Высокомолекулярные соединения (серия Б), 2022, T. 64, № 3, стр. 234-237

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали акриламид, акриловую кислоту, N,N'-метиленбисакриламид, персульфат аммония, N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин (“Serva”, Германия), сывороточный альбумин, гепарин, α-химотрипсин (“Sigma”, США), овомукоид из белка утиных яиц (“Белмедпрепараты” , Беларусь), толуидиновый синий (“ДиаМ”, Россия).

Для получения макромономера овомукоида 500 мг овомукоида растворяли в 100 мл 0.5 М раствора бикарбоната аммония (рН 8.0), раствор охлаждали до 0–5°С, добавляли 0.05 мл хлорангидрида акриловой кислоты и перемешивали в течение 30 мин. Макромономер гепарина синтезировали по аналогичной методике.

Для получения гемосорбента в 100 мл бикарбонатного буфера (рН 8.0) растворяли 10.0 г акриламида или смеси акриламида и предварительно нейтрализованной бикарбонатом натрия акриловой кислоты, 1.0 г N,N'-метиленбисакриламида, 1.2 г макромономера овомукоида или его смеси с макромономером гепарина. К полученному раствору добавляли катализатор – 0.08 г персульфата аммония и 0.08 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. Раствор вакуумировали при 10–12 мм рт.ст. и выдерживали при комнатной температуре (18–21°С) в течение 60 мин. Полученный гидрогель измельчали продавливанием через сито с диаметром пор 5 мм, промывали восьмикратным количеством дистиллированной воды, а затем воду замещали раствором соляной кислоты (рН 2.5). При этом гидрогель коллапсировал, существенно уменьшая объем и выделяя в раствор присутствующие в нем примеси. Процедуру замены воды на раствор соляной кислоты повторяли 2 раза в течение 8 часов, а затем гемосорбент промывали проточной дистиллированной водой до содержания акриламида в гидрогеле менее 0.01 мг на 1.0 г полимера. Для определения содержания в гидрогеле незаполимеризовавшегося акриламида, 1.0 г набухшего в воде гидрогеля заливали 50 мл дистиллированной воды и выдерживали в течение 48 ч. Концентрацию акриламида измеряли спектрофотометрически на приборе “Hitachi-3410” (Япония) при длине волны 220 нм, используя предварительно построенную калибровочную прямую.

Содержание звеньев акриловой кислоты в гемосорбенте оценивали титрованием карбоксильных групп гидроокисью калия. Количество иммобилизованных в гидрогеле овомукоида и гепарина оценивали по разнице между их исходной концентрацией и концентрацией в промывных водах. Овомукоид определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, а гепарин после его реакции с толуидиновым синим – при длине волны 500 нм [11]. Степень набухания гидрогелей оценивали гравиметрически и рассчитывали по формуле S_r = m₁/m₂ – 1, где m₁ и m₂ – масса равновесно набухшего и лиофильно высушенного гидрогеля соответственно.

Для изучения проницаемости к 2 мл геля, набухшего в 0.5 М бикарбонате аммония (рН 8.0) добавляли 4 мл раствора сывороточного альбумина в том же буфере. Смесь оставляли при 4°С до установления постоянного значения оптической плотности раствора белка при 280 нм (обычно не более 48 ч). Концентрацию белка в исходном растворе и после его инкубации с гелем оценивали с помощью калибровочной зависимости. Учитывая соотношения объемов используемых фаз, рассчитывали количество пор, доступных для белка, принимая за 100% количество пор, доступных для воды.

Для определения времени свертывания крови в стеклянной пробирке 2.0 г гемосорбента инкубировали с 5.0 мл крови и измеряли время образования сгустка крови.

Для изучения емкости гемосорбента его помещали в колонку объемом 25 мл и через колонку пропускали плазму крови человека, содержащую 1.1 мг α-химотрипсина в 1 мл, до полного насыщения сорбента. Количество сорбированного фермента определяли путем смывания его с колонки водным раствором с рН 1.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Процесс получения гемосорбента “Овосорб” включает сополимеризацию акриламида с ненасыщенным производным овомукоида и N,N-метиленбисакриламидом и последующее промывание получаемого гидрогеля апирогенной водой в течение полутора-двух суток. Столь длительное промывание гидрогеля, которое и является лимитирующей стадией всего процесса, обусловлено необходимостью удаления из гидрогеля крайне токсичного акриламида, способного поражать нервную систему, печень и почки [12, 13]. Остаточная концентрация акриламида должна быть менее 0.01 мг на 1.0 г полимера (ТУ 42-2-640-91).

Сокращение времени промывки может быть достигнуто приданием гидрогелю рН-чувствительности и проведением процесса промывания по типу промывание–отжим. Для этого в процессе полимеризации часть акриламида замещали акриловой кислотой. При нейтральных значениях рН карбоксильные группы звеньев акриловой кислоты (рК_а 4.8) ионизованы, что способствует увеличению объема набухшего гидрогеля из-за их взаимного отталкивания. При замене воды на раствор соляной кислоты (рН 2.0–2.5), подавляющей диссоциацию карбоксильных групп, существенно уменьшался объем гидрогеля (своеобразный “химический отжим”). Двукратное повторение этой процедуры и последующее промывание гидрогеля проточной дистиллированной водой снижало время достижения приемлемой концентрации акриламида в сорбенте (0.008 мг/г) до 15–18 ч.

