1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 47, № 6, 2021

Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 841-844

Влияние длины спейсеров на свойства ДНК-зондов в гибридизационном анализе

Р. А. Мифтахов 1, С. А. Лапа 1, В. Е. Кузнецова 1, А. М. Золотов 1, В. А. Василисков 1, В. Е. Шершов 1, С. А. Суржиков 1, А. С. Заседателев 1, А. В. Чудинов 1, *, **

1 ФГБУН “Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта” РАН
119991 Москва, ул. Вавилова, 32, Россия

* E-mail: chud@eimb.ru
** E-mail: chudhome@rambler.ru

Поступила в редакцию 20.12.2020
После доработки 26.12.2020
Принята к публикации 29.12.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Разработан метод иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности полиэтилентерефталатной (ПЭТ) подложки. Исследована эффективность комплементарного связывания олигонуклеотида-мишени с олигонуклеотидами-зондами в зависимости от длины спейсеров, связывающих олигонуклеотиды-зонды с ПЭТ-подложкой. Показано, что увеличение длины спейсера приводит к возрастанию гибридизационного сигнала.

Ключевые слова: активация поверхности ПЭТ, иммобилизация олигонуклеотидов, гибридизационный анализ

ВВЕДЕНИЕ

При анализе нуклеиновых кислот используется формат выполнения анализа на поверхности твердой подложки, когда олигонуклеотиды, участвующие в анализе, ковалентно связаны с поверхностью подложки. В методе биочипов (англ. microarray) проводится анализ по связыванию анализируемой ДНК с набором олигонуклеотидов (зондов), закрепленных в матрице ячеек, каждая из которых содержит олигонуклеотид известного строения [1]. По пространственному распределению зондов на подложке можно классифицировать существующие технологические платформы биочипов на две основные группы: двумерные (2D), полученные на поверхности [2], и трехмерные (3D) – в гидрогелевых ячейках, закрепленных на поверхности подложки [3]. Вместимость пробы в гидрогелевых 3D-ячейках в ~100 раз больше, чем в 2D-ячейках [4, 5]. Олигонуклеотиды, непосредственно иммобилизованные в 2D-ячейке, менее доступны для взаимодействия с комплементарной ДНК из-за пространственных затруднений со стороны твердой подложки. Кинетика реакции гибридизации ДНК с олигонуклеотидами, иммобилизованными в 2D-ячейках за 3'- или 5'-конец, близка к кинетике реакции в растворе, в то время как в гидрогелевой ячейке она существенно осложнена диффузией анализируемой ДНК внутрь гидрогелевой ячейки, особенно для длинных молекул ДНК [4]. Использование спейсеров, отдаляющих иммобилизованные олигонуклеотиды от поверхности, позволяет увеличивать гибридизационный сигнал [6].

Хорошо отработаны методы иммобилизации для кремний-содержащих подложек [7] и подложек, покрытых тонким слоем золота [8]. Иммобилизация на полимерных подложках требует проводить подбор материала, совместимого с процедурами и компонентами, используемыми при анализе ДНК, и дает возможностью получить на поверхности подложки функциональные химические группы, необходимые для иммобилизации олигонуклеотидов.

Цель данного исследования – разработка метода иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности полиэтилентерефталатной подложки и изучение влияния длины используемых спейсеров на уровень гибридизационного сигнала.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В разработанном методе иммобилизация олигонуклеотидов осуществляется на поверхности полиэтилентерефталатной (ПЭТ) подложки. ПЭТ прозрачен в видимом и ближнем ИК-свете, биосовместим, термо- и химостоек в условиях проведения анализа ДНК [9].

Сложноэфирные группы на поверхности ПЭТ гидролизовали спиртовым раствором KOH, на поверхности получали карбоксильные группы. Карбоксильные группы активировали дисукцинимидкарбонатом. Поверхностную концентрацию доступных активированных карбоксильных групп определяли по связыванию с индикаторным веществом, цианиновым красителем Cy5, несущим первичную алифатическую аминогруппу, по ранее опубликованному методу [10]. Поверхностная концентрация составила 12 пмоль/см2.

