Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 785-794

ВВЕДЕНИЕ

Липопротеины высокой плотности (ЛПВП), помимо участия в липидном обмене, оказывают регуляторное влияние на функции клеток различных органов и тканей организма. Так, митогенное действие ЛПВП продемонстрировано на культуре эндотелиальных [1], гладкомышечных [2] и опухолевых клеток [3]. В культуре гладкомышечных клеток ЛПВП усиливают клеточный рост, индуцированный эпидермальным фактором роста, фактором роста тромбоцитов и фактором роста фибробластов [4].

Регуляторные эффекты ЛПВП связывают с наличием на поверхности липопротеиновой частицы белкового компонента – аполипопротеина А-I (апоА-I) [5]. АпоА-I – высококонсервативный белок, состоящий из амфипатических α-спиралей [6]. Резкое увеличение уровня экспрессии плацентарного лактогена под влиянием апоА-I показано на клетках трофобластов человека [7]. В макрофагах апоА-I стимулирует синтез и секрецию простагландина Е2 [8], а в первичной культуре клеток костного мозга активирует пролиферацию прогениторных клеток гранулоцитарного и моноцитарного ростка [9]. Взаимодействие апоА-I с АТФ-зависимым кассетным транспортером (ABCA1) на плазматической мембране фибробластов приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей, включая Cdc42 [10].

Ранее нами было обнаружено, что апоА-I, выделенный из плазмы крови человека, стимулирует биосинтез белка в культуре гепатоцитов. Его стимулирующий эффект изменялся при взаимодействии со стероидными гормонами. Прединкубация апоА-I с кортизолом снижала стимулирующий эффект апоА-I, в то время как восстановленная форма кортизола – тетрагидрокортизол (ТГК) – усиливала эффект апоА-I [11]. Механизм обнаруженного явления остается неясным. Предполагается, что апоА-I выполняет роль переносчика гормонов в ядро клетки, где восстановленная форма гормона усиливает экспрессию генов с последующей активацией биосинтеза белка [12]. Однако не исключено, что взаимодействие апоА-I со стероидными гормонами, отличающимися по своей структуре, может сопровождаться конформационными перестройками, приводящими к изменению регуляторных свойств данного белка.

Цель данной работы – с помощью ИК-Фурье-спектроскопии изучить особенности изменения вторичной структуры апоА-I и сывороточного альбумина человека (ЧСА) под влиянием кортизола и его метаболита ТГК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ собственной флуоресценции белков широко используется для изучения механизмов связывания различных лигандов с белками [13–16]. Из трех флуоресцирующих аминокислот (триптофан, тирозин, фенилаланин) наиболее выраженной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра обладает триптофан, который обусловливает ~90% всей белковой флуоресценции. Флуоресцентные свойства триптофана крайне чувствительны к изменению его микроокружения. Поэтому комплексообразование с низкомолекулярными лигандами и макромолекулами сопровождается значительными изменениями спектра флуоресценции белков [13, 14].

С использованием метода тушения (снижения) флуоресценции триптофана [13] нами было исследовано взаимодействие стероидного гормона кортизола и его восстановленной формы ТГК с апоА-I. Для сравнения в аналогичных условиях анализировали взаимодействие стероидных гормонов с ЧСА. Как известно, аминокислотная цепь апоА-I (28 кДа) состоит из 234 остатков, включая четыре триптофановых остатка [17]. ЧСА (66.4 кДа) представляет собой глобулярный белок, состоящий из 585 а.о., включая один остаток триптофана (Trp214) [18]. В работе использовали коммерческий препарат ЧСА (Sigma, США). Для выделения нативного апоА-I применяли метод делипидирования свежевыделенных ЛПВП с помощью смеси бутанола и диизопропилового эфира [19]. Данный способ, в отличие от широко распространенного метода делипидирования плазменных липопротеинов с помощью смеси этанола и диэтилового эфира, позволяет избежать денатурации белка и, следовательно, сохранить в большей степени их исходную (нативную) структуру. Как видно из рис. 1, используемый нами метод позволяет получить гомогенный препарат апоА-I, очищенный от остальных белков, содержащихся в исходной фракции ЛПВП.

Рис. 1.

Электрофоретический анализ в 10%-ном ПААГ очищенного апоA-I и суммарной фракции ЛПВП, выделенных из плазмы крови человека с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr. Дорожки: 1 – апоА-I; 2 – ЛПВП; 3 – маркер масс белков (10–250 кДа).