При изучении свойств синтезированных сорбентов неожиданно было обнаружено, что введение в состав гидрогеля звеньев акриловой кислоты приводит к повышению емкости сорбентов по α-химотрипсину (табл. 1). Молекула овомукоида имеет один антихимотриптический центр, поэтому максимально достижимое значение сорбции составляет 0.7 мг α-химотрипсина с М 22 000 на 1 мг иммобилизованного овомукоида с М 31 000. В промышленно выпускаемом гемосорбенте эта величина равна 0.34 мг фермента/мг иммобилизованного овомукоида, т.е. только половина молекул овомукоида доступны для взаимодействия с ферментом, а вторая половина недоступна и локализована в стенках, разделяющих поры гидрогеля. Модификация гемосорбента акриловой кислотой почти в полтора раза увеличивает эффективность использования иммобилизованного овомукоида. Поскольку нет оснований предполагать, что сама модификация гидрогеля изменяет элементарный акт взаимодействия активного центра овомукоида с ферментом, скорее всего, причина данного явления заключается в структурных изменениях гидрогеля, формируемого с участием отрицательно заряженного мономера, приводящих к увеличению количества доступных для взаимодействия с ферментом молекул иммобилизованного овомукоида. При этом определяющим является не степень набухания гидрогеля, т.е. общее количество пор, а величина их поверхности.

Действительно, изменение степени набухания гемосорбентов путем полимеризации акриламида в отсутствие акриловой кислоты, но в присутствии различных количеств сшивающего агента не приводило к заметному изменению их емкостей. Так, эффективность иммобилизованного овомукоида в таких сорбентах со степенями набухания 10.3, 17.6 и 25.1 практически была постоянной и составляла 0.34 ± 0.04, 0.36 ± 0.04 и 0.40 ± ± 0.04 мг фермента/мг иммобилизованного овомукоида. При использовании акриловой кислоты в процессе образования гидрогеля изменялось распределение пор гидрогеля по размерам: повышалось количество мелких пор, на поверхности которых и происходит взаимодействие фермента с ингибитором. Так, например, при увеличении количества мелких пор, не доступных, например, для молекул сывороточного альбумина, гидродинамический диаметр которых равен 7 нм, с 22 до 42% емкость гемосорбента повышалась с 0.34 до 0.52 мг фермента/мг иммобилизованного овомукоида.

Введение в состав гидрогеля звеньев акриловой кислоты, карбоксильные группы которой ионизованы при физиологическом значении рН, как и ожидалось [14], позволило несколько повысить троборезистентность гемосорбента. Время свертывания крови в объеме гемосорбента в статических условиях контакта увеличивалось с 8–9 до 13–14 мин, что достаточно позитивно, учитывая то, что в динамическом режиме процесса гемосорбции время контакта с гемосорбентом определенного объема крови, равного объему колонки, составляет несколько минут.

Обычно для предотвращения свертывания крови при контакте с гемосорбентом пациенту перед операцией в кровь вводят антикоагулянт – гепарин в количестве 0.5–1.0 мг на кг массы с последующей его нейтрализацией протаминсульфатом. Особенность процедуры гепаринизации крови заключается в том, что даже небольшой избыток гепарина может вызывать кровотечение и поэтому необходимо добиваться строго сбалансированной антикоагуляции, чтобы, с одной стороны, предупредить тромбоэмболические осложнения, а с другой стороны, избежать геморрагических осложнений [15].

Очевидно, что гораздо более перспективным является предложенный в работе [16] способ химического связывания гепарина с гемосорбентом, который заключается в сополимеризации макромономера гепарина с акриламидом, сшивающим агентом и макромономером овомукоида. Время свертывания крови в объеме получаемого сорбента составляло 23–24 мин при содержании гепарина в сорбенте 0.15%. Близкий результат был получен и при использовании макромономера гепарина в процессе получения сорбента на основе акриламида и акриловой кислоты. Время свертывания крови составляло 22–23 мин при содержании связанного гепарина 0.19%, что должно значительно минимизировать количество вводимого в кровь пациента антикоагулянта и предотвращать возможные кровотечения. При этом гепарин проявлял свою антикоагуляционную активность исключительно в объеме гемосорбента и не выделялся в кровь. Концентрация свободного гепарина в крови после ее контакта с гемосорбентом не превышала 5 мкг/мл – минимальное значение, определяемое спектрофотометрическим методом после реакции гепарина с толуидиновым синим [11].

Таким образом, модификация гемосорбента “Овосорб” введением в его состав звеньев акриловой кислоты позволяет повысить сорбционную способность иммобилизованного овомукоида и его тромборезистентность, а также существенно упростить технологию получения гемосорбента.