Иглой робота-манипулятора на подложку наносили микрокапли раствора олигонуклеотидов [3]. Олигонуклеотиды соответствуют фрагменту гена rpoB Mycobacterium tuberculosis, содержат первичную аминогруппу и спейсеры различной длины на 5'-конце (рис. 1). Спейсеры С-18 на основе гексаэтиленгликоля вводили в олигонуклеотиды при автоматическом синтезе. После инкубации и отмывки проверяли продуктивность иммобилизованных олигонуклеотидов в гибридизационном анализе с комплементарным олигонуклеотидом-мишенью, маркированным флуоресцентным красителем Cy5. Интенсивность флуоресценции ячеек измеряли методом цифровой флуоресцентной спектроскопии на канале красителя Cy5 [11].

Рис. 1.

Схема иммобилизации олигонуклеотидов-зондов на полиэтилентерефталатной подложке. Oligos – соответствующая последовательность олигонуклеотида; n = 0, 1, 2, 4, 8.

Полученные результаты представлены на рис. 2. Видно, что увеличение длины спейсера С-18 повторением мономерной части 1, 2, 4 и 8 раз приводит к увеличению гибридизационных сигналов. Наибольший относительный эффект наблюдается для первого спейсера, сигнал увеличивается в 1.8 раза. Дальнейшее увеличение длины спейсера приводит к увеличению сигнала в ~1.2 раза на каждую мономерную часть спейсера. Общее увеличение сигнала составляет ~3.3 раза. График зависимости гибридизационных сигналов от длины спейсера далек от выхода на плато. Твердая поверхность затрудняет связывание иммобилизованных олигонуклеотидов-зондов с комплементарным олигонуклеотидом-мишенью даже при длине спейсера >144 атомов.

Рис. 2.

(а) – Флуоресцентная картина гибридизации олигонуклеотида-мишени с олигонуклеотидами-зондами с различным числом (n) мономеров спейсера С-18. Горизонтальные ряды A–E: n = 0, 1, 2, 4, 8 соответственно; вертикальные ряды: 1–4 – повторы олигонуклеотидов, 5 – контрольные ячейки с красителем Cy5; (б) – график зависимости средних значений гибридизационных сигналов в четырех повторах от числа мономерных звеньев спейсеров С-18 на олигонуклеотидах-зондах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовали образцы бесцветной пленки полиэтилентерефталата ПЭТ Э (ГОСТ 24234-80, плотность 1.39 г/см3, Mr = 20  000–40  000, размер 25 × 75 мм, толщина 200 мкм). Карбоксильные группы на поверхности ПЭТ получали выдерживанием пленки в 0.5 М растворе KOH в 96%-ном этаноле в течение 60 мин при комнатной температуре. Карбоксильные группы активировали 0.1 М раствором дисукцинимидкарбоната в диметилсульфоксиде в течение ночи при комнатной температуре.

Синтезировали набор олигонуклеотидов-зондов: 5'-NH2-Spn-TTGTTCTGGTCCATGAAT-3' (n = 0, 1, 2, 4, 8; Sp – спейсеры С-18 на основе гексаэтиленгликоля); олигонуклеотид-мишень: 5'-ATTCATGGACCAGAACAA-Cy5-3'. Твердофазный синтез олигонуклеотидов осуществляли с помощью автоматического синтезатора ABI 394 DNA/RNA (Applied Biosystems, США) по стандартному регламенту с использованием коммерческих растворителей и реагентов. Последовательность олигонуклеотида-зонда описана ранее [12], последовательность олигонуклеотида-мишени полностью комплементарна зонду. Спейсеры синтезировали по амидофосфитной технологии из коммерческих реагентов Glen Research (США).

