Журнал аналитической химии, 2019, T. 74, № 6, стр. 455-463

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы, материалы, оборудование. В качестве стандартных образцов использовали хлорамфеникол (99.9%, Sigma-Aldrich, Германия) и хлорамфеникол-D₅ (99.8%, Sigma-Aldrich, Швейцария). Использовали ацетонитрил и метанол для ВЭЖХ (≥99.9%, Sigma-Aldrich, Германия); н-гексан и ацетон для ВЭЖХ (≥99.9%, Panreac, Испания); этилацетат для ВЭЖХ (≥99.9%, Fisher Chemical, Германия); хлороформ х. ч. и н-бутанол ч. д. а. (ЗАО “База № 1 Химреактивов”, Россия); муравьиную кислоту (98%, Acros Organics, Бельгия); формиат аммония (99%, Acros Organics, Бельгия); ацетат аммония (≥97%, Carl Roth, Германия); аммиак водный ос. ч. (Сигма Тек, Россия); сульфат аммония х. ч. (ЗАО “ВЕКТОН”, Россия). Деионированную воду получали с помощью системы очистки воды Easy pure II RF/UV (Thermo Scientific, США). Условия хроматографирования оптимизировали на колонке длиной 150 мм, внутренним диаметром 2.1 мм и с зернением сорбента 3.5 мкм Zorbax SB C₁₈ (Agilent Technologies, США). Твердофазную экстракцию (ТФЭ) проводили на патронах SampliQ OPT (60 мг, 3 мл, Agilent Technologies, США). Пробы перед анализом методом ВЭЖХ–МС/МС фильтровали с помощью мембранных шприцевых фильтров из регенерированной целлюлозы (13 мм, 0.2 мкм, Agilent Technologies, Китай). Использовали центрифугу охлаждаемую 3–18 K (Sigma, Германия), электровстряхиватели Multi Reax и Reax Control (Heidolph, Германия), испаритель аналитический ZipVap 20 (Glas-Col, США). Для количественного определения использовали жидкостный хроматограф Agilent 1200 с масс-спектрометрическим детектором Agilent 6410 (Agilent Technologies, Германия).

Экстракция хлорамфеникола. В градуированные пробирки емк. 15.0 мл вводили по 5 мл водного раствора хлорамфеникола с концентрацией 4.0 нг/мл и по 5 мл органического экстрагента. Содержимое пробирок взбалтывали в течение 4 мин, оставляли в покое на 10 мин до достижения межфазного равновесия и разделения фаз. Измеряли объемы равновесных фаз и рассчитывали их соотношение: соотношение объемов равновесных фаз могло изменяться относительно исходных вследствие взаимной растворимости. Затем органический слой переносили в полипропиленовые пробирки, помещали пробирки в нагревательный модуль и упаривали растворитель в токе воздуха: н-бутанол при 55°С, этилацетат и н-гексан при 45°С, хлороформ и смесь хлороформ–ацетон (2 : 1) при 35°С. Сухой остаток растворяли в деионированной воде в объеме, равном равновесному объему органической фазы.

Содержание хлорамфеникола в полученных растворах определяли методом ВЭЖХ–МС/МС. Значения коэффициентов распределения D и степени извлечения R антибиотика рассчитывали по формулам (n = 3):

где [ХАФ]_орг и [ХАФ]_вод – равновесные концентрации хлорамфеникола в органической и водной фазах соответственно; S_орг – площадь пика хлорамфеникола в органической фазе после распределения; S_исх – площадь пика хлорамфеникола в водной фазе до распределения; V_исх – исходный объем водной фазы; V_вод – равновесный объем водной фазы после распределения; V_орг – равновесный объем органической фазы после распределения.

