Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 823-836

ВВЕДЕНИЕ

ГАМК и глутаминовая кислота – основные нейромедиаторы центральной нервной системы (ЦНС), принимающие участие в регуляции различных функций ЦНС в условиях нормы и патологии, в том числе при тревожных и депрессивных расстройствах. Тревожные расстройства характеризуются иррациональным неконтролируемым страхом и стойким чувством тревоги, сопровождаются нарушениями в модуляции мозговых цепей, которые регулируют эмоциональные реакции на потенциально опасные стимулы. Множество работ доказывают, что мозговые цепи в миндалевидном теле (часть лимбической системы) содержат ингибирующие сети гамма-аминомасляной кислоты, и этот нейротрансмиттер играет ключевую роль в модуляции как нормальных, так и патологических тревожных реакций. Воздействие на аллостерические сайты на поверхности ГАМК-рецепторов позволяет регулировать уровень ингибирования нейронов в миндалевидном теле. Именно на этом основано действие многих классов анксиолитиков. Изменения концентрации эндогенных модуляторов этих аллостерических сайтов, а также изменения в составе субъединиц рецептора ГАМК могут выступать механизмом, посредством которого подавляется нейрональное торможение в патологических состояниях тревоги [1].

Для производных ГАМК характерен широкий спектр фармакологической активности, который включает в себя анксиолитические, антиамнестические, седативные, противосудорожные и противогипоксические свойства, выраженность которых в значительной степени зависит от способности проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В данную группу препаратов входят линейные производные ГАМК (пикамилон, фенибут, баклофен, толибут и др.) и ее циклические производные из семейства рацетамов (фенотропил, пирацетам, прамирацетам, анирацетам, фазорацетам и др.) [2, 3].

Основу химической структуры рацетамов составляет молекула альфа-пирролидона (циклическая форма ГАМК). Препараты данной группы как ноотропные лекарственные средства, способствующие консолидации памяти, процессу обучения и повышающие умственную работоспособность, нашли широкое применение для лечения различных когнитивных нарушений, возникающих вследствие поражения ЦНС (ишемии, травмы и различные дегенеративные процессы) [4]. Анализ спектра фармакологической активности рацетамов показал, что производные альфа-пирролидона оказывают не только ноотропный, но и анксиолитический, антидепрессантный, противосудорожный, церебропротекторный и другие эффекты [4].

Другой подход к модуляции системы ГАМК–глутаминовая кислота – блокирование глутаматных NMDA-рецепторов, приводящее к опосредованному усилению ГАМКергического воздействия [5]. Такими свойствами обладают производные адамантана, которые широко применяются при лечении заболеваний, связанных со снижением выработки дофамина (астения, синдром хронической усталости, болезнь Паркинсона), судорожным синдромом, депрессивным и/или тревожным состоянием. В настоящее время в клинической практике применяется около 20 производных адамантана [6].

Уникальность адамантанового каркаса для биологического применения обусловлена его способностью повышать метаболическую стабильность и способствовать распределению препарата, что приводит к улучшению фармакокинетических свойств и увеличению способности препарата к взаимодействию с терапевтическими мишенями [7–14]. Кроме того, липофильная адамантановая структура способствует прохождению через гистогематические барьеры [7, 8, 10], что особенно важно при дизайне веществ с психотропной активностью. Многие психотропные средства недостаточно хорошо проходят через ГЭБ, что ослабляет их влияние на ЦНС. Модификация данных препаратов посредством введения адамантильного заместителя в ряде случаев повышало способность к проникновению через ГЭБ и способствовало повышению концентрации препарата в головном мозге [7, 8, 10, 11, 14].

Представленные данные обосновывают целесообразность поиска и изучения нейропсихотропных и церебропротекторных свойств у каркасных производных пирролидона. Цель настоящей работы – синтез новых производных пирролидин-2-она, содержащих структурные фрагменты адамантана и гомоадамантана, и изучение их психотропных свойств на лабораторных животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методы синтеза. 4-(Адамантан-1-ил)пирролидин-2-он (ANR-10) получен в соответствии с методикой, приведенной в работе [15].

1-(3-Гидроксиадамантан-1-ил)-пирролидин-2-он (IE-1) получен в соответствии с методикой, приведенной в работе [16].

1-Адамантилпирролидин-2-он (TIM-2) был получен путем нагревания 1-бромадамантана в запаянной ампуле при 140°C в течение 20 ч (рис. 1).