Микрокапли растворов олигонуклеотидов-зондов в буферном растворе Na2CO3/NaHCO3 (рН 10.2) наносили иглой робота-манипулятора на активированную поверхность ПЭТ-подложки. После инкубации и отмывки в ультразвуковой бане на подложку наносили раствор олигонуклеотида-мишени в гибридизационном буфере. После инкубации подложку промывали SSPE-буфером (Invitrogen, США). Флуоpеcцентные cигналы ячеек на подложке pегиcтpиpовали на поpтативном анализатоpе (ООО “БИОЧИП-ИМБ”, Pоccия) с лазерным возбуждением при 650 нм, запирающим фильтром 716 ± 43 нм (Semrock, США) и цифровой ПЗС-камерой. Изображения анализиpовали c помощью пpогpаммы ImaGeWare (ООО “БИОЧИП-ИМБ”, Pоccия). В спектральном диапазоне флуоресценции красителя Cy5 полимерная подложка из ПЭТ-пленки практически не флуоресцирует и не влияет на регистрируемые сигналы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан метод иммобилизации олигонуклеотидных зондов на поверхности ПЭТ-подложки. Показано, что увеличение длины спейсера, связывающего зонд с подложкой, способствует увеличению гибридизационного сигнала. Максимальный гибридизационный сигнал достигнут при использовании спейсера, содержащего восемь гексаэтиленгликолевых фрагментов.

Список литературы

  1. Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V., Nasedkina T., Rubina A., Savvateeva E., Fesenko E., Chudinov A., Zimenkov D., Kolchinsky A., Zasedatelev A. // Expert Rev. Mol. Diagn. 2011. V. 11. P. 839–853. https://doi.org/10.1586/erm.11.73

  2. Naidu C.K., Suneetha Y. // Trop. J. Pharm. Res. 2012. V. 11. P. 153–164. https://doi.org/10.7314/apjcp.2016.17.4.2199

  3. Rubina A.Y., Pan’kov S.V., Dementieva E.I., Pen’kov D.N., Butygin A.V., Vasiliskov V.A., Chudinov A.V., Mikheikin A.L., Mikhailovich V.M., Mirzabekov A.D. // Anal. Biochem. 2004. V. 325. P. 92–106. https://doi.org/0.1016/j.ab.2003.10.010

  4. Zubtsov D.A., Savvateeva E.N., Rubina A.Y., Pan’kov S.V., Konovalova E.V., Moiseeva O.V., Chechetkin V.R., Zasedatelev A.S. // Anal. Biochem. 2007. V. 368. P. 205–213. https://doi.org/10.1016/j.ab.2007.04.040

  5. Brittain W.J., Brandstetter T., Prucker O., Rühe J. // ACS Appl. Mat. Int. 2019. V. 11. P. 39397–39409. https://doi.org/10.1021/acsami.9b06838

  6. Halperin A., Buhot A., Zhulina E.B. // Langmuir. 2007. V. 22. P. 11290–11304. https://doi.org/10.1021/la0616606

  7. Oh S.J., Cho S.J., Kim C.O., Park J.W. // Langmuir. 2002. V. 18. P. 1764–1769. https://doi.org/10.1021/ma0020032

  8. Zhi Z.L., Powell A.K., Turnbull J.E. // Anal. Chem. 2006. V. 78. P. 4786–4793. https://doi.org/10.1021/ac060084f

  9. Dimitrievska S., Maire M., Diaz-Quijada G.A., Robitaille L., Ajji A., Yahia L., Moreno M., Merhi Y., Rureau M. // Macromol. Biosci. 2011. V. 11. P. 493–502. https://doi.org/10.1002/mabi.201000390

  10. Мифтаxов Р.А., Лапа C.А., Шеpшов В.Е., Заcедателева О.А., Гуcейнов Т.О., Cпицын М.А., Кузнецова В.Е., Мамаев Д.Д., Лыcов Ю.П., Баpcкий В.Е., Тимофеев Э.Н., Заcедателев А.C., Чудинов А.В. // Биофизика. 2018. Т. 63. С. 661–668. https://doi.org/10.1134/S000630291804004X

  11. Lysov Y., Barsky V., Urasov D., Urasov R., Cherepanov A., Mamaev D., Yegorov Y., Chudinov A., Surzhikov S., Rubina A., Smoldovskaya O., Zasedatelev A. // Biomed. Optics Exp. 2017. V. 8. P. 4798–4810. https://doi.org/10.1364/BOE.8.004798

  12. Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A., Strizhkov B., Chernyh N., Skotnikova O., Irtuganova O., Moroz A., Litvinov V., Vladimirskii M., Perelman M., Chernousova L., Erokhin V., Zasedatelev A., Mirzabekov A. // J. Clin. Microbiol. 2001. V. 39. P. 2531–2540. https://doi.org/10.1128/JCM.39.7.2531-2540.2001

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал