Вестник Военного инновационного технополиса «ЭРА», 2022, T. 3, № 1, стр. 20-23

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время фототрофные микроорганизмы (ФМ) рассматриваются в качестве перспективного экологически чистого возобновляемого сырья для производства продуктов питания, кормов, материалов, химических препаратов, топлива и различных ценных продуктов (таких как белки, жирные кислоты, углеводы, пигменты, антиоксиданты и др.) [1, 2]. ФМ обладают рядом преимуществ по сравнению с высшими растениями: высокой скоростью роста и поглощения диоксида углерода из атмосферы, могут расти на пресной и морской воде, а также могут быть выращены в сточных водах [3].

Euglena gracilis – вид одноклеточных фототрофных протистов, обитающих преимущественно в пресных биотопах. E. gracilis способна расти фотоавтотрофно (используя солнечный свет), гетеротрофно (используя внешний источник углерода) и миксотрофно (объединяет оба способа), а также способна к фагоцитозу. Промышленно значимые биопродукты, синтезируемые E. gracilis, включают в себя белки, содержащие незаменимые аминокислоты, липиды и β-1,3-глюкан парамилон. E. gracilis обладает естественными способностями, обеспечивающими переносимость ряда внешних стрессовых факторов, включая кислотные условия выращивания и ионизирующее излучение, а также способны связывать тяжелые металлы. E. gracilis может накапливать большие количества запасного полисахарида парамилон-β-1,3-глюкана, который может составлять до 80% от сухой массы клетки. Парамилон и другие β-1,3-глюканы представляют особый интерес из-за их иммуностимулирующей и антимикробной активности. Также имеются результаты, показывающие, что β-1,3-глюканы снижают уровень холестерина и обладают противодиабетической, антигипогликемической и гепатопротекторной активностью, а также используются для лечения рака прямой кишки и желудка [4].

С другой стороны, во многих научных работах показано использование ФМ, в том числе и E. gracilis, для эффективной очистки различных видов сточных вод с последующим получением из биомассы различных ценных продуктов, например таких, как биотопливо [5].

В настоящей работе рассмотрена возможность культивирования фототрофного микроорганизма E. gracilis CCAP 1224/5Z на питательной среде, имитирующей сточные воды, с целью накопления биомассы и полисахарида парамилона.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали культуру Euglena gracilis CCAP 1224/5Z из коллекции культур водорослей и простейших. Была выбрана E. gracilis, так как данная культура активно растет на богатых органическими веществами средах.

Посевной материал культуры E. gracilis выращивали на среде HUT [6]. Питательную среду готовили на дистиллированной воде, pH питательной среды доводили до 7 с помощью pH-метра путем добавления в среду раствора гидроксида натрия или соляной кислоты. Выращивание проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 150 мл питательной среды с постоянным перемешиванием со скоростью 100 об./мин на шейкере Thermo Scientific MaxQ 2000. Температуру при культивировании поддерживали на уровне 22 ± ± 1°C. Культура росла в условиях постоянного искусственного освещения люминесцентной лампой в течение дня и ночи (20 Вт, 6400 К) при интенсивности 3000 Лк. Состав питательной среды HUT представлен табл. 1. Также в питательную среду добавляли 1 мл исходного раствора микроэлементов. Состав исходного раствора микроэлементов представлен в табл. 2.

Все эксперименты проводили в колбах объемом 250 мл с 150 мл питательной среды с постоянным перемешиванием со скоростью 100 об./мин на шейкере Thermo Scientific MaxQ 2000. Температуру при культивировании поддерживали на уровне 22 ± 1°C. Культура росла в условиях постоянного искусственного освещения люминесцентной лампой в течение дня и ночи (20 Вт, 6400 К) при интенсивности 3000 Лк. В качестве питательной среды использовали синтетическую среду X1, имитирующую сточные воды с типичным весенним или осенним составом [7]. Состав среды X1 в мг/л представлен в табл. 3.

Контроль роста культуры осуществляли путем измерения оптической плотности на спектрофотометре Thermo Scientific Genesys 10s UV-Vis при длине волны источника 750 нм.

После культивирования суспензию культуры E. gracillis центрифугировали при 5000 об./мин на центрифуге Awel Mf 20. Биомасса подвергалась разрушению при помощи ультразвуковой ванны (35 кГц, 0.2 кВт). Ультразвуковое разрушение проводили циклами по 1 мин. Целостность клеток E. gracilis проверяли после каждого цикла с помощью микроскопа Nikon Eclipse E200 MV RS, разрушение повторяли, если в обработанном образце были обнаружены неразрушенные клетки.

Очистку дезинтегрированной биомассы проводили ресуспендированием в растворе, содержащем 1% додецилсульфата натрия. Суспензию инкубировали в течение двух дней при 37°С. Затем гранулы парамилона извлекали центрифугированием в течение 15 мин при 4000 об./мин. Промывку гранул парамилона дистиллированной водой и центрифугирование повторяли 2 раза. После второй промывки гранулы высушивали при 60°C до постоянной массы. Выход парамилона (Y_P/X) рассчитывался по формуле

где P и P₀ – количество парамилона в конце и начале культивирования соответственно, X₀ и X – количество биомассы в начале и в конце культивирования соответственно [8].

Определение абсолютно сухого вещества биомассы проводили высушиванием образца до постоянной массы.

В предварительно взвешенный стеклянный бюкс помещали точную навеску влажной биомассы и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 95°С в течение двух часов. Далее образец биомассы охлаждали до комнатной температуры в эксикаторе над слоем хлорида кальция, взвешивали и повторно выдерживали в сушильном шкафу в течение 45 мин, после чего образец охлаждали и взвешивали.

Количество выросшей биомассы (X) определяли по формуле

где X₀ и X – количество биомассы в начале и в конце культивирования соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выращивание культуры E. gracillis осуществляли в люминостате при условиях, описанных выше, в течение девяти дней. Микрофотография культуры в экспоненциальной фазе роста E. gracillis, выращенной на среде X1, представлена на рис. 1. Выход парамилона после девяти суток культивирования в представленных условиях составил 61.7%.

Начальная концентрация клеток E. gracillis для контрольной среды и X1 была одинаковой. С первого дня культивирования на среде X1 рост культуры был быстрее, чем в контроле (рис. 2).

Согласно полученным данным выход биомассы на среде X1 на 17.8% больше, чем на контрольной среде.

Измерение рН в процессе роста культуры E. gracillis проводили в течение девяти суток. Исходные рН для экспериментальной и контрольной среды – 7.0 и 9.1 соответственно. Для контроля наблюдалось увеличение рН до 8.8, в случае с синтетической средой рН снизился до 8.4 (рис. 3).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показана возможность эффективного культивирования E. gracillis на среде, имитирующей сточные воды. Продуктивность по биомассе на экспериментальной среде выше, чем на контрольной. Выход парамилона составил 61.7%.

Работа выполнена в рамках тематического плана 1.12 “Разработка научно-технических основ для создания автономных систем жизнеобеспечения для использования в условиях Крайнего Севера, Арктики и космоса” НИЦ “Курчатовский институт”.