Анализ спектральных свойств показал, что исходные спектры флуоресценции апоА-I и ЧСА имеют максимумы при 336 и 333 нм соответственно (рис. 2). При регистрации спектров в присутствии возрастающих концентраций гормонов максимум спектра флуоресценции апоА-I не изменялся, в то время как спектр флуоресценции ЧСА сдвигался в коротковолновую область (рис. 2). Наблюдаемое снижение интенсивности флуоресценции белков в ответ на увеличение концентрации гормонов свидетельствует о формировании комплексов гормон–белок, что сопровождается конформационными изменениями белка [20]. В нашем случае наибольшее снижение флуоресценции триптофана обнаружено у обоих белков под влиянием кортизола.

Рис. 2.

Влияние ТГК (а, в) и кортизола (б, г) на собственную триптофановую флуоресценцию апоА-I (0.1 мг/мл) и ЧСА (0.1 мг/мл).

Расчет констант связывания (К_b) гормонов проводили с помощью уравнения Штерна–Фольмера: F₀/F = 1 – K_b [Q]. Для определения K_b измеряли интенсивность флуоресценции белка в отсутствие (F₀) и в присутствии (F) различных концентраций [Q] кортизола или ТГК, но при постоянной концентрации белка [13]. Прямолинейная зависимость в координатах Штерна–Фольмера указывает на существование в растворе одного типа флуорофоров, одинаково доступных для тушителя (рис. 3). На основании кривых тушения флуоресценции триптофана были рассчитаны константы связывания кортизола с апоА-I и ЧСА, которые составили (1.0 ± 0.1) × × 10³ М^–1 и (2.0 ± 0.4) × 10⁴ М^–1 соответственно. В отличие от кортизола, его восстановленная форма вызывала менее выраженные изменения в спектрах обоих белков. Константа связывания ТГК с апоА-I составила (3.1 ± 0.4) × 10² М^–1, а с ЧСА – (8.2 ± 0.9) × 10² М^–1.

Рис. 3.

Графики Штерна–Фольмера для концентрационного тушения триптофановой флуоресценции апоА-I (а, б) и ЧСА (в, г) добавлением различных концентраций кортизола (б, г) и ТГК (а, в). По оси ординат – отношение максимальной флуоресценции белка в отсутствие лиганда [F₀] к интенсивности флуоресценции белка после добавления лиганда [F]. По оси абсцисс – концентрация лигандов [Q]. R – коэффициент корреляции Пирсона.

Различия, обнаруженные между влиянием гормонов на спектральные характеристики белков, можно объяснить разной способностью гормонов проникать во внутренние области белков. Незначительное снижение флуоресценции апоА-I под влиянием ТГК, вероятно, связано с тушением остатков триптофана преимущественно на поверхности данного белка и отражает неспособность данной формы гормона проникать во внутренние области белка. В целом полученные результаты свидетельствуют о том, что константа связывания гормонов с белками возрастает в ряду комплексов: апоА-I−ТГК < ЧСА−ТГК < < апоА-I−кортизол < ЧСА−кортизол. Полученные результаты подтверждают существующие в литературе представления о важной роли альбумина [16] в транспорте активной формы стероидного гормона кортизола.

Как известно, взаимодействие лиганда с белком может сопровождаться конформационными изменениями последнего. Например, изменение вторичной структуры ЧСА в сторону снижения доли α-спиралей зарегистрировано при его взаимодействии с тестостероном [21], дексаметазоном [19], прогестероном [22], тритерпеноидами [23] и противоопухолевым препаратом цисплатином [24]. Противоположные изменения в сторону увеличения доли α-спиралей и β-слоев зарегистрировано при взаимодействии ЧСА с транс-ресвератролом [25]. Учитывая тот факт, что апоА-I выполняет не только транспортные [5], но и важные регуляторные функции [9, 10], нами было исследовано влияние кортизола и ТГК на вторичную структуру апоА-I.

Анализ соотношения элементов вторичной структуры белка проводили с помощью метода ИК-Фурье-спектроскопии в области спектра амид I (1600–1700 см^–1). Данная область спектра – наиболее информативна и чувствительна к изменениям конформации полипептида за счет вклада валентных колебаний связей C=O [26, 27]. При анализе полосы амид I с помощью метода нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) использовали следующие интервалы положения пиков второй производной: α-спирали – от 1660 до 1649 см^–1, β-слои – от 1695 до 1680 см^–1 и 1637–1614 см^–1, β-повороты – от 1679 до 1675 см^–1 и от 1674 до 1664 см^–1, неупорядоченные структуры – от 1648 до 1638 см^–1 [25, 28].