Очистка экстрактов методом твердофазной экстракции. Очистку экстрактов проб и концентрирование аналита проводили на полимерных полиамидных патронах SampliQ OРT (60 мг, 3 мл), проявляющих и гидрофильные, и гидрофобные свойства. Патроны последовательно кондиционировали 3 мл метанола и 3 мл воды, затем пропускали 5 мл водного раствора хлорамфеникола с концентрацией 4.0 нг/мл. Патроны промывали 6 мл воды и высушивали под вакуумом в течение 10 мин. Хлорамфеникол элюировали 3 мл метанола, элюат упаривали в нагревательном модуле при 45°С досуха. Сухой остаток растворяли в 5 мл воды и анализировали методом ВЭЖХ–МС/МС.

Выполнение определения. Жидкие, пастообразные и твердые пищевые продукты. Тщательно гомогенизированные навески массой 1.00 г взвешивали в полипропиленовых пробирках емк. 50 мл, вводили по 0.1 мл раствора внутреннего стандарта хлорамфеникола-D₅ с концентрацией 10 нг/мл, через 10 мин добавляли по 5 мл 4 М раствора сульфата аммония и тщательно перемешивали, затем добавляли по 15 мл этилацетата и помещали пробирки на 10 мин в электровстряхиватель. При анализе Сухие пищевые продукты (сухое молоко, сухие детские молочные адаптированные смеси, спортивное питание и т.п.). Навески продуктов массой 1.00 г взвешивали в полипропиленовых пробирках емк. 50 мл, вводили по 0.1 мл раствора хлорамфеникола-D₅ с концентрацией 10 нг/мл, приливали по 5 мл воды и интенсивно встряхивали до растворения пробы. Затем к содержимому пробирок приливали по 5 мл 4 М раствора сульфата аммония, перемешивали, добавляли по 18 мл этилацетата и помещали пробирки на 10 мин в электровстряхиватель. Далее пробы центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин при 5 ± 2°С. После центрифугирования этилацетатный слой переносили в полипропиленовые пробирки емк. 15 мл. Экстракты упаривали в нагревательном модуле в токе воздуха при 50 ± ± 2°С до удаления органического растворителя. К полученным после упаривания остаткам приливали по 5 мл воды и 5 мл н-гексана, встряхивали в течение 5 мин в элетровстряхивателе. После расслоения фаз гексановые фракции отбирали и отбрасывали. Полученные водные экстракты пропускали через предварительно уравновешенные 3 мл метанола и 3 мл воды патроны SampliQ OPT, которые затем промывали 6 мл воды и высушивали под вакуумом в течение 10 мин. Аналит и внутренний стандарт элюировали 3 мл метанола. Элюат упаривали в нагревательном модуле при 45 ± 2°С. К сухим остаткам приливали по 1 мл смеси ацетонитрил–вода (3 : 7, по объему), тщательно перемешивали в электровстряхивателе, фильтровали через мембранные шприцевые фильтры из регенерированной целлюлозы в микрофлаконы, анализировали методом ВЭЖХ–МС/МС.

Условия хроматографического разделения: колонка Zorbax SB C₁₈ (150 × 2.1 мм, 3.5 мкм); компоненты подвижной фазы вода (А) и ацетонитрил (Б); режим градиентного элюирования (0–5 мин – от 30 до 50, 5–6 мин – от 50 до 100, 6–9 мин – 100; 9–13 мин – 30 об. % Б); расход подвижной фазы 0.3 мл/мин; температура термостата колонки 40°С; объем вводимой пробы 20 мкл.

Параметры масс-спектрометрического детектирования: ионизация электрораспылением в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов; расход газа для десольватации 600 дм³/ч; температура газа для десольватации 350°С; давление на распылителе 45 psi (310.3 кПа); напряжение на капилляре 4000 В; режим мониторинга заданных реакций для хлорамфеникола m/z 321.0 → 152.0 и m/z 326.0 → 157.0 для внутреннего стандарта.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор условий масс-спектрометрического детектирования. Ионизацию хлорамфеникола осуществляли методом электрораспыления в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов. Для определения исходного иона непосредственно в масс-спектрометрический детектор вводили раствор хлорамфеникола в воде с концентрацией 1 мкг/мл и регистрировали полный масс-спектр (рис. 1). Видно, что доминирующими ионами являются депротонированные изотопологи хлорамфеникола (М–Н)^– с разными комбинациями изотопов двух атомов хлора в своем составе: m/z 321, ³⁵Cl³⁵Cl; m/z 323, ³⁵Cl³⁷Cl; m/z 325, ³⁷Cl³⁷Cl. В качестве исходного иона выбрали наиболее интенсивный псевдомолекулярный ион C₁₁H₁₁³⁵Cl₂N₂${\text{O}}_{5}^{ - }$ с m/z 321.0.

