1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 47, № 6, 2021

Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 6, стр. 837-840

Интеркалированные мотивы ДНК с ненуклеозидными вставками

Н. А. Петрунина 1, В. В. Лебедев 2, Ю. Г. Кириллова 2, А. В. Аралов 3, А. М. Варижук 1, М. В. Сардушкин 4, *

1 ФГАOУ ВО Московский физико-технический институт (Национальный исследовательский университет)
141701 Долгопрудный, Московская область, Институтский пер., 9, Россия

2 ФГБОУ ВО МИРЭА – Российский технологический университет, Институт тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова
119571 Москва, просп. Вернадского, 86, Россия

3 ФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАН
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия

4 ФГБОУ ВО Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева
125047 Москва, Миусская площадь, 9, Россия

* E-mail: s_makar@mail.ru

Поступила в редакцию 31.03.2021
После доработки 10.04.2021
Принята к публикации 15.04.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследована цитозин-богатая последовательность из генома человека, предположительно участвующая в регуляции экспрессии гена SHANK1 за счет формирования интеркалированного мотива (iM). Показано, что модификация, имитирующая отщепление гетероциклических оснований в петлях iM, существенно ускоряет конформационные переходы, индуцированные малыми изменениями рН. Эти результаты дополняют представления о связи репарации ДНК и формирования неклассических вторичных структур, а также открывают новые возможности в разработке олигонуклеотидных рН-сенсоров с быстрым откликом.

Ключевые слова: модификация ДНК, интеркалированные мотивы, кинетика

ВВЕДЕНИЕ

В промоторах ряда генов, включая гены семейства SHANK, не так давно были обнаружены С-богатые последовательности, которые формируют устойчивые С-квадруплексные структуры – интеркалированные мотивы (iM) [1–3]. Поскольку для образования ядра iM, представляющего собой параллельные дуплексы с гемипротонированными цитозиновыми парами, необходимо протонирование атома N3 остатков цитозина, большинство структур данного типа существует исключительно в слабокислой среде [4]. Однако последовательности общей формулы C5+NxC5+NyC5+Nz, где Nx/у/z – петли между С-блоками, могут образовывать стабильные iM и в нейтральной среде [2]. Теоретически iM, имеющие точку перехода (рН1/2 – значение рН, при котором половина молекул структурирована) около 7 и отличающиеся высокой кооперативностью складывания/расплетания, чувствительны к малейшим изменениям рН в ядре; их можно назвать встроенными в геном рН-сенсорами. Поскольку промоторные iM рассматриваются как вероятные участники регуляции транскрипции [5, 6], их исследование актуально для прояснения связи изменений генной экспрессии с дисбалансом рН при нейродегенерации или онкотрансформации [7].

Целью данной работы была оценка влияния модификации на рН-чувствительность и кинетические параметры iM на примере С-богатого олигонуклеотида SHA из промотора гена SHANK1, ассоциированного с нейродегенерацией и нейропластичностью.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Была рассмотрена модификация iM из промотора гена SHANK1, которая имитирует апуринизацию/эксцизию азотистых оснований в петлях iM (рис. 1а). Модификация представляет собой замену нуклеозидных остатков остатком 1',2'-дидезоксирибозы (далее – X). Анализ рН-чувствительности iM (SHA) и его аналогов (SHA-1–SHA-3) выполняли методом флуориметрии. Для этого по 3'- и 5'-концам олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) вводили флуоресцентные метки – остатки 5,6-карбокситетраметилродамина (TAMRA) и 6‑карбоксифлуоресцеина (FAM) соответственно. В сложенном iM наблюдали FRET-эффект за счет сближения FAM и TAMRA. При этом флуоресценция обеих меток частично гасилась в составе iM за счет стекинг-взаимодействий флуорофоров с гемипротонированными цитозиновыми парами, и данный эффект тушения доминировал. Собственная рН-зависимость флуоресценции метки была незначительна на фоне тушения в iM. Разрушение iM при переходе от рН 6 к рН 8 сопровождалось увеличением интенсивности флуоресценции, и по полученным кривым методом регрессионного анализа определяли рН1/2 (рис. 1б). Как видно из данных табл. 1, модификации в одной, двух или трех петлях практически не оказывали влияния на рН1/2. Таким образом, удаление гетероциклических оснований в петлях не препятствует формированию iM при физиологических значениях рН.

Рис. 1.

рН-чувствительность и кинетика формирования/расплетения интеркалированного мотива (iM) SHA из промотора гена SHANK1 и его аналогов (SHA-1–SHA-3). (а) – Схематическое представление iM и формирующих ядро гемипротонированных цитозиновых пар (слева), а также модификация, вводимая в петли iM – остаток 1',2'-дидезоксирибозы (справа); (б) – кривые рН-зависимости iM, полученные при регистрации флуоресценции FAM (черный) и TAMRA (красный); (в) – кинетические кривые расплетания (pH 6.6→7.2) и формирования (pH 7.2→6.6) iM, полученные путем регистрации изменений флуоресценции FAM при скачках рН.

Таблица 1.

Последовательности iM-образующих олигодезоксирибонуклеотидов, рН перехода и кинетические характеристики

Шифр Последовательность, 5'→3'* pH½ ± 0.1 Kнабл_pH 7.2→6.6, с–1** T½_pH 7.2→6.6, с
SHA d(CCCCCCTCCCCCC ACCCCCCACCCCC) 7.0 0.065 ± 0.001 (эксп. 1: 54 ± 3%)
0.38 ± 0.02 (эксп. 2: 46 ± 3%) 		4.2 ± 0.2
SHA-1 d(CCCCCCTCCCCCC XCCCCCCACCCCC) 7.1 0.65 ± 0.02 (эксп. 1: 53 ± 3%)
0.093 ± 0.002 (эксп. 2: 47 ± 3%) 		2.3 ± 0.1
SHA-2 d(CCCCCCXCCCCCC ACCCCCCXCCCCC) 7.1 0.065 ± 0.001(эксп. 1: 66 ± 10%)
0.12 ± 0.01 (эксп. 2: 54 ± 10%) 		1.5 ± 0.1
SHA-3 d(CCCCCCXCCCCCC XCCCCCCXCCCCC) 7.1 1.16 ± 0.001 (эксп. 1: 68 ± 3%)
0.153 ± 0.004 (эксп. 2: 32 ± 3%) 		1.0 ± 0.1

* X – остаток 1',2'-дидезоксирибозы. ** Поскольку кинетические кривые представляют собой биэкспоненты, для каждого iM приведены два значения Kнабл, соответствующие двум экспонентам (эксп. 1 и эксп. 2). Относительные вклады этих экспонент (в процентах) приведены в скобках. Средние значения и погрешности рассчитаны по трем повторностям.

Для оценки влияния модификации на кинетику конформационных переходов оцОДН–iM при изменении рН использовали метод остановленного потока. Кинетические кривые изменения флуоресценции FAM в ответ на скачки рН 6.6↔7.2 (рис. 1в) имели вид биэкспонент, что можно объяснить наличием двух изоформ iM: 5'E (в образовании наружной цитозиновой пары принимает участие 5'-концевой цитозин) и 3'E (наружная пара содержит 3'-концевой цитозин). Модификация iM не меняла кинетику отклика на скачок рН 6.6→7.2, но заметно увеличивала наблюдаемые константы скорости обратных процессов (соответственно, сокращалось время сворачивания iM – T1/2_pH 7.2→6.6). Мы предполагаем, что данный эффект обусловлен стерическим фактором. Эффект нарастал при переходе от единичной модификации к модификации всех петель. Сходного результата можно ожидать при эксцизии гетероциклических оснований в возможных сайтах образования iM геномной ДНК.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

