Неорганические материалы, 2023, T. 59, № 3, стр. 341-348

ВВЕДЕНИЕ

Синтетический гидроксиапатит (ГА, Са₁₀(РО₄)₆(ОН)₂) в определенной степени подобен минеральному веществу костных тканей человека. В этой связи он достаточно долгое время считался наиболее подходящим компонентом материалов для остеопластики. Однако необходимость корректировки малой скорости его растворения обусловливает перспективность создания композитов на основе апатита и более резорбируемых веществ. С этой точки зрения активно изучаются смеси ГА и волластонита (ВТ, β-СаSiO₃). Разрабатываются подходы к синтезу названных композитов [1–7], исследуются их свойства, в т. ч. растворимость в модельных жидкостях [3, 7–11] как одна из важнейших характеристик, обеспечивающих возможность постепенной деградации имплантата и его замены нативной костной тканью.

Наиболее часто эксперименты по резорбции материалов проводят с использованием синтетической биологической жидкости [7–11] (simulated body fluid, SBF [12]) и трис-буфера с рН 7.4, близким к кислотности плазмы крови человека [3, 7]. В первом случае, как правило, совместно с растворением компонентов матриксов быстро запускаются процессы осаждения на их поверхностях фосфатов кальция (ФК). Так, в статье [7] сообщается, что керамики, содержащие более 30 мас. % ВТ (остальное – ГА), уже через 1 сут контакта с SBF полностью покрываются плотным слоем апатита, который экранирует основной объем материала от окружающей среды и тормозит растворение его компонентов. Таким образом, для изучения растворимости и динамики деградации материалов в качестве модельной жидкости предпочтительно использование трис-буфера, изначально не содержащего осадкообразующих ионов и веществ.

Также стоит отметить, что в экспериментах по резорбции композитов ГА и ВТ, как правило, используют плотные прессовки или пористые матриксы в виде дисков, пластин, блоков, цилиндров. Подобные объемные структуры не всегда удобны для клинического применения и имплантации в место костного дефекта. Гораздо более универсальны гранулированные материалы, которыми могут быть заполнены полости различных форм и размеров.

Ранее авторами настоящей статьи разработан одностадийный способ получения порошковых композитов с варьируемым содержанием ГА и ВТ (Патент РФ № 2657817) и установлены условия формования из них сферических гранул [13].

Цель данной работы – сравнительное исследование динамики резорбции в трис-буфере гранулированных материалов с различным соотношением Са₁₀(РО₄)₆(ОН)₂ и β-СаSiO₃, со связующим биополимером желатином.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Гранулы для исследования получали по суспензионной технологии [13, 14] из синтетических керамических порошков, содержащих от 0 до 100 мас. % ГА в смеси с ВТ, и водного раствора желатина (марка П-11, РусХим). Макроскопически опытные образцы представляли собой набор сфер белого цвета с диаметром до 5 мм (преобладающая фракция с размерами 1–2 мм) и микротвердостью не менее 17 МПа (табл. 1). Они содержали до 20 мас. % желатина. Остальное приходится на минеральные компоненты (ГА и ВТ), смешанные в различных пропорциях. Гранулы имели шероховатую поверхность и пористость около 50% (рис. 1, табл. 1).

Рис. 1.

Микрофотографии внешней поверхности (а, б) и внутренней структуры (в) гранул с пропорцией ГА/ВТ 40/60.

Набухание гранул оценивали при выдерживании 0.2 г образца заданного состава в 3 мл трис-буфера при комнатной температуре в статичных условиях. После истечения заданного времени (от 5 мин до 3 сут) и удаления жидкой фазы измеряли массу образцов. Степень набухания (S) рассчитывали по формуле: S = [(S_τ– S₀)/S₀] × 100%, где S₀ и S_τ – масса гранул до начала эксперимента и через время τ соответственно [15]. Изменение формы и размеров частиц в результате набухания контролировали на микроскопе “Микромед 3 (вар. 3-20М)” (Наблюдательные приборы), используя программу ToupView для обработки изображений.

Для изучения динамики резорбции в трис-буфере отбирали фракцию гранул с диаметрами 1–2 мм. Исследования выполняли при соотношении твердое : жидкое = 1 : 50 г/мл, при комнатной температуре в статичных условиях, в трехкратной повторности. В заданные периоды времени (от 1 до 28 сут) отбирали аликвоты жидкой фазы для определения концентраций ионов Са²⁺, ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}$ и ${\text{SiО}}_{3}^{{2 - }}.$ С целью обеспечения постоянства объема в изучаемую систему добавляли порцию свежего трис-буфера, по объему равную его части, взятой на анализ. По окончании эксперимента гранулы отфильтровывали, промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Нерастворившуюся часть образцов взвешивали, рассчитывали потерю массы и исследовали физико-химическими методами.

Концентрации ионов Са²⁺, ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}$ и ${\text{SiО}}_{3}^{{2 - }}$ в изучаемых растворах определяли по спектрофотометрическим методикам: кальций – по реакции с Арсеназо III в щелочной среде, фосфаты – УФ-методом по образованию в кислой среде фосфорно-молибденового комплекса, силикаты – по желтой форме молибдокремниевой кислоты [16]. Результаты анализов статистически обрабатывали с применением критерия Стьюдента.

Рентгенофазовый анализ (РФА) выполняли на дифрактометре XRD-7000 (Shimadzu). Расшифровку дифрактограмм проводили в программном комплексе Sleve+ с использованием базы данных ICCD PDF-4+ 2022 г. ИК-спектры поглощения гранул регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре ФТ-801 (Simex) с помощью программы ZаIR 3.5 (Simex). Образцы готовили прессованием в таблетки с KBr. ИК-спектры записывали в области от 4000 до 500 см^–1. Термогравиметрический анализ (ТГА) проводили на синхронном термическом анализаторе STA-449C (NETZSCH). Образцы прокаливали на воздухе со скоростью нагрева 10°C/мин. По данным ТГА рассчитывали содержание желатина в исходных образцах и нерастворившейся части материалов. Морфологию гранул изучали методом сканирующей электронной микроскопии на электронном микроскопе JCM-5700 (JEOL).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При выдерживании гранул в трис-буфере происходит их набухание, масса материалов увеличивается во времени (рис. 2а). Наибольший прирост происходит в первый час контакта частей системы. Очевидно, это связано с заполнением жидкой фазой пор во внутренней структуре частиц и набуханием желатина. Подтверждением этому служат образование воздушных пузырьков на поверхности сфер, а также наблюдаемое при микроскопическом исследовании увеличение их размеров (до 20%). Степень набухания (S) коррелирует с содержанием желатина в материалах (табл. 1) и для всех образцов через 7 ч слабо изменяется. Вероятно, в данный период завершается формирование на поверхности гранул гидратированного слоя и запускаются процессы ионного обмена между твердой фазой и раствором. Об этом свидетельствует появление в системах ионов Са²⁺, ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}$ и ${\text{SiО}}_{3}^{{2 - }}$ (рис. 2б–2г). Их концентрации увеличиваются в течение первых 3–7 сут контакта образцов со средой. Далее измеряемая величина либо выходит на плато, либо монотонно уменьшается.

Рис. 2.

Зависимости степени набухания (а), концентраций ионов кальция (б), силикат-ионов (в) и фосфат-ионов (г) от времени выдерживания в трис-буфере гранул с различной пропорцией ГА/ВТ.

Из рис. 2 видно, что текущие концентрации Са²⁺ значительно превышают количества анионов. Это может быть связано с тем, что, согласно представлениям о химизме деградации фосфатов и силикатов кальция в водных средах [17, 18], ионы кальция первыми выделяются в раствор при гидратации поверхности солей. Кроме того, растворяясь, β-СаSiO₃ и Са₁₀(РО₄)₆(ОН)₂ одновременно выступают в качестве источника кальция. На бо́льшую скорость резорбции ВТ указывают более высокие концентрации ионов ${\text{SiО}}_{3}^{{2 - }}$ в системах по сравнению с ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}$ (рис. 2в, 2г). Это в свою очередь обусловлено большей растворимостью фазы β-СаSiO₃ (ПР = 2.5 × 10^–8 [19], s = 1.6 × 10^–4 моль/л) относительно апатита (ПР = 1.58 × 10^–117 [20], s = 4.6 × × 10^–8 моль/л).

Текущие концентрации кальция в растворах возрастают по мере повышения содержания ВТ в образцах (рис. 2б). Минимальные количества Са²⁺ зафиксированы в системе с гранулами из ГА, максимальные – с материалами из ВТ. В растворах с композитами обнаруживаются промежуточные количества ионов металла, однако они увеличиваются неравномерно. Наибольший рост концентрации кальция в системах наблюдается при повышении доли ВТ с 20 до 40 мас. % (ΔС_Са ≈ 4 мМ). Чуть меньший разрыв (ΔС_Са ≈ 3 мМ) отмечается между кривыми С(Са²⁺) = f(τ), полученными для гранул с пропорцией ГА/ВТ 20/80 и 0/100, при τ = 7 сут. Далее он сокращается за счет снижения концентрации ионов металла в системе с образцом из β-СаSiO₃, что может происходить в результате обратной сорбции Са²⁺ поверхностным гидратированным слоем.

В случае силикатов наименьшие концентрации ионов обнаруживаются в растворах, контактировавших с гранулами с пропорцией ГА/ВТ 80/20, наибольшие – с материалами из ВТ (рис. 2в). При повышении доли β-СаSiO₃ в образце количества анионов в системах изменяются немонотонно. Так, в средах с композитом ГА/ВТ 20/80 силикат-ионов меньше, чем в случае соотношений 60/40 и 40/60. Вероятно, это связано с быстрым ионным обменом и гидратацией богатого ВТ материала с образованием на его поверхности слоя силикагеля [18], который затрудняет дальнейшее активное растворение минеральных компонентов гранул.

Фосфат-ионы в количестве до 313 и 214 мкМ обнаруживаются в системах с гранулами из ГА и его композитом с 20 мас. % ВТ соответственно (рис. 2г). При достижении данных значений концентрация ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}$ снижается, очевидно, в результате начала осаждения аморфного ФК. Данное предположение подтверждается слабым ниспадающим трендом зависимостей С(Са²⁺) = f(τ), полученных для растворов, контактировавших с апатитсодержащими образцами, при τ > 7 суток (рис. 2б). По-видимому, значительного уменьшения содержания катионов в системах не происходит из-за продолжающейся резорбции ВТ. Зависимости $С\left( {{\text{РО}}_{4}^{{3 - }}} \right)$ = f(τ), полученные для композитов с пропорциями ГА/ВТ 60/40, 40/60 и 20/80, фактически идентичны. Они также проходят через максимум, не превышающий 40 мкМ ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }},$ и к 10 сут выходят на плато при $С\left( {{\text{РО}}_{4}^{{3 - }}} \right)$ = 10 мкМ.

Таким образом, установленные изменения состава растворов указывают на то, что все исследуемые материалы при контакте с трис-буфером быстро гидратируются и постепенно растворяются, выделяя в раствор Са²⁺, ${\text{SiО}}_{3}^{{2 - }}$ и ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}.$ Более высокие текущие концентрации силикат-ионов в системах (относительно фосфатов) свидетельствуют о большей скорости резорбции ВТ в сравнении с апатитом. Снижение количества ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}$ со временем происходит, вероятно, в результате осаждения аморфного ФК. Также отмечено, что композиты с пропорцией ГА/ВТ 60/40, 40/60 и 20/80 при выдерживании в трис-буфере ведут себя схожим образом, демонстрируя близкие значения текущих концентраций Са²⁺, ${\text{SiО}}_{3}^{{2 - }}$ и ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}.$

Установлено, что в ходе эксперимента гранулы теряют до 30% массы (рис. 3). В сравнении с материалами из чистых веществ композиты на основе ГА и ВТ растворяются в большей степени. Для них зафиксированы бо́льшие потери массы за счет как растворения желатина, так и резорбции минеральных компонентов.

Рис. 3.

Зависимости общей убыли массы гранул в процессе их выдерживания в трис-буфере (1) и содержания в них желатина (2) от доли ГА.

Сделанное ранее предположение о более активной резорбции ВТ подтверждается данными РФА. При сравнении дифрактограмм исходных гранул и извлеченных из трис-буфера через 28 сут заметно уменьшение интенсивности пиков β-СаSiO₃ (рис. 4), тогда как рефлексы ГА фактически не изменяются. Меньшую высоту имеет и пологий пик в области 20°–27°, вероятно, указывающий на присутствие в составе материалов аморфной фазы желатина.

Рис. 4.

Дифрактограммы гранул с пропорцией ГА/ВТ 40/60 до (1) и после выдерживания в трис-буфере (2); звездочками отмечены пики ВТ, снижение интенсивности которых наблюдается в эксперименте.

О снижении содержания органического компонента в гранулах в процессе их выдерживания в трис-буфере однозначно свидетельствуют результаты исследования методом ИК-Фурье-спектроскопии (рис. 5). Так, в спектрах исходных образцов проявляются интенсивные полосы в области 1240–1450 см^–1, вызванные колебаниями карбоксильных группировок в желатине I типа; максимум при 1550 см^–1, отвечающий деформационным колебаниям связей N–H в амиде II; и пик при 1650 см^–1, вызванный деформационными колебаниями связей N–H и валентными колебаниями связей С=О и О–Н [21]. В спектрах нерастворившейся части гранул названные полосы поглощения значительно менее выражены.

Рис. 5.

ИК-спектры гранул с пропорцией ГА/ВТ 60/40 (а), 20/80 (б) до (1) и после (2) выдерживания в трис-буфере.

В результате удаления желатина из состава материалов их микроструктура становится более пористой (рис. 6). На поверхности гранул появляется множество выступов, углублений и пор различных размеров. Просматриваются границы отдельных керамических частиц, которые в исходных образцах сглажены покрывающим их слоем полимера (рис. 1б).

Рис. 6.

Микрофотографии гранул (а) и их поверхности (б) после выдерживания в трис-буфере.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам исследования динамики резорбции в трис-буфере гранул на основе ГА, ВТ и желатина установлено, что в первые часы контакта твердой и жидкой фаз активно протекают гидратация поверхности материалов и набухание органической составляющей. В результате частицы увеличиваются в размерах до 20%. Далее запускаются процессы ионного обмена и в раствор переходят ионы кальция, фосфаты и силикаты из состава минеральных компонентов образцов. По данным химического анализа и РФА, β-СаSiO₃ деградирует активнее Са₁₀(РО₄)₆(ОН)₂. В период эксперимента все материалы теряют до 80% исходного количества желатина. Для композитов зафиксированы бо́льшие потери массы за счет как растворения органической составляющей, так и резорбции минеральных компонентов по сравнению с образцами из ГА или ВТ. При этом гранулы с пропорциями ГА/ВТ 60/40, 40/60 и 20/80 при выдерживании в трис-буфере ведут себя схожим образом, демонстрируя близкие значения концентраций Са²⁺, ${\text{SiО}}_{3}^{{2 - }}$ и ${\text{РО}}_{4}^{{3 - }}.$

Полученные экспериментальные данные указывают на возможность постепенной деградации гранул на основе ГА, ВТ и желатина с последующей заменой нативной костной тканью и, следовательно, перспективность их применения в качестве остеопластических материалов.