Рис. 1.

Схемы синтеза соединений. Синтез 1-(адамантан-1-ил)пирролидин-2-она (TIM-2) (а); синтез 2-(5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-ил)уксусной кислоты по реакции Холлера–Бауэра (б); гидролиз-декарбоксилирование этил-4-(2-этоксикарбонилметил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилата (в); синтез (3aS*,10aS*)-декагидро-4,8:6,10-диметаноциклононан[b]пиррол-2(1Н)-она (TIM-1) (г).

Рис. 2.

Показатели двигательной и ориентировочно-исследовательской активности крыс линии Wistar в тесте “Открытое поле” (ОП). Двигательная активность – количество пересеченных квадратов; ориентировочно-исследовательская активность – суммарное количество стоек и количество обследованных отверстий-норок; в группе “Контроль” n = 10, в опытных группах n = 8. * Различия достоверны относительно группы “Контроль” при p < 0.05 (критерий Данна).

(3aS*,10aS*)-Декагидро-4,8:6,10-диметаноциклононан[b]пиррол-2(1Н)-он (TIM-1) был получен в две стадии из этил-4-(2-этоксикарбонилметил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилата или этил-4-(цианометил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилата гидролизом и последующим восстановлением в условиях реакции Лейкарта–Валлаха (рис. 1). Относительная конфигурация стереоцентров была предположена исходя из модели Фелкина–Ана и подтверждена совокупностью данных двумерных экспериментов ЯМР HMQC, HMBC, NOESY.

Строение полученных соединений подтверждено совокупностью результатов физико-химических методов анализа, таких как ЯМР- и ИК-спектроскопия, а также соотнесением температуры плавления образца полученного соединения с литературными данными при наличии таковых.

Влияние исследуемых соединений на поведение животных. Изучение психотропных свойств исследуемых соединений проводили на крысах линии Wistar и мышах линии CBA (см. “Эксперим. часть”). Животным контрольной группы вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Тест “Открытое поле”. В тесте “Открытое поле” по сравнению с крысами контрольной группы, двигательная активность была значимо выше в группах крыс, которым вводили соединение IE-1 или фенотропил (рис. 2). Ориентировочно-исследовательская активность была незначимо выше в группах крыс, которым вводили соединение TIM-2 или препараты сравнения фенибут и фенотропил. У животных, которым вводили соединение TIM-1, двигательная и ориентировочно-исследовательская активность была незначимо ниже, чем у контрольных.

Тест “Приподнятый крестообразный лабиринт”. Тест “Приподнятый крестообразный лабиринт” (ПКЛ) использовали для изучения поведения крыс в условиях переменной стрессогенности (при свободном выборе комфортных условий): фиксировали время, проведенное животным в открытых рукавах, которые не были защищены стенками (потенциально стрессогенной зоне), а также количество выходов в открытые рукава и число свешиваний с их края.

В тесте ПКЛ животные, которым вводили некоторые исследуемые соединения или препараты сравнения, по сравнению с контрольной группой, чаще выходили (соединение TIM-2) и дольше пребывали в открытых рукавах (соединения TIM-2 и IE-1), а также совершали больше свешиваний с их краев (соединения TIM-2, IE-1 и ANR-10). Это свидетельствует об отсутствии тревоги и страха у животных, которым вводили исследуемые соединения или референтные препараты, при выходе и нахождении на открытых, ярко освещенных и значительно поднятых над уровнем пола рукавах лабиринта (рис. 3). Для уточнения специфичности и выраженности анксиолитического действия наиболее активных соединений на следующем этапе был выполнен тест конфликтной ситуации по Vogel.

Рис. 3.

Число выходов в открытые рукава (а), продолжительность нахождения в открытых рукавах (б) и количество свешиваний с их краев (в) крыс линии Wistar в тесте ПКЛ. ПКЛ – Приподнятый крестообразный лабиринт, ОР – открытый рукав установки; в группе “Контроль” n = 10, в опытных группах n = 8. * Различия достоверны относительно группы “Контроль” при p < 0.05 (критерий Данна).