Большое влияние на величину отклика оказывают параметры настройки масс-детектора. Так, повышение напряжения на фрагментаторе (НФ) способствует лучшей передаче ионов в первый квадруполь, однако при чрезмерно высоком значении НФ исходный ион аналита может распадаться на фрагменты, не достигнув первого квадрупольного фильтра. Для установления оптимального значения НФ изучили влияние на отклик исходного иона m/z 321.0 величины напряжения в диапазоне значений от 60 до 180 В. Максимального отклика достигли при 120 В, в то время как высокое НФ приводило к образованию множества ионов с небольшими значениями m/z и, как следствие, к существенному снижению интенсивности сигнала выбранного исходного иона с m/z 321.0. Масс-спектр, полученный для водного раствора хлорамфеникола концентрацией 1 мкг/мл при НФ 180 В, представлен на рис. 2. Таким образом, оптимальное значение НФ для эффективного переноса исходного иона с m/z 321.0 составило 120 В.

Изучено влияние величины энергии соударений (ЭС) на характер фрагментации исходного иона хлорамфеникола в ячейке соударений для выбора наилучших пар ионных реакций. Для иона-предшественника с m/z 321.0 выделили три доминирующих иона-продукта и проанализировали влияние ЭС на величину их отклика. Результаты представлены на рис 3. Видно, что максимальный отклик получен для иона-продукта ${{{\text{C}}}_{{\text{7}}}}{{{\text{H}}}_{{\text{7}}}}{\text{NO}}_{3}^{ - }$ с m/z 152.0 при ЭС 5 эВ. На втором месте по интенсивности находится сигнал фрагмента C₁₀H₁₀³⁵ClN₂${\text{O}}_{5}^{ - }$ с m/z 257.0 при ЭС 0 эВ. Отклик иона ${{{\text{C}}}_{{\text{6}}}}{{{\text{H}}}_{{\text{3}}}}{\text{NO}}_{2}^{ - }$ с m/z 121.0 достиг своего наибольшего значения при ЭС 25 эВ, однако по интенсивности он значительно уступает двум предыдущим. Таким образом, для определения содержания хлорамфеникола использовали ион-продукт с m/z 152.0 (ЭС 5 эВ), для подтверждения достоверности определения – отношение откликов ионов m/z 152.0 (5 эВ)/m/z 257.0 (ЭС 0 эВ).

Описанные выше исследования повторили для дейтерированной формы хлорамфеникола, которую в дальнейшем использовали в качестве внутреннего стандарта при определении хлорамфеникола в пищевых продуктах животного происхождения. Максимальный сигнал установленного исходного иона хлорамфеникола-D₅ с m/z 326.0 получен при НФ 120 В, наибольшие сигналы выбранных ионов-продуктов с m/z 157.0 и 262.0 зафиксированы при ЭС 5 и 0 эВ соответственно.

Далее в режиме хроматографирования оптимизировали параметры источника ионизации: температура газа для десольватации 350°С, расход газа для десольватации 600 дм³/ч, давление на распылителе 45 psi, напряжение на капилляре 4000 В. Параметры масс-спектрометрического детектирования хлорамфеникола в режиме мониторинга заданных реакций приведены в табл. 1.

Выбор условий хроматографического разделения. Для разработки методики выбрана хроматографическая колонка с обращенной фазой Zorbax SB C₁₈, поскольку она является универсальной, устойчивой в широком диапазоне рН и пригодной при проведении серийных анализов. Для выбора органического компонента подвижной фазы изучили величину отклика и время удерживания хлорамфеникола при элюировании подвижными фазами метанол–вода и ацетонитрил–вода (3 : 7, по объему). Найдено, что при использовании ацетонитрила время удерживания хлорамфеникола составило 3.4 мин, а при использовании метанола – 8.4 мин, при этом увеличилась ширина хроматографического пика у основания и практически в 3 раза уменьшилась высота пика. Поэтому в качестве органического компонента подвижной фазы использовали ацетонитрил.

Описано [10–13, 15–22] использование водной фазы с различными модификаторами, поэтому мы изучили влияние состава и рН водного раствора на величину отклика определяемого соединения (рис. 4). Наибольший отклик для m/z 321.0 → → 152.0 получен при использовании воды и растворов аммиака с рН 8.0 и 8.5, поскольку в нейтральной и слабощелочной средах часть молекул хлорамфеникола депротонирована по атому азота амидной группы (схема). Применение 0.1%-ного раствора муравьиной кислоты привело к значительному снижению площади пика аналита, так как при низких значениях рН хлорамфеникол находится в нейтральной молекулярной форме и не регистрируется масс-спектрометром. При использовании растворов ацетата и формиата аммония площадь пика хлорамфеникола снизилась в 3.4 и 5.8 раз соответственно по сравнению с сигналом, полученным с чистой водой. Вероятно, несмотря на нейтральное значение рН данных водных элюентов, природа катионов и анионов солевых добавок повлияла на характер ионизации аналита, что и привело к снижению сигнала m/z 321.0 → 152.0. В качестве водного компонента элюента выбрали воду.

Экстракция хлорамфеникола и очистка экстрактов. При анализе методом ВЭЖХ–МС/МС на отклик хлорамфеникола сильно влияют соединения, соэкстрагируемые из пищевой матрицы, поскольку они могут как подавлять его ионизацию, так и способствовать ей, искажая результаты количественного определения. Чтобы минимизировать указанный эффект и учесть потери целевого соединения в результате пробоподготовки, в методе ВЭЖХ–МС/МС принято использовать матричную градуировку: в “чистые” пищевые матрицы, соответствующие по составу исследуемым образцам и не содержащие целевого соединения, перед началом процедуры пробоподготовки вносят необходимые аликвоты растворов стандартов. Однако при большом разнообразии исследуемых групп пищевых продуктов, с одной стороны, возникает проблема поиска “чистых” пищевых матриц, а с другой стороны, возрастает стоимость и продолжительность исследований. Решением этой проблемы при наличии внутреннего стандарта, отличающегося от аналита лишь изотопным составом, является использование внешней градуировки и применение эффективной процедуры подготовки проб, обеспечивающей максимальное извлечение аналита и наиболее полное отделение его от компонентов матрицы.

Описаны [10–13, 15–22] методики экстракции хлорамфеникола с использованием различных по природе и полярности экстрагентов, однако данные по коэффициентам распределения антибиотика практически отсутствуют. В табл. 2 приведены значения коэффициентов распределения и степени извлечения хлорамфеникола из водных растворов различными экстрагентами. Установлено, что наибольшая степень извлечения хлорамфеникола достигается экстракцией этилацетатом и н-бутанолом. Высокая экстрагирующая способность данных полярных растворителей обусловлена образованием ассоциатов молекул растворителя и антибиотика по гидратно-сольватному и донорно-акцепторному механизмам благодаря присутствию в молекуле хлорамфеникола полярных функциональных групп: гидроксильных, амидной группы и нитрогруппы (схема). Экстрагирующая сила малополярного хлороформа невелика, в то время как смесь хлороформа с ацетоном (2 : 1) характеризуется хорошей экстрагирующей способностью (табл. 2). Неполярный н-гексан показал самую слабую экстрагирующую способность.

