Журнал аналитической химии, 2020, T. 75, № 11, стр. 1021-1029

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали: чернику быстрозамороженную “4 сезона” (Россия), чернику быстрозамороженную “Вологодская ягода” (Россия) и чернику быстрозамороженную (Китай).

Антоцианы экстрагировали из растительного материала настаиванием в 0.1 М водной HCl до исчерпывающей экстракции. Порции экстрактов объединяли и после фильтрования концентрацию антоцианов определяли дифференциальным спектрофотометрическим методом [14]. Для ВЭ-ЖХ-определения видового состава антоцианов экстракты очищали твердофазной экстракцией на концентрирующих патронах ДИАПАК С18.

Хроматографическое поведение антоцианов исследовали в изократических и градиентных режимах с использованием хроматографической системы Agilent 1260 Infinity с диодно-матричным и масс-спектрометрическим детекторами на хроматографической колонке: (150 × 4.6 мм) Symmetry C18 (3.5 мкм). Масс-спектры регистрировали в режиме ионизации электрораспылением при сканировании положительно заряженных ионов. Подвижные фазы готовили смешиванием 10 об. % НСООН, заданного объема СН₃CN и дистиллированной воды. В работе предложены градиентные режимы при температуре термостата колонок 40°С и при расходе подвижной фазы 0.8 мл/мин.

Градиент 1 (Г1): элюент А: 0 об. % СН₃CN и 10 об. % НСООН в воде; элюент Б: 30 об. % СН₃CN и 10 об. % НСООН в воде. Режим: 0 мин – 0% Б; 50 мин – 50% Б; 51 мин – 0% Б; рекондиционирование колонки – 10 мин.

Градиент 2 (Г2): элюент А: 0 об. % СН₃CN и 10 об. % НСООН в воде; элюент Б: 20 об. % СН₃CN и 10 об. % НСООН в воде. Режим: 0 мин – 20% Б; 10 мин – 40% Б; 35 мин – 100% Б; 36 мин – 20% Б, рекондиционирование колонки – 10 мин. Отметим, что рекондиционирование колонки необходимо для уравновешивания стационарной фазы со стартовой подвижной фазой градиентных режимов; только в этом случае пики аналитов совпадают при наложении хроматограмм.

Градиент 3 (Г3) при температуре термостата колонок 25°С при расходе подвижной фазы 0.8 мл/мин: элюент А: 6 об. % СН₃CN и 10 об. % НСООН в воде; элюент Б: 30 об. % СН₃CN и 10 об. % НСООН в воде. Режим: 0 мин – 0% Б; 10 мин – 0% Б; 30 мин – 40% Б; 60 мин – 40% Б; 61 мин – 0% Б; для рекондиционирования колонки достаточно 9–10 мин.

Хроматограммы записывали при λ(det) 515 нм с регистрацией спектров в диапазоне 400–700 нм.

Определение дифференциальным спектрофотометрическим методом выполняли в соответствии с данными работы [14]. Из суммарного поглощения экстракта при рН 1, A(Σ, pH 1), вычитали поглощение при изменении рН до 4.5, A(Σ, pH 4.5), которое относили к поглощению “полимерных” форм антоцианов:

Поглощение измеряли при длине волны, соответствующей максимуму в спектре. При регистрации спектров на спектрофотометре Shimadzu UV2550 вычитание фона за счет рассеивания на коллоидных частицах (при λ = 700 нм) выполняется автоматически.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Управление селективностью разделения антоцианов. Концентрация муравьиной кислоты. Систему СH₃CN–HCOOH–H₂O наиболее часто применяют в качсетве элюента для разделения антоцианов. При этом концентрацию муравьиной кислоты желательно поддерживать на достаточно высоком уровне – 10 об. % (рН около 1.5) для возможно более полного перевода всех антоцианов во флавилиевую форму (определяемую форму в ВЭЖХ) [15], учитывая, что рН подвижных фаз для стационарных фаз марки Symmetry C18 должен находиться в пределах 2–8 для стабильной работы колонки.

Влияние концентрации ацетонитрила в изократическом режиме. Карта разделения. Влияние концентрации СH₃CN в подвижной фазе на селективность разделения антоцианов велико в случае, когда кроме моногликозидов в исследуемом образце находятся ди- и тригликозиды [15]. Разделение отдельных смесей 3-галактозидов, 3-глюкозидов или 3-арабинозидов осуществляется легко при любых концентрациях ацетонитрила в подвижной фазе в указанном выше порядке (1). Однако разделение всех пятнадцати компонентов антоцианового комплекса плодов черники проблематично. Так, например, при содержании СH₃CN 6 об. % на хроматограмме удается обнаружить 13 пиков вместо пятнадцати – Dp3Ara и Cy3Gala, как и пара Pn3Gala и Pt3Ara не разделяются (рис. 1).

Для отыскания возможности разделения всех 15 гликозидов следует проанализировать карту разделения в варианте относительного удерживания [16] (рис. 2). Для ее построения использовали несколько различных составов подвижной фазы (по содержанию СH₃CN) в изократическом режиме, выбрав в качестве реперного соединения цианидин-3-глюкозид.

Очевидно, что для разделения первой из выше указанных пар антоцианов необходимо использовать подвижные фазы с небольшим содержанием ацетонитрила, но при этом появляются новые проблемные пары вследствие множественных сближений и пересечений линий трендов на рис. 2. Следовательно, для разделения следует подобрать градиентный режим с низким содержанием ацетонитрила в стартовом составе.

Выбор градиентного режима. Можно предложить несколько различных режимов градиентного элюирования, обеспечивающих разделение всех 15 компонентов, начиная с подвижных фаз с относительно небольшой элюирующей способностью (с содержанием 4 об. % ацетонитрила и даже без него в стартовом элюенте) (рис. 3).

Таким образом, существует возможность разделения всех антоцианов экстракта плодов черники за счет выбора состава стартового элюента в режиме градиентного элюирования, хотя полного разделения всех компонентов (до Rs > 1) в предложенных режимах достичь не удается.

Влияние температуры термостата колонок на селективность разделения. В рассмотренных выше изократических и градиентном составах подвижных фаз использовали температуру 40°С, выбор которой никак не обосновывался, хотя температура может быть одной из величин, влияющих на селективность разделения компонентов сложных смесей.

Установлено, что при росте температуры термостата колонки удерживание 3-галактозидов уменьшается в большей степени по сравнению с удерживанием соответствующих 3-арабинозидов, а при уменьшении температуры порядок элюирования должен измениться на противоположный. Это подтверждено экспериментально – при 25°С все 15 компонентов разделяются даже в изократическом режиме, например, в элюенте, содержащем 6 об. % СH₃CN и 10 об. % HCOOH в воде (рис. 4). Для уменьшения продолжительности записи хроматограммы можно применять градиентный режим Г3.

Таким образом, разделение всех 15 антоцианов экстракта плодов черники возможно при использовании системы СH₃CN–HCOOH–H₂O в качестве элюента.

Качественный и количественный анализ плодов. Для качественного анализа получали масс-спектры в условиях частичной фрагментации [17], с подтверждением по электронным спектрам поглощения (табл. 2). Для каждого из агликонов определили по два 3-гексозида и по одному пентозиду; первый из гексозидов определили как 3-галактозид, а второй – как 3-глюкозид по совпадению удерживания с компонентами экстрактов плодов винограда, содержащих только 3-глюкозиды тех же агликонов [18]. Третий компонент в каждой из групп определили как 3-арабинозид – по наименьшему времени удерживания среди 3-пентозидов, поскольку время удерживания возможных изомеров (3-ксилозиды) существенно больше [19]. Такое отнесение полностью подтверждают параметры электронных спектров, свидетельствующие о том, что гликозидный заместитель находится именно в положении 3 агликонов (по наличию слабой полосы поглощения в диапазоне 420–440 нм [20]), и отсутствуют различия в спектрах обоих 3-гексозидов при небольшом (около 0.5 нм) батохромном сдвиге основной полосы поглощения при переходе от 3-гексозида к 3-пентозиду.

Для количественного анализа использовали два подхода.

Определение соотношения между компонентами в смеси антоцианов. Определяли площади пиков S(i) и долю антоциана по уравнению для внутренней нормировки с поправочными коэффициентами:

где S(i) – площадь пика i–го компонента при записи хроматограммы при длине волны λ(det); поправочный коэффициент k(i) определяли как соотношение интенсивностей поглощения при длине волны, соответствующей максимуму поглощения, λ(max), к интенсивности поглощения при λ(det) для каждого из пиков. Такой подход согласован с определением суммы антоцианов, выраженной через эквивалент цианидин-3-глюкозида хлорида [14].

Определение суммы антоцианов дифференциальным спектрофотометрическим и предложенным хроматографичеким методами. Дифференциальный спектрофотометрический метод [14] можно использовать в условиях, когда при рН 4.5 единственным определяющим процессом является переход флавилиевой формы в форму полуацеталя без заметного вклада реакции депротонирования флавилиевого иона с переходом в хиноидную форму. Возможность выполнения этого требования подтверждена в настоящей работе на примере компонентов экстрактов свежих (или свежезамороженных) плодов черники путем контроля электронных спектров при повышении рН от 1 до 4.5. Полученные результаты представлены в (табл. 3). Как видно, содержание антоцианов в джемах оказалось довольно низким с большой долей “полимерных” форм, что указывает на использование производителем технологии, не учитывающей нестабильность антоцианов. Так, например, при содержании антоцианов в исходных плодах черники на уровне 400 мг в 100 г свежих плодов при варке джема даже с двукратным количеством сахара концентрация антоцианов в продукте должна была бы составлять 100–133 мг на 100 г в зависимости от количества оставшейся при варке воды. Реальный результат 56 мг на 100 г джема примерно вдвое меньше. Высокая доля абсорбции, приходящаяся на “полимерные” формы антоцианов, полученная для всех исследованных образцов джемов и высушенных образцов, указывает на несовершенство технологии приготовления продукции.

Следует также учесть, что дифференциальный спектрофотометрический метод определения концентрации “мономерных” антоцианов (по нашим данным) не имеет строгого научного обоснования, нет доказательств того, что поглощение “полимерной” формы антоцианов одинаково при двух используемых в расчете значениях рН – 1 и 4.5. С другой стороны, по нашим наблюдениям рост концентрации “полимерных” форм антоцианов в исследуемых образцах при ВЭЖХ-определении антоцианов в условиях обращенно-фазовой хроматографии всегда сопровождается пиком с очень широким шлейфом, начинающимся от времени, близкого ко времени выхода неудерживаемых компонентов (рис. 4), который может соответствовать проявлению “полимерных” антоцианов. В таком случае можно оценить вклад “полимерных” форм в суммарную абсорбцию антоцианов при рН, близком к 1 (точнее к 1.5) – как разность суммы площадей пиков с ожидаемой “нулевой” линией (т.е. площади пиков с включением окрашенной в серый цвет части хроматограммы на рис. 5) и площадей пиков, определенных по началу и концу каждого из пиков “мономерных” антоцианов. В таком случае доля, приходящаяся на “полимерные” формы, заметно больше, чем определенная спектрофотометрическим методом (табл. 3), особенно при высоком содержании этих форм.