Тест “Конфликтная ситуация в варианте Vogel”. Тест “Конфликтная ситуация в варианте Vogel” – высокоспецифичный тест при оценке анксиолитической активности соединений. Данный тест основывается на конфликте мотиваций между утолением жажды (после 48-часовой водной депривации) и страхом получить болевое раздражение при попытке взятия воды через поилку (которая находится под электрическим напряжением). Крысы, которым за 60 мин до тестирования ввели исследуемое производное пирролидона-2 (соединение TIM-2) или референтные препараты фенибут, диазепам, несмотря на действие сильного аверсивного фактора, продолжали подходить к поилке, чтобы утолить жажду: количество подходов за 10 мин наблюдения составило, соответственно, 12.8 ± 1.1, 13 ± 0.7 и 18 ± 0.8 (p < 0.05) (рис. 4). У животных, получивших соединение IE-1 и препарат сравнения фенотропил, поведение в данном тесте значимо не отличалось от такового у животных контрольной группы.

Рис. 4.

Количество наказуемых подходов к поилке в тесте “Конфликтная ситуация в варианте Vogel” (крысы линии Wistar). В группе “Контроль” n = 10, в опытных группах n = 8. * Различия достоверны относительно группы “Контроль” при p < 0.05 (критерий Данна).

Тесты “Принудительное плавание по Porsolt” и “Подвешивание мышей за хвост” (ПМХ). В обоих тестах (“Принудительное плавание по Porsolt” и “Подвешивание мышей за хвост”) время иммобилизации, характеризующее поведение отчаяния крыс и мышей, которым ввели соединение TIM-2, было значительно ниже относительно контрольных животных (на 86 и 35% в обоих тестах соответственно) и животных, которым ввели соединение IE-1 (на 90 и 52% соответственно), что было сопоставимо с действием референтного препарата флуоксетина (91 и 60% соответственно) (рис. 5а, 5б). Это указывает на выраженную антидепрессантную активность данных соединений.

Рис. 5.

Время иммобилизации в тесте “Принудительное плавание по Porsolt” (крысы линии Wistar) (а) и тесте “Подвешивание мышей за хвост” (мыши линии СВА) (б); продолжительность активного плавания в тесте Porsolt (в). В группе “Контроль” n = 10, в опытных группах n = 8. * Различия достоверны относительно группы “Контроль” при p < 0.05 (критерий Данна).

В тесте “Принудительное плавание по Porsolt” у крыс, которым вводили соединения IE-1 и, в меньшей степени, TIM-2, фенибут или флуоксетин продолжительность активного плавания была на 138, 65, 80 и 52% соответственно больше, чем у контрольных животных (рис. 5в).

Влияние исследуемых соединений на формирование и сохранение памятного следа в тестах “Условная реакция пассивного избегания” (УРПИ) и “Тест экстраполяционного избавления” (ТЭИ). Тесты УРПИ и ТЭИ принципиально отличаются по принятию решений ухода от воздействия негативных факторов. В тесте УРПИ животное в первом обучающем сеансе, при переходе из ярко освещенного отсека в темный (более комфортный для нее), получает электро-болевое раздражение через электродный пол, затем покидает темную камеру и остается до конца теста в светлом отсеке. При повторном тестировании (через 24 ч), если животное помнит о возможном электро-болевом раздражении в темной камере, то оно не заходит в нее и предпочитает оставаться в некомфортном ярко освещенном отсеке. Это указывает на то, что животное обучено.

В тесте ТЭИ животное помещается в цилиндр, который закреплен вертикально в центре емкости с водой и погружен в нее на 2 см. Температура воды составляет 17–18°C, что является сильной аверсивной средой, для избавления от которой крысе необходимо поднырнуть под край цилиндра и выбраться на сухую площадку. При первом сеансе животное затрачивает определенное время для экстраполяционного избавления. А при повторных сеансах животные, исходя из предыдущего опыта, находят выход значительно быстрее, а при последующих тестированиях уже реализуется выработанная стратегия поведения, и животные быстрее решают задачу экстраполяционного избавления. В нашем эксперименте, после обучения, животных тестировали через 24 ч и на 7-е сутки.

В тесте УРПИ у крыс, которым вводили адамантановые производные альфа-пирролидона, регистрировали быстрое (через 24 ч) и длительное (в течениe 7 сут) сохранение памятного следа (рис. 6а). Напротив, у животных, которым вводили диазепам, наблюдалось амнезирующее действие, что проявлялось и в формировании, и в сохранении памятного следа.

Рис. 6.

Время захода в темный отсек с электродным полом в тесте УРПИ (а); время решения задачи (подныривания) в тесте ТЭИ (б). Тесты проводили на крысах линии Wistar; в группе “Контроль” n = 10, в опытных группах n = 8. * Различия достоверны относительно группы “Контроль” при p < 0.05 (критерий Данна).

