Высокомолекулярные соединения (серия А), 2019, T. 61, № 6, стр. 485-490

ВВЕДЕНИЕ

Среди многочисленных систем доставки биологически активных веществ особое место занимают бислойные липидные везикулы (липосомы) [1, 2]. Уникальное строение липосом позволяет инкапсулировать в них вещества различной природы: гидрофобные и амфифильные в липосомальную мембрану, гидрофильные во внутреннюю водную полость липосом [3–7]. Иммобилизация нескольких десятков анионных липосом на поверхности катионного коллоидного носителя позволяет сконцентрировать их в небольшом объеме и тем самым повысить эффективность захвата инкапсулированного лекарства клетками [8–10].

Электростатическое связывание липосом на поверхности полипептидных везикул [11], полилактидных мицелл [8, 10] и хитозановых частиц [12, 13] приводит к получению биодеградируемых мультилипосомальных носителей, которые могут быть выведены из организма после выполнения ими транспортной функции. Для создания таких конструкций были использованы липосомы, сформированные из электронейтрального и отрицательно заряженного липидов [8, 10, 12, 13]. Вместе с тем традиционные липосомы, рекомендованные в качестве контейнеров лекарств, содержат в своем составе холестерин [14], повышающий стабильность липосом в биологическом окружении [15], при этом мольная доля холестерина может достигать 0.4–0.5 [16–18].

Показано, что встраивание холестерина в липосомальную мембрану уменьшает подвижность алкильных цепей липидных молекул [19, 20], что приводит к формированию дефектов в анионных липосомах после их связывания с линейным катионным полимером [21]. Вопрос о сохранении целостности анионных липосом, адсорбированных на катионном полимерном носителе, является ключевым, так как определяет возможное биомедицинское применение мультилипосомальных конъюгатов.

В настоящей работе описана адсорбция анионных липосом с разным содержанием холестерина на поверхности катионных микрочастиц хитозана, природного биодеградируемого полимера [22, 23]. Особое внимание уделено целостности адсорбированных липосом, а также cоставу и размеру полученных конструкций.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Хитозановые частицы получали в ацетатном буфере с рН 5.5 взаимодействием хитозана с М = = 30 × 10³ с сульфат-анионами (подробнее см. в Экспериментальной части). ЭФП частиц была равна +1.6 ± 0.1 (мкм/с)/(В/см). Очевидно, что положительный заряд микрочастиц определялся зарядами, привнесенными протонированными аминогруппами хитозановых макромолекул, не участвовавшими в образовании солевых связей с сульфат-анионами. Размер (гидродинамический диаметр) частиц составлял 225 ± 20 нм и лишь незначительно (на 5%) увеличивался при замене ацетатного буфера на физиологический раствор с концентрацией NaCl = 0.15 моль/л.

На поверхности хитозановых микрочастиц адсорбировали анионные липосомы ДОФХ/КЛ^2–/Хол с мольной долей анионных КЛ^2– “головок” ν_КЛ = = 0.1 и мольной долей холестерина ν_Хол, которая изменялась от 0.1 до 0.4. Адсорбцию проводили в буфере рН 5.5, где оба компонента несли противоположные по знаку заряды: микрочастицы – положительный, липосомы – отрицательный. После формирования комплекса хитозан–липосома внешний раствор меняли на ТРИС буфер с рН 7, следуя описанной ранее процедуре [12]; замена буфера не влияла на степень связывания липосом с микрочастицами [13]. Полученные таким образом суспензии анализировали методом микроэлектрофореза, измеряя ЭФП частиц комплекса.

На рис. 1 представлены кривые, отражающие зависимость ЭФП комплекса от концентрации липосом с мольной долей холестерина 0.1–0.4. Во всех случаях увеличение концентрации липосом сопровождалось нейтрализацией заряда микрочастиц и их последующей перезарядкой. При одинаковой форме кривых нейтрализующие концентрации липосом (Лип_нейтр) различались в 2 раза: они составляли 0.2 мг/мл для липосом с ν_Хол = = 0.1 и 0.2 (кривая 1) и 0.4 мг/мл для липосом с ν_Хол = 0.3 и 0.4 (кривая 2). Такое различие отражало разную форму участия анионных липидов в формировании солевых связей с катионными группами хитозана. В литературе описано изменение фазового состояния липидного бислоя (липидной мембраны) при встраивании в него холестерина [19, 20]. Увеличение содержания холестерина ограничивает латеральную (в пределах каждого монослоя) и трасмембранную (между монослоями) подвижность липидных молекул, что отражает переход мембраны из жидкокристаллического (жидкого) состояния в гелевое (твердое) [21]. В твердых липосомах с равномерным распределением анионного липида между монослоями в образовании электростатического комплекса с катионным полимером участвуют только анионные липиды, расположенные на внешней стороне липосомальной мембраны (половина от общего количества анионных липипдов в мембране). В отличие от этого, связывание поликатиона с жидкими липосомами сопровождается переходом анионных липидов с внутреннего монослоя на внешний (индуцированным флип-флопом), в результате чего все анионные липиды участвуют в образовании солевых связей с поликатионом [24]. При таком механизме для нейтрализации заряда поликатиона требуется вдвое большее количество твердых липосом по сравнению с жидкими (при одинаковом содержании анионного липида в мембранах обоих типов липосом). Именно это различие мы наблюдаем в случае электрофоретического титрования микрочастиц катионного хитозана анионными липосомами ДОФХ/КЛ^2–/Хол с разным содержанием холестерина (рис. 1), что позволяет говорить об индуцированном хитозаном флип-флопе в “жидких” липосомах с ν_Хол = 0.1 и 0.2 (кривая 1), а также об отсутствии флип-флопа в “твердых” липосомах с ν_Хол = 0.3 и 0.4 (кривая 2).

Рис. 1.

Зависимость ЭФП частиц комплекса хитозан–липосома от концентрации липосом. ν_Хол = 0.1 (а), 0.2 (б), 0.3 (в) и 0.4 (г). Здесь и на рис. 2–4: липосомы ДОФХ/КЛ^2-/Хол, концентрация хитозана 2.5 ×10^–2 мг/мл, 10^–2 M ТРИС-буфер, pH 7.

Таким образом, увеличение доли холестерина ν_Хол в мембране до 0.3 вдвое повышает предельное количество липосом N_макс, которое может связаться с каждой микрочастицей хитозана. Этот результат представляет большой интерес, поскольку позволяет заметно увеличить емкость мультилипосомального контейнера простым повышением содержания холестерина в липосомальной мембране. Мы оценили N_макс для комплекса микрочастиц хитозана и твердых липосом с ν_Хол = 0.3 и 0.4, использовав липосомы со встроенным в мембрану флуоресцентно меченным липидом ДОФЭ-КФ. Для оценки N_макс брали соотношение, приведенное в работе [12]. Суспензию хитозановых микрочастиц смешивали с суспензией флуоресцентно меченных липосом, отделяли комплекс хитозан–липосома центрифугированием и измеряли интенсивность флуоресценции надосадочной жидкости. Последнюю пересчитывали в концентрацию липосом, использовав соответствующую калибровочную кривую, и представляли в виде зависимости концентрации свободных (не связанных с хитозаном) липосом от общей концентрации липосом в системе. Как следует из данных рис. 2, оба типа твердых липосом связываются с хитозановыми микрочастицами до концентрации 0.5 мг/мл, что соответствует комплексу с N_макс = 150. Иными словами, каждая микрочастица хитозана диаметром 225 нм может в пределе связать 150 твердых анионных липосом диаметром 40 нм.

Рис. 2.

Зависимость концентрации липосом в надосадочной жидкости после отделения комплекса хитозан–липосома от общей концентрации липосом. ν_Хол = 0.3 (темные точки) и 0.4 (светлые).

Критически важным является сохранение целостности липосом в составе мультилипосомального контейнера. Ответ на этот вопрос был получен с помощью метода кондуктометрии. Липосомы ДОФХ/КЛ^2–/Хол с ν_Хол = 0.3 и 0.4, внутренний объем которых был заполнен 1 М раствором соли (NaCl), адсорбировали на поверхности хитозановых микрочастиц и следили за изменением электропроводности суспензии. Появление дефектов в липосомальной мембране сопровождалось вытеканием соли в окружающий раствор и возрастанием электропроводности. Из результатов, представленных на рис. 3, следует, что из липосом с ν_Хол = 0.3 соль не вытекала, т.е. они сохраняли свою целостность после адсорбции (кривая 1), в то время как липосомы с ν_Хол = 0.4 теряли 20% соли в течение первых 20 мин и 50% соли через 1.5 ч после формирования комплекса (кривая 2).

Рис. 3.

Кинетика изменения относительной электропроводности комплекса хитозан–липосомы. ν_Хол = 0.3 (темные точки) и 0.4 (светлые). Липосомы загружены 1М NaCl.

Для оценки размера мультилипосомальных контейнеров использовали метод динамического светорассеяния. На рис. 4 приведены результаты для комплекса хитозановых микрочастиц и липосом с ν_Хол = 0.3. Именно эти липосомы обеспечивали формирование комплекса с максимальным содержанием интактных (неразрушенных) липосом. Размер комплекса увеличивался по мере заполнения поверхности микрочастиц липосомами и достигал максимального значения 420 нм в области полной нейтрализации заряда микрочастиц: ср. данные рис. 1 (кривую 2) и данные рис. 4. Дальнейшее повышение концентрации липосом приводило к уменьшению размера комплекса до 310 нм, очевидно, вследствие появления на поверхности микрочастиц избыточного отрицательного заряда, привнесенного адсорбированными липосомами.

Рис. 4.

Зависимость размера частиц комплекса хитозан–липосомы от концентрации липосом. ν_Хол = 0.3.

Согласно литературным данным, размер частиц носителя 250–400 нм обеспечивает его проникновение в клетки по механизму пассивного транспорта через увеличенные поры в кровеносных капиллярах в местах воспаления [28]. Представленные в работе результаты указывают на то, что электростатические комплексы хитозановых микрочастиц и твердых анионных липосом с мольной долей холестерина 0.3 удовлетворяют этому размерному требованию. В большинстве случаев размер частиц комплекса не превышает 400 нм; такие мультилипосомальные частицы представляют интерес для иммобилизации и доставки лекарственных веществ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 19-03-00314).