Таким образом, наиболее подходящими растворителями для извлечения хлорамфеникола являются этилацетат и н-бутанол. Использование данных плохо смешивающихся с водой органических растворителей в пробоподготовке пищевых продуктов позволяет также очистить пробу от электролитов, сахаров и белковых компонентов, поскольку они не экстрагируются в органическую фазу. Учитывая меньшую температуру кипения этилацетата (77.1°С) по сравнению с н-бутанолом (117.4°С), в качестве экстрагента для дальнейших исследований выбрали этилацетат, что позволило концентрировать аналит упариванием при более низкой температуре и сократить общую продолжительность пробоподготовки. Поскольку при экстракции хлорамфеникола из водных растворов проб пищевых продуктов этилацетатом может образовываться устойчивая эмульсия, к пробе вместо воды добавляли 4 М водный раствор сульфата аммония, который уменьшает взаимное растворение воды и этилацетата, подавляет образование эмульсии и способствует скорейшему установлению межфазового равновесия.

Этилацетат из пищевых продуктов извлекает также и липиды. Поскольку из водных растворов н-гексан практически не экстрагирует хлорамфеникол (табл. 2), для последующей очистки от липидов этилацетатный экстракт упаривали досуха, полученный остаток заново растворяли в воде и экстрагировали липиды в н-гексан.

Для дополнительной очистки полученных обезжиренных водных экстрактов и концентрирования аналита перед инструментальным определением использовали метод ТФЭ на полимерных полиамидных патронах SampliQ OРT. Показано, что хлорамфеникол при пропускании водного раствора хорошо удерживается на сорбенте и затем полностью элюируется метанолом: выход хлорамфеникола составил 99.3 ± 0.9% (n = 3).

Методика определения хлорамфеникола. На основании проведенных исследований разработана методика определения содержания остаточных количеств хлорамфеникола в сырье животного происхождения и пищевых продуктах. Методика включает экстракцию аналита этилацетатом из раствора пробы в 4 М растворе сульфата аммония, упаривание органического растворителя, растворение полученного сухого остатка в воде, обезжиривание н-гексаном, концентрирование методом ТФЭ и количественное определение методом ВЭЖХ–МС/МС.

Для построения градуировочного графика готовили водно-ацетонитрильные (7 : 3, по объему) растворы с концентрацией хлорамфеникола 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 и 1.0 нг/мл, содержащие 1 нг/мл хлорамфеникола-D₅. Использовали свежеприготовленные растворы.

Зависимость относительной площади пика (площадь пика аналита, деленная на площадь пика внутреннего стандарта) от относительной концентрации (концентрация аналита, деленная на концентрацию внутреннего стандарта), построенная с помощью программного обеспечения Agilent MassHunter, линейна и описывается уравнением y = 0.7758x – 0.0088 с коэффициентом детерминации R² = 0.999.

Валидация. Для валидации методики использовали молоко сырое, консервы мясные для детского питания, биологически активную добавку “Гематоген”, сухую адаптированную молочную смесь для питания детей раннего возраста, сыр, свинину с шестью уровнями содержания внесенного хлорамфеникола в диапазоне концентраций от 0.3 до 0.9 мкг/кг. Для каждого продукта проведено по 15 определений, выполненных в условиях промежуточной прецизионности с двумя изменяющимися факторами: время, оператор. Каждое определение включало 2 единичных результата измерения, полученных в условиях повторяемости. Значения относительного стандартного отклонения повторяемости s_r составили 0.028–0.052, значения промежуточной прецизионности s_l(TO) составили 0.031–0.060, смещение метода незначимо. Максимальная расширенная неопределенность U составила 18.4% при Р = 0.95.

На рис. 5 представлены типичные хроматограммы образца молока сырого без внесения хлорамфеникола и того же образца молока с внесением хлорамфеникола в количестве 0.3 мкг/кг продукта. Пик аналита интенсивен (соотношение сигнал/шум 24.4), что делает возможным определение хлорамфеникола на регламентируемом уровне. Предел определения методики составляет 0.2 мкг/кг, что соответствует требованиям [3–7 ].