В условиях активного избегания аверсивной среды в тесте ТЭИ у крыс, которым вводили соединения TIM-2, ANR-10 или препарат сравнения фенибут, быстреe формировалось и в течениe 7 сут сохранялось наиболее рациональное поведение в условиях активного избавления от аверсивного фактора (воды низкой температуры) (рис. 6б). У животных, которым вводили диазепам в тесте ТЭИ, как и у животных контрольной группы, в аверсивных условиях наблюдалась наименее рациональная стратегия поведения. Сравнивая психотропные свойства соединения TIM-2 и препарата сравнения диазепама следует отметить, что диазепам существенно превосходит по анксиолитической активности адамантановое производное альфа-пирролидона, но последний обладает выраженным антидепрессантным и ноотропным действием.

Для уточнения возможного механизма действия соединения-лидера (TIM-2) на следующем этапе было проведено исследование его взаимодействия с рядом нейромедиаторных систем головного мозга на мышах линии СВА.

Взаимодействие исследуемых соединений с нейромедиаторными системами головного мозга. Для соединения TIM-2 было отмечено выраженное влияние на систему ГАМК: при введении коразола и пикротоксина (антагонистов ГАМК-А) у животных, которым вводили TIM-2, отмечалось значимое повышение латентного периода гибели по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Учитывая связь судорожного действия коразола и пикротоксина с подавлением тормозящей функции ГАМК, можно предположить, что выявленные психотропные свойства соединения TIM-2 обусловлены активацией ГАМКергической системы. В ходе дальнейшего исследования для соединения TIM-2 не было обнаружено взаимодействиe с дофаминергической (не влиял на продолжительность каталепсии при введении галоперидола и продолжительность вертикализации при введении апоморфина), холинергической (не влиял на продолжительность тремора после введения ареколина или никотина) и серотонинергической системами (не влиял на интенсивность гиперкинеза при введении 5-окситриптофана) (табл. 1).

Молекулярный докинг исследуемых соединений. Для объяснения действия синтезированных соединений на ГАМКeргическую систему проводили их докинг к рецептору ГАМК (4ms4 для активированного сайта связывания и 4mqf для дезактивированного сайта из базы данных RCSB) в программном обеспечении AutoDock Vina. Использованные модели белка содержали в качестве лигандов молекулу баклофена в структуре 4ms4 и саклофена в структуре 4mqf. Для оценки корректности процедуры докинга использовали оптимизированные модели баклофена и 2-гидроксисаклофена, в результате докинга которых расположение лигандов в сайте связывания белка, определенные методом рентгеноструктурного анализа (РСА), практически полностью воспроизводилось (рис. 7).

Рис. 7.

Расположение молекул баклофена в сайте связывания ГАМК-рецептора 4ms4 (а) и 2-гидроксисаклофена в сайте 4mqf (б), определенные экспериментально при помощи РСА-экспериментов (зеленые) и докинга (оранжевые).

Молекулярный докинг тестируемых соединений выявил достаточно близкие энергии связывания, однако набор аминокислотных остатков, обеспечивающих нахождение лиганда в активном центре рецептора, оказался различным (табл. 2).

Таблица 2.

Результаты молекулярного докинга соединений TIM-2, IE-1, ANR-10 и TIM-1, а также препаратов сравнения фенибута и 2-гидроксисаклофена

Формула	Энергия связывания 4ms4, ккал/моль	Связанные аминокислотные остатки	Энергия связывания 4mqf, ккал/моль	Связанные аминокислотные остатки
TIM-2	–6.2	Trp65 Trp278	–6.0	Trp65 Cys129 Ser130 Ser131
IE-1	–6.5	Trp65 His170 Tyr250 Trp278	–6.5	Trp65 Cys129 Ser130 Ser131 Ser153
ANR-10	–7.2	Trp65 Val201 Thr205 Tyr250 Trp278	–6.0	Trp278
TIM-1	–5.4	Thr199	–6.1	Ser153 Trp278
Фенибут	–8.4	Trp65 Ser130 Ser153 Gly151 Phe202 Tyr250 Ile276 Tyr279 Glu349	–5.8	Ser153 Ala173 His176 Val201 Leu248 Tyr250 Ile276
2-Гидроксисаклофен	–8.0	Trp65 Ser130 Ser153 Gly151 Phe202 Tyr250 Ile276 Trp278 Tyr279 Glu349	–5.5	Trp65 Ser130 Gly151 Ser153 Glu349

Данные молекулярного докинга позволяют утверждать, что препарат сравнения фенибут, соединения TIM-2, IE-1 и ANR-10 обладают похожим влиянием на рецептор, в то время как соединение TIM-1 не связывается с сайтом ГАМК-рецептора.

