Журнал аналитической химии, 2020, T. 75, № 3, стр. 266-272

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы, образцы. Использовали водные растворы стандартного образца (СО) состава субстанции триазид и фармацевтической субстанции “Триазид”, предоставленные разработчиком – Институтом органического синтеза им. И.Я. Постовского УрО РАН. Около 0.5 г (точная навеска) СО или субстанции высушивали при температуре от 96 до 97°С не менее 5 ч в течение нескольких дней до постоянной массы. Основной водный раствор ТД с концентрацией 10 г/л готовили из СО и хранили в темноте при комнатной температуре. Рабочие растворы СО ТД готовили разведением основного раствора. Использовали кислоты и соли марки х. ч. от российских производителей без дополнительной очистки. Для приготовления растворов использовали деионизированную воду, полученную на установке ДВС-М/1НА(18)-N от (Медиана фильтр, Россия). Растворы ББР готовили согласно рекомендациям [5]. В качестве идентифицированной примеси применяли стандартный образец 5-метил-7-оксо-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидинида L-аргининия. Для полировки поверхности стеклоуглеродного электрода применяли набор kit 6.2802.010 (Metrohm, Швейцария), включающий оксид алюминия с дисперсностью частиц 0.3 мкм и ткань.

Для подготовки лекарственной формы к анализу около 0.05 г субстанции “Триазид” (точная навеска) растворяли в воде в мерной колбе емк. 25 мл, доводили объем раствора до метки водой и тщательно перемешивали. Величину аликвотны испытуемого раствора пробы, помещаемую в электрохимическую ячейку, рассчитывали в соответствии с уравнением регрессии по градировочной кривой для определения ТД.

Оборудование и средства измерений. Электрохимические исследования проводили в стандартной трехэлектродной ячейке с использованием потенциостата/гальваностата μAutolab Type III (Metrohm, Швейцария) в комплекте с магнитной мешалкой. Индикаторным электродом служил стеклоуглеродный диск, впрессованный во фторопласт диаметром 0.3 см (Metrohm, Швейцария). В качестве вспомогательного электрода использовали стержень из стеклоуглерода диаметром 0.2–0.3 см (Metrohm, Швейцария). Электродом сравнения служил одно/двухключевой хлоридсеребряный электрод типа ЭСр-10101/3.5 моль/л. Значения рН измеряли иономером Эксперт-рН (Эконикс-эксперт, Россия). Для продувки растворов использовали аргон чистотой 99.9%.

Методика эксперимента. Перед анализом поверхность индикаторного стеклоуглеродного электрода (СУЭ) полировали с помощью суспензии оксида алюминия. Для удаления следов абразива поверхность СУЭ промывали 0.1 М HNO₃ и ополаскивали деионизированной водой.

Для удаления растворенного кислорода, волна восстановления которого на СУЭ регистрируется в области катодного тока ТД, через раствор интенсивно (5–6 пузырьков в секунду) в течение 10 мин продували аргон. Затем уменьшали скорость продувки до 1 пузырька в секунду, опускали электроды в раствор, сопло направляли таким образом, чтобы выходящие пузырьки газа не попадали на электроды, выключали мешалку, выжидали 5 с для успокоения раствора и регистрировали вольтамперограмму. После регистрации каждой вольтамперограммы СУЭ выдерживали в течение 3 мин при потенциале 0.0 В.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Электрохимическое поведение триазида на стеклоуглеродном электроде. На рис. 1 представлены катодно-анодные циклические вольтамперограммы (ЦВА), зарегистрированные на СУЭ в 0.1 М HNO₃ без добавления и после добавления 1 мМ 5-метил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидинид аргинина моногидрата (триазид, I, структурную формулу см. ниже на схеме 2), 5-метил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидинид натрия моногидрата (II, схема 1), 5-метил-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидинид аргинина моногидрата (III, схема 1) и L-аргинина (IV). Как видно, на ЦВА соединений I и II, имеющих в своей структуре нитрогруппу, наблюдается пик восстановления, который отсутствует на ЦВА соединений, не содержащих нитрогруппу. Вероятно, полученный катодный сигнал обусловлен протеканием процесса электровосстановления нитрогруппы, связанной с сопряженной ароматической системой.

Схема 1. Структурные формулы 5-метил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидинид натрия моногидрата (II) и 5-метил-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-a]пиримидинид аргинина моногидрата (III).

Рис. 1.

Катодно-анодные циклические вольтамперограммы, зарегистрированные на стеклоуглеродном электроде при скорости сканирования 0.1 В/с в 0.1 М HNO₃ после продувки аргоном без добавления и после добавления 1 мМ соединений I–IV.

Число электронов, участвующих в восстановлении нитрогруппы в составе ТД, рассчитывали параллельно двумя методами: 1) путем сравнения количества электричества, затраченного на электрохимическое (ЭХ) превращение исследуемого вещества, с количеством электричества, затраченного на ЭХ-превращение модельной системы гексацианоферрата(III) калия; 2) с применением уравнения Коттрелла [6]. Среднее значение числа электронов, рассчитанное обоими методами, составило 6. Ниже представлена возможная схема процесса ЭХ-восстановления ТД, составленная на основе имеющихся в литературе [7, 8] и полученных нами [6] данных (схема 2):

Схема 2. Возможная схема процесса электрохимического восстановления триазида.

Влияние кислотности раствора на ток восстановления триазида. Влияние кислотности растворов ББР на ток и потенциал восстановления ТД изучали в области рН 2–12. Ток восстановления ТД (рис. 2а) достаточно стабилен при рН 3–5 и достигает максимального значения при рН 4. Снижение величины пика ТД в более кислой среде может быть обусловлено экранированием поверхности СУЭ выделяющимся при катодной поляризации водородом. В растворах с рН ≥ 5 катодный ток уменьшается. С увеличением рН раствора фонового электролита от 2 до 6 максимум пика восстановления ТД смещается в сторону отрицательных значений потенциала (рис. 2б), после чего стабилизируется в щелочных буферных растворах. Полученные результаты могут свидетельствовать об участии ионов водорода в процессе электровосстановления соединения. Дальнейшие исследования проводили в растворах ББР с рН 4.

Рис. 2.

Влияние рН буферных растворов Бриттона−Робинсона на ток и потенциал пика восстановления 180 мг/л триазида. Условия регистрации квадратно-волновых вольтамперограмм: шаг развертки 0.005 В, амплитуда импульса 0.05 В, скорость развертки 0.15 В/с.

Выбор режима вольтамперометрических измерений. Сравнение различных вариантов вольтамперометрии (линейной, дифференциально-импульсной (ДИП) и квадратно-волновой (КвВ)) показало, что оптимальным при работе с ТД с использованием СУЭ в растворе ББР при pH 4 является режим КвВ. В этом случае ток восстановления ТД (аналитический сигнал, АС) симметричен и может быть измерен с высокой точностью, в отличие от линейного режима регистрации, а величина тока восстановления выше примерно в два раза по сравнению с режимом ДИП. Чувствительность метода КвВ можно увеличить путем устранения тока заряжения и измерения в основном фарадеевской составляющей тока. Главным преимуществом КвВ является высокая скорость развертки потенциала порядка 0.1–2 В/с. Вольтамперограмма может быть зарегистрирована в течение нескольких секунд (по сравнению с 2–3 мин в режиме ДИП). В результате продолжительность анализа в целом существенно сокращается. Перечисленные преимущества нашли отражение в частом использовании режима КвВ для анализа лекарственных форм различных биологически активных соединений [9].

Величина АС в режиме КвВ существенно зависит от скорости развертки потенциала и амплитуды импульса (рис. 3). Как видно, величина тока восстановления ТД резко возрастает в интервале скоростей развертки 0.025–0.15 В/с, после чего рост существенно замедляется (рис. 3а). При скорости развертки 0.15 В/с и шаге развертки 0.005 В АС ТД растет практически линейно с увеличением амплитуды импульса в области 0.01–0.05 В (рис. 3б). При дальнейшем увеличении амплитуды импульса до 0.10 В величина АС возрастает нелинейно, после чего рост прекращается. Для аналитических целей выбрана скорость развертки 0.15 В/с (частота импульса 30 Гц) с амплитудой импульса 0.05 В. Предварительная выдержка СУЭ в перемешиваемом растворе ББР с добавлением 180 мг/л ТД в течение 1–300 с в интервале потенциалов 1.0–0.1 В, в котором ТД электрохимически не активен, не приводит к увеличению АС за счет возможной адсорбции аналита на поверхности индикаторного электрода. Это позволяет использовать метод прямой КвВ ВА для определения ТД.

Рис. 3.

Зависимости аналитического сигнала 180 мг/л триазида от скорости развертки потенциала и амплитуды импульса, полученные в буферном растворе Бриттона−Робинсона с рН 4 с использованием квадратно-волнового режима регистрации вольтамперограмм. Условия: шаг развертки 0.005 В, амплитуда импульса 0.05 В (а), скорость развертки 0.15 В/с (б).

Характеристики градуировочного графика триазида. При оптимальных условиях регистрации ток пика линейно растет при концентрациях ТД в растворе в интервале 10–500 мг/л. На рис. 4а, 4б приведены соответствующие КвВ-вольтамперограммы для разных концентраций ТД в растворе. Уравнение регрессии имеет вид: I (мкA) = (0.1176 ± ± 0.0002)c (мг/л) – (0.317 ± 0.069) с коэффициентом корреляции 0.9998. Предел обнаружения, рассчитанный по градуировочной кривой, составляет 1.9 мг/л, предел определения – 5.8 мг/л.

Рис. 4.

Квадратно-волновые вольтамперограммы триазида, зарегистрированные в буферном растворе Бриттона−Робинсона при рН 4 с добавлением 0, 10, 20, 30, 50 (а) и 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 мг/л триазида (б). Условия регистрации вольтамперограмм см. в подписи к рис. 2.

Аналитические характеристики разработанной методики количественного определения триазида в фармацевтической субстанции “Триазид”. Основные показатели методики оценивали в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 “Валидация аналитических методик” [10].

Для оценки правильности и специфичности применяли искусственные смеси. Стандартный образец триазида в количестве 50, 100 и 150% от ожидаемого уровня в 100 мг/л вводили в раствор, содержащий идентифицированную примесь в максимально возможных концентрациях, соответствующих составу фармацевтической субстанции “Триазид” (суммарное содержание примесей не более 2%).

Показатель правильности рассчитывали для каждого уровня концентраций ТД. Исследовали три концентрации растворов, каждое определение повторяли три раза. Рассчитывали показатель правильности и доверительный интервал среднего значения, стандартное отклонение (s), относительное стандартное отклонение (s_r, %). Показатель правильности для различных уровней концентраций близок к 100%. Среднее значение для процента восстановления составило 99.8 ± 0.5%. Доверительный интервал среднего результата анализа включает значение 100%. Значение s составило 0.61, s_r – 0.6%.

Сходимость (повторяемость) методики оценивали по результатам шести анализов образца с содержанием ТД, близким к номинальному. Каждый испытуемый водный раствор СО ТД готовили по точной навеске. Результат единичного определения получали методом стандартной добавки.

Внутрилабораторную прецизионность методики оценивали в условиях работы одной лаборатории: разные дни, разные исполнители. Полученные результаты приведены в табл. 1. Разработанный метод соответствует критериям прецизионности для электроанализа [11], является правильным и селективным, что позволяет использовать его для анализа фармацевтической субстанции “Триазид” на содержание основного вещества.

Результаты анализа различных партий фармацевтической субстанции. Согласно проекту фармакопейной статьи “ТРИАЗИД субстанция” содержание ТД (количественное определение методом ВЭЖХ) должно составлять не менее 98.0% и не более 102.0% в пересчете на сухое вещество. Результаты анализа трех разных партий субстанции (табл. 2) удовлетворяют заявленным требованиям.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17-13-01096).