С-богатая последовательность SHA из промотора гена SNAHK1 (Gene ID: 50944) была выбрана как пример последовательности, формирующей термодинамически устойчивый iM в условиях, близких к физиологическим [1]. Природный ОДН SHA и его модифицированные аналоги SHA-1–SHA-3 получали твердофазным методом на автоматическом синтезаторе MerMade 6/12 DNA Synthesizer (BioAutomation, Германия) с использованием стандартных коммерческих реагентов, а также фосфорамидита d-spacer для введения остатка 1',2'-дидезоксирибозы (Glen Research, США), фосфорамидита FAM-производного (5'‑концевое мечение ОДН) и модифицирующей смолы Алкин СPG для 3'-концевого мечения (Lumiprobe, Россия). Мечение по 3'-концу остатком TAMRA с аминопропильным линкером осуществляли методом клик-химии с использованием соответствующего азида (Lumiprobe, Россия). ОДН выделяли хроматографически (чистота не менее 95% по данным ВЭЖХ), структуру и чистоту подтверждали методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии.

Для получения кривой рН-зависимости получали растворы ОДН (2 мкМ) в 140 мМ калий-фосфатном буфере заданного рН. Спектры флуоресценции FAM/TAMRA при возбуждении 490/560 нм регистрировали на флуоресцентном ридере Infinite 200 Pro (Tecan, Швеция) при комнатной температуре. Экспериментальную зависимость значения флуоресценции от рН аппроксимировали моделью Хилла, рН1/2 определяли методом регрессионного анализа. Для получения кинетических кривых регистрировали изменения флуоресценции FAМ после изменения значения рН буферного раствора на спектрофотометре Chirascan (Applied Photophysics, Великобритания), оборудованном модулем остановленного потока, при возбуждении 490 нм с применением фильтра 515 нм. Для определения наблюдаемых констант скорости конформационного перехода экспериментальные кривые аппроксимировали биэкспонентами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследовано влияние модификации, имитирующей отщепление гетероциклических оснований в петлях iM, на кинетические характеристики и рН-зависимость iM на примере фрагмента промотора гена SHANK1. Показано, что модификация существенно ускоряет конформационные переходы, индуцированные малыми изменениями рН. Полученные данные позволяют предположить, что повреждающие ДНК агенты и работа системы репарации облегчают формирование неканонических структур в С-богатых участках. Вторым важным следствием представленных результатов является возможность оптимизации кинетических параметров оптических рН-сенсоров на основе iM: введение остатков дидезоксирибозы в петли позволяет уменьшить время отклика сенсоров, что значимо для исследования протонных токов в клетке. Предложенная модификация может использоваться для получения сенсоров на основе iM, пригодных для исследования быстрых рН-зависимых процессов в клетке.

Список литературы

  1. Wright E.P., Huppert J.L., Waller Z.A.E. // Nucleic Acids Res. 2017. V. 45. P. 2951–2959. https://doi.org/10.1093/nar/gkx090

  2. Mir B., Serrano I., Buitrago D., Orozco M., Escaja N., Gonzalez C. // J. Am. Chem. Soc. 2017. V. 139. P. 13985–13988. https://doi.org/10.1021/jacs.7b07383

  3. Turaev A., Isaakova E., Severov V., Bogomazova A., Zatsepin T., Sardushkin M., Aralov A., Lagarkova M., Pozmogova G., Varizhuk A. // Biosensors & Bioelectronics. 2021. V. 175. P. 112864. https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112864

  4. Abou Assi H., Garavis M., Gonzalez C., Damha M.J. // Nucleic Acids Res. 2018. V. 46. P. 8038–8056. https://doi.org/10.1093/nar/gky73

  5. Miglietta G., Cogoi S., Pedersen E., Xodo L. // Sci. Rep. 2016. V. 5. P. 18097. https://doi.org/10.1038/srep18097

  6. Niu K., Zhang X., Deng H., Wu F., Ren Y., Xiang H., Zheng S., Liu L., Huang L., Zeng B., Li S., Xia Q., Song Q., Palli S.R., Feng Q. // Nucleic Acids Res. 2018. V. 46. P. 1710–1723. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1207

  7. Majdi A., Mahmoudi J., Sadigh-Eteghad S., Golzari S.E.J., Sabermarouf B., Reyhani-Rad S. // J. Neurosci. Res. 2016. V. 94. P. 879–887. https://doi.org/10.1002/jnr.23757

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал