в частности, его наночастицы могут проявлять не только в отношении патогенов, но и здоровых клеток [6, 7]. По сути биологическая активность и токсичность неразрывно и прямо пропорционально связаны. Сейчас понятен тот факт, что биологическая активность препаратов серебра зависит от степени их растворимости, так как в организме они в значительной степени взаимодействуют с водной фазой. Предлагается различать предельно допустимые дозы содержания серебра в воде с учетом способности к образованию водородных связей соответствующих соединений. Так, максимально допустимая концентрация для металлического серебра составляет 0.1 мг/м³, тогда как для растворимых его форм – 0.01 мг/м³ [8]. Таким образом, переход к растворимой форме, например к коллоидным растворам, повышает биодоступность серебра, а также усиливает его токсичность. Поэтому особое внимание следует уделять устойчивым растворам НЧ Ag, покрытых гидрофильной стабилизирующей оболочкой.

Токсичность серебра связывают со взаимодействием его ионов с отрицательно заряженными группами в клеточных биомакромолекулах [9]. При этом считается, что механизмы токсического действия ионной и наноформ различны. Наночастицы могут увеличивать проницаемость клеточной мембраны [10], а также выступать в качестве депо ионов. В итоге НЧ Ag могут приводить к нарушению метаболизма клетки, генетическим изменениям и апоптозу. Принято считать, что НЧ Ag приводят к генерации активных форм кислорода, которые и вызывают перечисленные неблагоприятные процессы [11].

В клинической практике известно такое состояние, как аргироз [12], которое может реализоваться при длительном экспонировании серебром, в том числе в наноформе, например, при лечении трофических язв и других гнойных поражений кожи. Оно представляет собой изменение цвета кожных покровов и слизистых оболочек. В целом аргироз является выраженным косметическим дефектом. Длительное экспонирование серебром и его наночастицами в относительно высоких дозах может реализоваться при рециркуляции серебра в экосфере. Например, в трофических цепях при введении удобрений на основе наносеребра в агропромышленный комплекс. Понимание процессов, реализующихся при взаимодействии серебра в наноформе с биологическими организмами крайне важно в связи с его активным использованием и внедрением в экосферу и биосферу.

Для оценки токсичности серебра весьма важны данные о его бионакоплении в различных органах. В наших предыдущих исследованиях впервые был обнаружен экстремально низкий уровень выведения НЧ Ag из головного мозга [13]. Поэтому было принято решение о продолжении данных исследований и проведении более подробного рассмотрения различных тканей организма. Настоящая работа посвящена изучению кинетики накопления серебра в организме лабораторных млекопитающих при длительных сроках пероральной экспозиции наночастицами серебра.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве источника НЧ Ag использовали коммерчески доступную биологически активную добавку “Арговит С” с исходной концентрацией 10 мг/мл (ООО НПЦ “Вектор-Вита”, Россия). Частицы были стабилизированы гидрофильным полимером поливинилпирролидоном. Размер наночастиц определяли методом динамического рассеяния света (ДРС, Malvern Zetasizer, Великобритания). Также изучали устойчивость препарата после хранения в темноте при температуре +2°С в течение 1 года методом ДРС.

В качестве модели млекопитающих использовали мышей-самцов линии C57Bl/6 с исходной массой тела 20–22 г, начиная с возраста 2 мес, которые были получены из Филиала “Столбовая” ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.

В качестве питьевой воды и для приготовления растворов наночастиц использовали очищенную воду “ОСМОТЕК” 40-30-2 (ООО “Фармсистемы”, Россия).

Массу накопленного во внутренних органах серебра определяли методом инструментального нейтронно-активационного анализа с использованием ядерного исследовательского реактора ИР-8 (Москва, Россия) мощностью 8 МэВ и гамма-спектрометра (ORTEC, США).

Для приготовления эталонных образцов использовали раствор государственных стандартных образцов (ГСО) серебра в форме нитрата серебра с концентрацией ионов 1 г/л (ЛенРеактив, Россия).

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

Для исследования наночастиц методом ДРС подбирали концентрацию растворов, обеспечивающую 10-кратное воспроизведение результатов. Для этого раствор разбавляли деионизованной водой в 50 раз.

В течение всего эксперимента животных содержали в индивидуальных клетках с неограниченным доступом к пище и воде в помещениях c автоматически поддерживаемыми температурой 23 ± 2°C и 12/12-часовым циклом день/ночь. Также в помещении контролировали влажность воздуха 45 ± 10%. Осуществляли еженедельный контроль массы тела животных.

Мыши были разделены на четыре группы по срокам введения наночастиц: 30, 60, 120, 180 сут. Каждая из этих групп также была разделена на две подгруппы: экспериментальную и контрольную. В каждой из подгрупп, относящихся к группам 30, 60 и 120 сут, было по 6 животных, к группе 180 сут – по 8 животных.

Наночастицы вводили ежедневно перорально в количестве 50 мкг/сутки/животное в составе питьевой воды. Для определения уровня потребляемой жидкости поилки еженедельно взвешивали.

По истечении указанных сроков введения наночастиц животных подвергали декапитации после наркотизации изофлураном (Baxter, США). У мышей отбирали головной мозг, легкие, тестикулы, печень, почки, кровь, сердце и селезенку.

Для облучения в канале ядерного реактора образцы тканей высушивали в сушильном шкафу в течение 72 ч при температуре 75°С. После этого помещали в полиэтиленовые контейнеры (Eppendorf, Германия) объемом 0.2, 0.5 и 2 мл, герметично закрывали и нумеровали влагоустойчивым маркером.

Одновременно готовили эталонные образцы с целью проведения инструментального нейтронно-активационного анализа по относительному методу. Для этого в такие же пластиковые контейнеры (для соблюдения идентичности форм-фактора) помещали хлопчатобумажную вату и добавляли известное количество ГСО серебра (100 нг). Контейнеры оставляли открытыми и высушивали на воздухе в течение 48 ч, после этого герметично закрывали. Также готовили плоские эталонные образцы. Для этого на бумажные диски помещали известное количество ГСО серебра и высушивали на воздухе. Далее экспериментальные и эталонные образцы помещали в алюминиевые пеналы. Каждый алюминиевый пенал содержал один эталонный образец с таким же форм-фактором, как и у экспериментальных образцов, а также 84 плоских эталонных образца.

Алюминиевые пеналы подвешивали в вертикальном канале ядерного реактора и облучали в течение 24 ч в потоке нейтронов 10¹² шт/см² · с. После облучения пеналы выдерживали в биозащите для распада высокоактивных короткоживущих изотопов и после этого проводили гамма-спектрометрические исследования образцов по активностям радиоактивного изотопа ^110mAg c периодом полураспада 250 сут.

Отметим, что нейтронно-активационный анализ является уникальным инструментом для исследования биокинетики небиоэссенциальных наночастиц, так как позволяет получать результаты с метрологической точностью и чувствительностью до 10^–9 г, а также регистрировать сигналы по активности от целых органов лабораторных млекопитающих, а не только их частей в отличие от большинства известных методов элементного анализа. Таким образом, он является высокочувствительным и интегральным.

Статистический анализ проводили в программе GraphPad Prizm 6.01 (La Jolla, США) с использованием непараметрического теста Манна–Уитни. Различия считали достоверными при p ≤0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно данным ДРС (рис. 1) средний размер наночастиц составил 34 ± 5 нм. Продемонстрирована высокая устойчивость суспензии наночастиц “Арговит С”, так как после хранения в течение 1 года, средний размер частиц остался прежним в пределах погрешности измерения.

Рис. 1.

Распределение числа частиц по размерам согласно данным ДРС. Средний размер частиц составил 34 ± 5 нм.

Удельная масса органов животных, получавших НЧ Ag, не отличалась от массы органов контрольных животных, за исключением массы легких для групп “30 суток” и “180 суток”, у которых средняя удельная масса была ниже, чем у контроля (рис. 2). Содержание серебра в контрольных образцах было ниже предела детектирования, поэтому кривые накопления были проведены из начала координат.

Рис. 2.

Масса легких животных экспериментальных и контрольных групп. Как видно из гистограммы, легкие животных, получавших наночастицы, для 30 и 180 сут их введения имели статистически значимо меньший вес по сравнению с контролем.

В табл. 1 представлены значения содержания серебра во внутренних органах. Как видно из таблицы, массы серебра в ряде органов составляют десятки нанограмм, являясь весьма малыми величинами. Содержание серебра в большинстве образцов сердца, почек и селезенки оказалось ниже предела детектирования, что не позволило провести статистическую обработку результатов.

Наибольшее абсолютное содержание серебра, как можно заметить, наблюдалось в тестикулах. Концентрации серебра в тестикулах также имели весьма высокие значения для сроков введения 120 и 180 сут (рис. 3а). Высокие концентрации серебра наблюдались также в легких и головном мозге.

Рис. 3.

Зависимость концентрации серебра во внутренних органах от периода введения наночастиц в двух масштабах: a – для всех органов, б – исключены данные для тестикул.

В крови и печени концентрации серебра были минимальными, что может быть связано с его быстрым вымыванием из этих органов [13] благодаря наличию большого количества клеток иммунной системы и сравнительно быстрому метаболизму. В первые же дни введения НЧ Ag наибольшие концентрации серебра наблюдаются именно в печени [14]. Однако, как видно из рис. 3б, через 180 сут введения концентрация серебра в печени даже снижалась, что свидетельствует о его вымывании. Наибольшие концентрации серебра в крови наблюдаются в первые часы введения при острой экспозиции [15]. Быстрый обмен между органами обусловливает ее быстрое очищение от потенциального токсина. Так, в [13] было показано, что после двухмесячного перорального введения НЧ Ag через 1 мес после его отмены из крови и печени вымывается соответственно 80 и 75% серебра. В то время как из головного мозга всего 5%. Относительно высокие концентрации накопления серебра в головном мозге наблюдаются и при столь длительной экспозиции наночастицами (рис. 3б). Это может быть связано с низкой степенью элиминации из нервной ткани [16, 17].

При сроках введения от 120 сут наблюдается экстремально высокое накопление серебра в тестикулах, что может быть связано с физиологическими и цитологическими особенностями гемато-тестикулярного барьера, а также низкой степенью элиминации его из этой ткани. Например, в [16] обнаружено, что при 28-дневном введении НЧ Ag крысам через 4 мес после отмены препаратов наблюдался относительно низкий уровень выведения серебра из тестикул. Такой же эффект был обнаружен в [17]. Вероятно, НЧ Ag проникают через гемато-тестикулярный барьер, но в связи с его особенностями, обусловливающими низкую степень элиминации, происходит значительное накопление серебра в тестикулах [17].

На рис. 3б также продемонстрированы относительно высокие концентрации серебра в легких, превышающие концентрации серебра в головном мозге. Эффект значительного накопления НЧ Ag в легких обнаружен и в [18], где мыши были экспонированы НЧ Ag интрапеританеально в течение 21 сут. Он может объясняться хорошим кровоснабжением легких и повышенными обменными процессами в них.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе высокочувствительного и репрезентативного метода инструментального нейтронно-активационного анализа получены кинетики накопления серебра во внутренних органах при длительном (от 1 до 6 мес) пероральном введении НЧ Ag. Обнаружено экстремально высокое накопление серебра в тестикулах, что делает длительный прием НЧ Ag потенциально небезопасным для репродуктивной системы. Также обнаружено значительное накопление серебра в легких и головном мозге. При этом определили, что удельная масса легких животных, экспонированных наночастицами в течение 30 и 180 сут, статистически ниже контрольных значений. Полученный результат свидетельствует о том, что основными органами-мишенями при длительном приеме НЧ Ag являются тестикулы, легкие и головной мозг. При этом обнаружено, что через 180 сут даже при постоянной экспозиции наночастицами серебро вымывается из печени. Также наблюдались относительно низкие концентрации серебра в крови.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 21-315-70016.