Анализ литературных данных позволил спрогнозировать высокую перспективность поиска среди адамантильных производных ГАМК и пирролидин-2-она соединений с выраженной психотропной и нейропротекторной активностью. Проведенное исследование подтвердило обоснованность поиска веществ с анксиолитической, антидепрессантной и ноотропной активностью в ряду производных ГАМК. В рамках настоящей работы среди исследованных производных было выявлено соединение с высокой анксиолитической активностью в сочетании с антидепрессантным и ноотропным действием, представляющее собой 1-(адамантан-1-ил)пирролидин-2-он (TIM-2). Анксиолитическая активность производного TIM-2 была выраженной как в условиях переменной стрессогенности (ПКЛ), так и в условиях конфликтной ситуации по Vogel и была сопоставима с таковой у референтного препарата фенибута и незначительно уступала таковой у сильного транквилизатора диазепама. Антидепрессантное действие соединения TIM-2 было сопоставимо по выраженности с флуоксетином из группы СИОЗС при оценке поведения отчаяния в условиях выученной беспомощности в двух тестах (“Принудительное плавание по Porsolt” и “Подвешивание мышей за хвост”). Ноотропная активность соединения TIM-2 была выявлена по положительному влиянию на процесс запоминания и воспроизведения обученного навыка в тестах УРПИ и ТЭИ. Для уточнения возможного механизма действия соединения-лидера было проведено исследование взаимодействия с рядом нейромедиаторных систем головного мозга in vivo, в ходе которого было выявлено выраженное влияние производного TIM-2 на ГАМКергическую систему (при введении коразола и пикротоксина), а данные молекулярного докинга также подтверждают возможное взаимодействие соединения TIM-2 с системой ГАМК.

Также было обнаружено соединение с психостимулирующей, антидепрессантной и умеренной анксиолитической активностью – 1-(3-гидроксиадамантан-1-ил)пирролидин-2-он (IE-1).

Введение адамантильного заместителя в 4-е положение пирролидона привело к получению вещества с низкой психотропной активностью (ANR-10). Каркасное соединение под лабораторным шифром TIM-1 ((3aS*,10aS*)-декагидро-4,8:6,10-диметаноциклононан[b]пиррол-2(1H)-он) также не проявляло психотропной активности во всех используемых поведенческих моделях.

Различное влияние соединений на ГАМК-систему, вероятно, вызвано их различным взаимодействием с ГАМК-рецептором. В статье [17] описано исследование методом РСА связывания ряда соединений с ГАМК-B-рецептором. Авторы пришли к заключению, что связывание лигандов данного рецептора осуществляется при помощи ряда взаимодействий с аминокислотными остатками серина 130 и 153, гистидина 170, глутаминовой кислоты 349. Однако наиболее значимыми оказались взаимодействия с остатками триптофана 65 и 278, поскольку именно они вызывают перестройку третичной структуры рецептора. Сравнение карт связывания тестируемых соединений (рис. 8) показывает, что соединения TIM-2, IE-1, ANR-10, фенибут и баклофен образуют контакты с ключевыми аминокислотами, в то время как TIM-1 не удерживается в сайте связывания ГАМК-рецептора и, по всей видимости, не оказывает влияния на ГАМКeргическую систему.

Рис. 8.

Карты связывания фенибута (а) и соединений TIM-2, IE-1, ANR-10 и TIM-1 в наложении (б), полученные при помощи молекулярного докинга к ГАМК-рецептору 4ms4.

Учитывая широкое распространение у населения тревожно-депрессивных расстройств, сочетающихся с дементными нарушениями, наличие у соединения TIM-2 антидепрессантной, анксиолитической и ноотропной активности может свидетельствовать о его терапевтическом потенциале. Было отмечено, что анксиолитическая активность соединения TIM-2, в отличие от диазепама, не сопровождается амнезирующим действием.

ЭКСПЕРИМЕНАТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты и оборудование. Строение соединений подтверждено данными ИК- и масс-спектров, а также одномерных и двумерных экспериментов ЯМР. ИК-спектры зарегистрированы на спектрометре Shimadzu IRAffinity-1 (Япония) с помощью приставки НПВО Specac DiamondATR GS 10800-B. Контроль за ходом реакции и проверку на индивидуальность соединений проводили с помощью ТСХ (пластинки Merck M60 F₂₅₄; проявление парами йода, УФ-облучением или разбавленной серной кислотой). Спектры ¹Н- и ¹³C-ЯМР, DEPT, HMBC, HMQC, NOESY зарегистрированы с использованием спектрометра JEOL JNM-ECX400 (Япония) в CDCl₃ и DMSO-d6. Внутренний стандарт – сигнал остаточного растворителя. Химические сдвиги сигналов определены в шкале δ, м.д., КССВ определены в Гц. Температуры плавления определены капиллярным методом на приборе SRS OptiMelt MPA100. Использовали коммерчески доступные реагенты (Sigma-Aldrich) и растворители (ООО “Реактив”). Очистку растворителей и реагентов проводили в соответствии с литературными методами [18]. Исходные соединения: этил-4-(2-этоксикарбонилметил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилат, этил-4-(цианометил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилат, 2-(5-(этоксикарбонил)-4-оксогомоадамантан-5-ил)уксусная кислота были получены в соответствии с методиками, представленными в работе [19].

1-(Адамант-1-ил)пирролидин-2-он (TIM-2). Раствор 5.00 г (0.023 моль) 1-бромадамантана в 15 мл (16.7 г, 0.197 моль) пирролидин-2-она нагревали в запаянной ампуле при 140°C в течение 20 ч, охлаждали, выливали в 100 мл ледяной воды. Выпавший осадок отфильтровывали, перекристаллизовывали из ацетона. Выход 4.16 г (82%). Серые кристаллы с т. пл. 98–99°C (лит. т. пл. 93°C [20]). ИК (НПВО) ν: 2906, 2848, 1660, 1406, 1259 см^–1. Спектр ¹Н-ЯМР: 1.55–1.67 (м, 6H, 2CH₂ + 2CH), 1.82 (псевдопентет, 2H, J = 7.5, CH₂), 2.00–2.12 (м, 9H, 4CH₂ + CH), 2.27 (т, 2H, ³J = 8.2, CH₂), 3.38 (т, 2H, ³J = 6.8, CH₂N). Спектр ¹³С-ЯМР: 18.2 (CH₂), 29.6 (3CH), 33.6 (2CH₂), 39.6 (4CH₂), 44.8 (2CH₂), 55.1 (C), 175.5 (C=O).

2-(5-Оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-ил)уксусная кислота. Метод 1. К раствору 1.00 г (3.11 ммоль) этил-4-(2-этоксикарбонилметил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилата или 1.00 г (3.63 ммоль) этил-4-(цианометил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилата в безводном THF (20 мл) добавляли NaNH₂ (98%, 5 экв.), затем выдерживали при ультразвуковом облучении в атмосфере аргона в течение 40 ч, растворитель отгоняли, остаток разбавляли 20 мл воды, полученный раствор промывали петролейным эфиром (2 × 5 мл), доводили до pH 3 с помощью 10 М HCl, полученную эмульсию экстрагировали CHCl₃ (5 × 3 мл), органические вытяжки объединяли, сушили над Na₂SO₄, растворитель отгоняли на роторном испарителе. Остаток очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (элюент – CHCl₃ : EtOH, 20 : 1), перекристаллизовывали из воды. Выход 0.33 (48%) из этил-4-(2-этоксикарбонилметил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилата или 1.00 г (3.63 ммоль) и 0.42 г (52%) из этил-4-(цианометил)-5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-карбоксилата, бесцветные кристаллы с т. пл. 118–120°С. ИК (НПВО) ν: 3100, 2906, 2852, 1724, 1660, 1444 см⁻¹. Спектр ¹Н-ЯМР: 1.40–1.43 (м, 2Н, 2СН^HomoAd), 1.53–1.61 (м, 3Н, 3СН^HomoAd), 1.73–1.90 (м, 7Н, 7СН^HomoAd), 1.97–2.02 (м, 1Н, СН^HomoAd), 2.04–2.12 (м, 1Н, СН^HomoAd), 2.57–2.65 (м, 2Н, СН₂COOH), 2.85–2.88 (м, 1Н, СН^HomoAd), 12.05 (с, 1H, ОН). Спектр ¹³С-ЯМР: 26.6 (CH), 26.7 (CH), 30.4 (СH₂), 31.0 (CH₂), 31.5 (СН), 34.4 (CH₂), 35.5 (CH₂), 36.4 (CH₂), 40.2 (CH₂), 48.0 (СН), 53.8 (CH), 174.3 (COOH), 216.5 (C=О).