Одно из ограничений данного метода – сильное поглощение воды в области спектра амид I. Использование тяжелой воды (D₂О) вместо Н₂О позволяет предотвратить вклад растворителя в спектр белка, однако не решает проблему полностью, поскольку D₂O может оказывать влияние на нативную структуру белка [29]. В последние годы получил широкое распространение метод НПВО, позволяющий снизить до минимума влияние растворителя на измерение спектра белков [30]. Кроме того, современные приборы за счет высокой чувствительности позволяют вычитать вклад растворителя в спектр белка. Проведенное нами сравнение спектров раствора ЧСА, приготовленного на D₂O и H₂O, не выявило значительных различий между этими образцами по соотношению элементов вторичной структуры ЧСА (табл. 1). Учитывая данный факт, все дальнейшие исследования были проведены с водными растворами белков, содержащими фосфатный буфер (рН 7.4).

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, вторичная структура ЧСА содержит α-спирали (68.8%), β-слои (7.3%), β-повороты (2.1%) и неупорядоченные структуры (21.8%) [31]. Однако данные о соотношении элементов вторичной структуры белков, полученные с помощью ИК-спектроскопии, могут существенно отличаться от этих значений. Так, количество α-спиралей в структуре альбумина, по данным разных авторов, колеблется от 47 до 70% [32]. Эти противоречия, вероятно, связаны с особенностями используемых в разных лабораториях методов регистрации и анализа ИК-спектров. Кроме того, результаты анализа вторичной структуры в значительной степени зависят от исходной конформации используемых белков, концентрации и способа их подготовки для анализа.

Проведенный нами анализ водного раствора ЧСА (Sigma, США) с помощью ИК-Фурье-спектроскопии выявил следующее соотношение элементов вторичной структуры: α-спирали – 47 ± 2%, β-слои – 21 ± 1%, β-повороты – 10 ± 2%, неупорядоченные структуры – 22 ± 2% (табл. 2). Подобная доля α-спиральных участков и неупорядоченных структур обнаружена в структуре апоА-I. Однако у апоА-I, по сравнению с ЧСА, содержание β-слоев было в 1.5 раза меньше, а β-поворотов – в 2.1 раза больше (табл. 2).

Для изучения влияния гормонов на структуру белков использовали аликвоты белков, приготовленные на фосфатном буфере (рН 7.4). Раствор белка (7.5 мг/мл) инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в присутствии стероидных гормонов в конечной концентрации 5 × × 10^–8, 5 × 10^–7 и 5 × 10^–6 М. Контрольные пробы инкубировали параллельно в присутствии соответствующей концентрации растворителя. Для количественного определения соотношения элементов вторичной структуры белка на алмазный кристалл ИК-спектрометра наносили 20 мкл полученной смеси и проводили запись ИК-спектра.

При инкубации апоА-I в присутствии 5 × 10^–6 М кортизола наблюдалось увеличение доли α-спиралей на 8% (р < 0.05) и снижение доли β-поворотов на 6% (р < 0.05) (табл. 2). ТГК, в отличие от кортизола, вызывал в структуре апоА-I увеличение доли β-поворотов на 7% (р < 0.05) за счет уменьшения доли α-спиральных участков на 9% (р < 0.05) (табл. 3). При этом доля β-слоев и неупорядоченных структур в апоА-I практически не изменялась под влиянием как кортизола, так и ТГК. При инкубации ЧСА в присутствии 5 × 10^–6 М ТГК (табл. 3) наблюдалось увеличение доли α-спиралей на 10% (р < 0.05) и снижение доли β-поворотов на 5%. Однако не обнаружено статистически значимых изменений в структуре ЧСА при его инкубации в присутствии всех исследуемых концентраций кортизола, а также в структуре апоА-I в присутствии 5 × 10^–8 и 5 × 10^–7 М кортизола (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о разнонаправленных изменениях в структуре апоА-I под влиянием кортизола и его восстановленной формы – ТГК. Возрастание доли α-спиральных участков характерно для комплексов апоА-I–кортизол и ЧСА–ТГК, в то время как снижение доли этих структур − только для комплекса апоА-I–ТГК. Учитывая существующие представления о механизмах образования вторичной структуры белка [33], можно предположить, что наблюдаемое увеличение доли β-структур в апоА-I под действием ТГК приводит к функциональной стабилизации белка.

Механизм взаимодействия исследованных нами гормонов с апоА-I остается неизученным. Предполагается, что связывание стероидных гормонов с белками происходит с участием водородных связей между атомами белка и полярными группами гормона, а также с помощью гидрофобных и гидрофильных связей [21].

Как видно из представленных на рис. 4 данных, наиболее выраженное влияние на область амид I обоих белков оказывает ТГК. При этом его влияние на структуру ЧСА имеет характер компактизации (увеличение доли α-спиралей), в то время как на ароА-I − характер декомпактизации (увеличение доли β-поворотов). Как известно, β-повороты участвуют в формировании механизмов молекулярного распознавания, белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий [34]. Исследования, выполненные на моделях пептидов с точечными аминокислотными заменами, показали, что в процессе фолдинга и рефолдинга β-повороты активно содействуют правильному сворачиванию белка за счет сближения фланкирующих регионов аминокислотных участков белковой глобулы [35]. При удалении центрального β-поворота белки теряют способность взаимодействовать с лигандом [36]. На долю β-поворотов в поверхностном слое глобулярного белка может приходиться до 30% [37]. АпоА-I относится к белкам со средним уровнем глобулярности [38]. По данным ИК-Фурье-спектроскопии, в составе апопротеинов липопротеинов высокой плотности содержится ~32% β-поворотов [28]. АпоА-I, в отличие от альбумина, обладает большей липофильностью и относительно высокой конформационной лабильностью [38].

Рис. 4.

Разложение полосы амид I по гауссовым компонентам для апоА-I (а), ЧСА (г), а также их комплексов с 5 × 10^–6 М ТГК (б, д) и 5 × 10^–6 М кортизолом (в, е). НС – неупорядоченные структуры.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что апоА-I не вносит существенный вклад в транспорт ТГК, но при его взаимодействии с этим метаболитом внутриклеточно или в биологических жидкостях может происходить изменение конформации апоА-I. Ранее нами было обнаружено, что взаимодействие ТГК с апоА-I усиливает стимулирующий эффект апоА-I на биосинтез белка в культуре гепатоцитов [11]. Можно предположить, что появление гидроксильной группы в кольце А в процессе биотрансформации кортизола в ТГК оказывает значительное влияние на взаимодействие ТГК с аминокислотными остатками, что, в свою очередь, приводит к изменению вторичной структуры и регуляторных свойств апоА-I. Следует заметить, что биотрансформация кортизола в ТГК, а также поглощение и ресекреция апоА-I в окружающую микросреду наиболее активно протекают в одной и той же клетке – макрофаге. Кроме того, макрофаги способны сами синтезировать [39] и, вероятно, секретируют данный белок, обладающий важными регуляторными свойствами [11].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы. В работе использовали ЧСА (код А4327; Sigma, США), диизопропиловый эфир (Sigma, США), кортизол (Serva, Германия), ТГК (Research Plus Inc., США), ДМСО (Panreac, Испания). Остальные реактивы имели категорию о.с.ч. или х.ч.

Выделение апоА-I. Липопротеины выделяли из плазмы крови человека методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na₂ на центрифуге Optima L-90K (Beckman Coulter, США) с использование углового ротора 70.1 Ti при 105 000 g [40]. Полученную фракцию ЛПВП диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) при 4°С в течение 24 ч. Для получения нативного апоА-I проводили делипидирование ЛПВП в неденатурирующих условиях смесью бутанола и диизопропилового эфира [17]. Очистку апоА-I осуществляли методом высаливания сульфатом аммония с последующим растворением белка в 6 М мочевине и его ренатурацией с помощью диализа против PBS (рН 7.4) в течение 24 ч [41]. Чистоту выделенного апоА-I проверяли с помощью электрофореза в ПААГ, используя набор белковых маркеров, содержащих высокоочищенные рекомбинантные белки с молекулярной массой 10–250 кДа (СибЭнзим, Россия). Концентрацию белка определяли по методу Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Флуоресцентный анализ. Константы связывания гормонов с апоА-I и ЧСА определяли методом тушения флуоресценции триптофана [13]. Для этой цели измеряли интенсивность флуоресценции раствора белка в отсутствие и в присутствии возрастающих концентраций гормонов, выступающих в качестве тушителей флуоресценции. Титрование проводили в термостатируемой (37°С) кварцевой кювете, содержащей 100 мкг белка в 1 мл PBS (рН 7.4). После добавления каждой аликвоты гормона к раствору белка содержимое кюветы интенсивно перемешивали и проводили измерение в течение 3 мин. Флуоресценцию триптофановых остатков белка регистрировали на спектрофлуориметре RF-5301 (Shimadzu, Япония) при длине волны возбуждения 280 нм и испускания (эмиссии) в диапазоне 300–500 нм. Стоковые растворы гормонов готовили в смеси спирта и ДМСО (в соотношении 1 : 1). Максимальная концентрация растворителя в растворах, содержащих белок и гормон, при проведении флуоресцентного анализа не превышала 5%. Вклад растворителя без гормона в интенсивность флуоресценции составлял не более 1.5% и не изменялся в исследуемом диапазоне волн 300–500 нм.

Инфракрасная спектроскопия. Влияние гормонов на вторичную структуру апоА-I и ЧСА исследовали методом нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) [42] с использованием приставки Smart Orbit на ИК-Фурье-спектрометре Nicolet 6700 (Thermo Scientific, США). Для этого аликвоты белка (7.5 мг/мл) в PBS (рН 7.4) инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в отсутствие или в присутствии стероидных гормонов в конечной концентрации 5 × 10^–8, 5 × 10^–7 и 5 × 10^–6 М. Для количественного определения соотношения элементов вторичной структуры белка на алмазный кристалл приставки Smart Orbit наносили 20 мкл смеси. Спектры регистрировали по 7 раз в диапазоне частот 4000–900 см^–1, 250 сканирований с разрешением 4 см^–1. Оптические пути прибора постоянно продували сухим воздухом для удаления паров воды. После вычитания из спектра белка спектра буфера, содержащего соответствующую концентрацию гормона или растворителя, проводили разложение области спектра амид I в диапазоне длин волн 1700–1600 см^–1, используя методы Фурье-деконволюции и второй производной [28]. Обработку спектров проводили с помощью программы OMNIC, поставляемой с прибором. Разложение спектров на индивидуальные полосы по Гауссу выполняли с использованием программного обеспечения Origin 9.0 [43]. Исследования проведены на оборудовании ЦКП “Спектрометрические измерения” НИИ биохимии, ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины (Новосибирск, Россия).

Статистический анализ. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов, выполненных в трех параллелях. Различия между выборками оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни и считали статистически значимыми при р < 0.05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время получено много фактов, свидетельствующих об участии апоА-I не только в транспорте холестерина, но и в регуляции внутриклеточных сигнальных путей, с которыми связаны его антиатерогенные, противовоспалительные и антиоксидантные свойства [10]. Ранее нами было показало, что регуляторные эффекты апоА-I зависят от конформационного состояния белка. В данной работе было исследовано влияние биологически активного гормона кортизола и его неактивного метаболита ТГК на вторичную структуру апоА-I. Для сравнения в аналогичных условиях было исследовано взаимодействие стероидных гормонов с ЧСА. С помощью метода тушения флуоресценции триптофана установлено, что наиболее высокую константу связывания имеют комплексы ЧСА−кортизол и апоА-I−кортизол. Полученные результаты подтверждают существующие представления о важной роли альбумина и апоА-I в транспорте активных форм стероидных гормонов. Однако использование ИК-Фурье-спектроскопии выявило наиболее выраженные и разнонаправленные изменения во вторичной структуре белков под влиянием неактивной формы кортизола – ТГК. При инкубации апоА-I в присутствии ТГК наблюдалось дозозависимое снижение содержания α-спиралей и увеличение содержания β-поворотов. В ЧСА под влиянием ТГК, напротив, количество α-спиралей возрастало, а β-поворотов – снижалось. Подобные изменения обнаружены в структуре апоА-I под влиянием кортизола. Механизмы взаимодействия исследованных нами гормонов с апоА-I остаются неизученными. Однако можно предположить, что конформационные изменения апоА-I, возникающие в процессе образования комплексов апоА-I со стероидными гормонами и их метаболитами, могут приводить к изменению акцепторных и регуляторных свойств данного белка.