Метод 2. Раствор 0.31 г (1.05 ммоль) 2-(5-(этоксикарбонил)-4-оксогомоадамантан-5-ил)уксусной кислоты в смеси 3 мл H₂SO₄ (3%) и 1 мл ледяной CH₃COOH нагревали при кипении в течение 50 ч, концентрировали с использованием роторного испарителя, остаток разбавляли 1 мл воды, оставляли кристаллизоваться. После выпадения осадка маточный раствор доводили до pH 3 с помощью NaHCO₃, экстрагировали CHCl₃ (2 × 5 мл), экстракт промывали водой (2 × 2 мл), сушили над Na₂SO₄, отгоняли растворитель, полученное масло кристаллизовали из воды, осадки объединяли. Выход 0.09 г (31%), бесцветные кристаллы с т. пл. 118–120°С.

(3aS*,10aS*)-Декагидро-4,8:6,10-диметаноциклононан[b]пиррол-2(1Н)-он (TIM-1). Раствор 1.00 г (4.50 ммоль) 2-(5-оксотрицикло[4.3.1.1^3,8]ундекан-4-ил)уксусной кислоты в 14 мл (15.82 г, 0.352 моль) формамида и 2.5 мл (3.05 г, 0.066 моль) муравьиной кислоты нагревали при 110°С в течение 20 ч. Далее реакционную смесь выливали в 20 мл воды, выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой. Очищали перекристаллизацией из ацетона. Выход 0.50 г (54%), бесцветные кристаллы с т. пл. 135–136°С. ИК-спектр, ν см^–1: 3400, 2900, 2845, 1658, 1448. Спектр ¹Н-ЯМР: 1.34–1.43 (м, 2Н, ${\text{СН}}_{2}^{{{\text{HomoAd}}}}$), 1.44–1.63 (м, 6Н, 2${\text{СН}}_{2}^{{{\text{HomoAd}}}}$, 2СН^HomoAd), 1.72–2.00 (м, 7Н, 2${\text{СН}}_{2}^{{{\text{HomoAd}}}}$, СН₂–С=О, СН^HomoAd), 2.33–2.52 (м, 1Н, СН^HomoAd), 2.60–2.70 (м, 1Н, СН–СН₂–С=О), 3.70–3.78 (д.д, 1Н, СН–NH, ³J = = 9.9, ³J = 4.4), 7.47 (с, 1Н, NН). Спектр ¹³С-ЯМР: 26.8 (СН), 26.9 (СН), 30.5 (СН₂), 31.3 (СН₂), 34.6 (СН₂), 35.3 (СН), 35.5 (СН), 36.6 (СН₂), 36.7 (СН₂), 38.6 (СH₂–С=О), 41.8 (СН), 62.6 (CH–NH), 176.1 (С=О).

Психотропная активность исследуемых соединений. Экспериментальное исследование психотропного действия каркасных производных альфа-пирролидона проведено на 158 крысах-самцах линии Wistar, массой 260–280 г (возраст 6 мес.) и 174 мышах-самцах линии СВА, массой 20–25 г (возраст 5 мес.). Животные содержались в условиях вивария (ГОСТ Р 51849-2001) со свободным доступом к питьевой воде и пище (ООО “Лабораторкорм”, Москва).

Соединения вводили в эквимолярных (1/20 от M_r) наиболее активных (по результатам предыдущих исследований) дозах перорально за 60 мин до выполнения поведенческих тестов (табл. 3). Препараты сравнения фенибут, фенотропил и флуоксетин вводили аналогичным образом, в дозах 20, 25 и 25 мг/кг соответственно. Препарат сравнения диазепам вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Влияние исследуемых соединений на психоэмоциональнoе состояние оценивали в тестах “Открытое поле” (ОП) и “Приподнятый крестообразный лабиринт” (ПКЛ). Анксиолитическую активность оценивали в тесте “Конфликтная ситуация в варианте Vogel”. Антидепрессантное действие изучали в тестах “Принудительное плавание по Porsolt” и “Подвешивание мышей за хвост” (ПМХ). Когнитивную функцию определяли в тестах формирования условнoй реакции пассивного избегания (УРПИ) и тесте экстраполяционного избавления (ТЭИ) [21–23].

Для уточнения возможного механизма действия соединения-лидера было проведено исследование его взаимодействия с рядом нейромедиаторных систем головного мозга in vivo (исследуемое соединение вводили за 1 ч до введения анализаторов). Взаимодействие с системой ГАМК оценивали по антагонизму с судорожной активностью коразола (80 мг/кг) и пикротоксина (3 мг/кг) (наблюдение продолжали в течение часа). Для оценки взаимодействия с дофаминергической системой было изучено влияние на продолжительность каталепсии, вызванной введением галоперидола (1 мг/кг, внутрибрюшинно) (наблюдение продолжали в течение 2 мин). После введения апоморфина (3 мг/кг, подкожно) регистрировали продолжительность вертикализации мышей, которую оценивали в течение часа после введения апоморфина. Влияние на холинергическую систему оценивали по продолжительности тремора, вызванного введением никотина (0.2 мг/кг, подкожно) и ареколина (25 мг/кг, подкожно) при наблюдении в течениe 60 мин. Взаимодействие с серотонинергической системой оценивали по выраженности гиперкинеза (количеству кивательных движений) в течение 60 мин после введения 5-окситриптофана (300 мг/кг, внутрибрюшинно) [22].

Статистическую обработку данных проводили в MS Excel 2019 и Prism 6, сравнение осуществляли по критериям Краскела–Уоллиса и Данна. Данные представлены в виде среднего значения ± ошибка среднего.

Молекулярный докинг. Молекулярный докинг проводили на модели рецептора ГАМК (код 4ms4 для сайта агонистов и 4mqf для сайта антагонистов, база PDB RCSB). Предварительно из модели удаляли имеющиеся лиганды и молекулы воды и добавляли полярные атомы водорода. Структуры баклофена, саклофена, TIM-2, IE-1, ANR-10 и TIM-1 оптимизировали при помощи молекулярной механики в силовом поле MMFF94s с применением программного пакета Avogadro 1.2.0 и использовали для докинга при помощи программного пакета AutoDock Vina. Результаты молекулярного докинга анализировали и визуализировали при помощи программы Discovery Studio 2019.

Таблица 3.

Исследуемые каркасные производные альфа-пирролидона

№	Структура	Mr	Химическое название	Доза, мг/кг
1		219	TIM 2 1-(адамантан-1-ил)пирролидин-2-он	11
2		235	IE-1 1-(3-гидроксиадамантан-1-ил)пирролидин-2-он	12
3		219	ANR-10 4-(адамант-1-ил)пирролидин-2-он	11
4		205	TIM-1 (3aS*,10aS*)-декагидро-4,8:6,10-диметаноциклононан[b]пиррол-2(1H)-он	10

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые получены новые производные пирролидин-2-она, содержащие структурные фрагменты адамантана и гомоадамантана, и изучены их психотропные свойства на крысах линии Wistar и мышах линии CBA.

Присоединение адамантана в 1-м положении цикла альфа-пирролидона (TIM-2) приводит к появлению у полученного соединения выраженной антидепрессантной активности в условиях поведения отчаяния (ПМХ и Porsolt), выраженной анксиолитической активности в условиях переменной стрессогенности (ПКЛ) и в условиях конфликтной ситуации (Vogel), а также ноотропной активности (ускорение решения задачи в стрессовой ситуации и при повторных тестированиях – ТЭИ).

Наличие 3-гидрокси-1-адамантильного фрагмента в 1-м положении цикла альфа-пирролидона (IE-1) приводит к появлению у полученного соединения психостимулирующей (в условиях теста “Открытое поле”), выраженной антидепрессантной активности в условиях поведения отчаяния (ПМХ и Porsolt) и анксиолитической активности в условиях переменной стрессогенности (ПКЛ).

Возможный механизм психотропного действия производного альфа-пирролидона с 1-адамантильным заместителем в 1-м положении (TIM-2) – взаимодействие с системой ГАМК, поскольку при введении коразола и пикротоксина (антагонистов ГАМК-А) у животных, получивших TIM-2, отмечалось значимое повышение латентного периода гибели.

Выявленное соединение TIM-2 представляет интерес для дальнейших исследований с целью разработки на его основе средства для коррекции тревожных и депрессивных расстройств.