Журнал аналитической химии, 2021, T. 76, № 2, стр. 143-150

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект исследования. В эксперименте участвовал доброволец (возраст 21 год), давший информированное устное согласие после ознакомления с планом и условиями исследования. До употребления унифирама образцы мочи собирали в течение двух дней (утром и вечером), после чего доброволец однократно употреблял 10 мг унифирама. Затем образцы мочи собирали в течение 10 дней (утром и вечером). Обязательными условими при выполнении эксперимента являлись отсутствие заболеваний, требующих употребления медикаментов, минимизация факторов стресса и соблюдение диеты на протяжении эксперимента, что позволяло снизить вариативность данных.

Реактивы и реагенты. Стандартный образец унифирама приобретали у “Shanghai Soyoung Biotech. Inc.” (Китай). Метанол “для ВЭЖХ” приобретали у “J.T. Baker” (США). Воду сопротивлением 18.2 МОм см получали с использованием системы Milli-Q Simplicity (Millipore, Франция). Ацетат аммония ч. д. а. и муравьиную кислоту х. ч. для подвижной фазы приобретали у компаний “Вектон” (Россия) и “Acros Organics” (США) соответственно. Гидролиз проб проводили с использованием глюкуронидазы E. Coli и H. Pomatia, приобретенными у компаний “Roche” (Германия) и “Sigma-Aldrich” (США), для минерального гидролиза применяли соляную кислоту х. ч. (Вектон, Россия).

Условия УВЭЖХ–МСВР-анализа. Для поиска вероятных метаболитов использовали квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр Bruker MaXis Impact, оснащенный источником электрораспылительной ионизации, соединенный с УВЭ-ЖХ-системой Bruker Elute под управлением программного обеспечения Bruker Compass HyStar 4.1. Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения Bruker Data Analysis 4.4. Для хроматографического разделения применяли аналитическую колонку Bruker Intensity Solo-2 C₁₈ (75 × 2.1 мм, 2.6 мкм), термостатируемую при 40°С и оснащенную предохранительной колонкой с идентичным сорбентом. Условия масс-спектрометрического детектирования и градиентного элюирования приведены в табл. 1, 2.

Подготовленные к анализу образцы термостатировали в автоматическом дозаторе при 5°С.

Пробоподготовка. Подготовку проб к анализу проводили путем простого разбавления проб, а также ферментативного и минерального гидролиза, используя ферменты E. coli и H. pomatia. Известно, что после ферментативного гидролиза с использованием E. coli происходит деконъюгация исключительно глюкуронидов, в то время как применение H. pomatia позволяет деконъюгировать как глюкурониды, так и сульфаты благодаря наличию арилсульфатазы, однако эффективность фермента сильно зависит не только от температуры инкубации проб после его добавления, но и от значения рН образца. Так, оптимальное значение рН для фермента E. coli лежит в диапазоне 6.5–6.8, в то время как наибольшая активность H. pomatia достигается при рН 4.5. В обоих случаях для поддержания необходимого значения рН используют буферные растворы – фосфатный и ацетатный соответственно. Для реализации этого подхода к аликвоте пробы мочи объемом 3 мл добавляли 1 мл буферного раствора и 30 мкл фермента, тщательно перемешивали, после чего инкубировали при 50°С в течение 1 ч, охлаждали до комнатной температуры, отбирали 1 мл гидролизата и центрифугировали в течение 10 мин в пробирке типа Эппендорф емк. 1.5 мл при 10 000 об/мин, после чего супернатант переносили в стеклянные виалы для последующего анализа.

Минеральный гидролиз позволяет разрушать практически все возможные виды конъюгатов, что является его несомненным преимуществом, однако ферментативные способы являются гораздо более мягкими и щадящими как по отношению к образцу, так и к прибору (при дальнейшем анализе полученных проб). Минеральный гидролиз проводили следующим образом: аликвоту мочи объемом 3 мл помещали в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой, добавляли 500 мкл конц. HCl, герметично закрывали, перемешивали, после чего инкубировали при 80°С в течение 1 ч, затем отбирали 1.5 мл гидролизата, переносили в пробирку типа Эппендорф через воронку, заполненную гидрокарбонатом натрия (для нейтрализации кислоты), и центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 об/мин с последующим переносом супернатанта в стеклянную виалу для анализа.

Для разбавления проб использовали смесь 0.1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде–ацетонитрил (50 : 50, v/v) следующим образом: 200 мкл пробы мочи помещали в пробирку типа Эппендорф и добавляли 800 мкл разбавителя, перемешивали на вортексе в течение 1 мин, после чего центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 об/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Учитывая среднюю полярность унифирама, применение обращено-фазовой УВЭЖХ является оптимальным решением. Кроме того, исходя из структуры нативного вещества и базируясь на известных особенностях протекания метаболизма в организме человека, можно предположить структуры некоторых метаболитов (рис. 1).

Рис. 1.

Теоретически возможные пути метаболизма унифирама.

Наши предположения о структурах метаболитов основаны как на описанных в работе [17] закономерностях протекания основных стадий метаболизма ксенобиотиков, так и на расчетах с применением программно-аппаратных комплексов, таких как MetWorks (Thermo Scientific) [18] и GLORY (Hamburg University) [19]. Следует отметить, что, несмотря на постоянное совершенствование подобных программных продуктов, их точность по-прежнему остается относительно невысокой. Кроме того, описанные выше подходы зачастую позволяют сделать предположение лишь о наиболее очевидных метаболитах. В связи с этим применение метода in vitro по-прежнему остается наиболее надежным способом решения подобных задач. Тем не менее применение программных продуктов для прогнозирования путей метаболизма представляет интерес из-за отсутствия в ряде случаев возможности проведения экспериментов с использованием клеточных культур. Однако такой подход требует ряда дополнительных предосторожностей для снижения риска возникновения ложноположительного результата. Среди них – требования к отсутствию пиков эндогенных соединений с близкими к предполагаемым метаболитам значениями параметров удерживания, а также минимизация погрешности определения масс (менее 5 ppm для режима сканирования ионов-прекурсоров и не более 10 ppm в режиме сканирования ионов-продуктов). Дополнительным и немаловажным способом проверки корректности первичных выводов является также оценка изотопного распределения, особенно для таких соединений, как унифирам, имеющих несколько разных гетероатомов в исходной структуре.

Исходя из описанных выше соображений, пробы мочи анализировали до и после употребления унифирама с использованием нескольких режимов сканирования: автоматического выбора ионов-прекурсоров с последующим получением спектра ионов продуктов (auto MS/MS), сканирования полного спектра ионов-прекурсоров (full MS), а также с применением режима широкополосного пропускания ионов с последующей соударительной диссоциацией (bbCID) с привлечением библиотек Target Screener, содержащих спектры ряда ксенобиотиков и их метаболитов и пестицидов для минимизации возникновения ложноположительных результатов.

После анализа хроматограмм (рис. 2) с применением описанных выше критериев удалось выделить два потенциальных метаболита унифирама (рис. 3). Анализируя полученные ионы-прекурсоры и соответствующие им ионы-продукты, можно сделать вывод о том, что образование дефтордигидроксилированного метаболита (М1) происходит указанным на рис. 3 путем, а не за счет замещения атома фтора на гидроксильную группу, о чем свидетельствует наблюдаемая фрагментация (рис. 4, 5). Положение гидроксильных групп в приведенной схеме фрагментации является допущением и приведено в целях удобства расчета масс.

Рис. 2.

Хроматограмма образца мочи (четвертый день после употребления унифирама), содержащего предполагаемые метаболиты, по выделенным протонированным молекулярным ионам (М1 – m/z 313.0853, М2 – m/z 315.0809).

Рис. 3.

Предполагаемые метаболиты унифирама.

Рис. 4.

Масс-спектр ионов-продуктов, полученный для предполагаемого метаболита унифирама М1.

Рис. 5.

Предлагаемая интерпретация зарегистрированного масс-спектра вероятного метаболита унифирама М1 (ТМ – теоретическая масса, НМ – наблюдаемая масса, ООМ – ошибка определения массы).

Исходя из точной массы второго потенциального метаболита и закономерностей протекания метаболизма ксенобиотиков можно сделать вывод о том, что это моногидроксилированный метаболит или сформировавшийся в результате деалкилирования и карбонилирования метаболит. В пользу последнего варианта свидетельствует наблюдаемая фрагментация (рис. 6, 7).

Рис. 6.

Масс-спектр ионов-продуктов, полученный для предполагаемого метаболита унифирама М2.

Рис. 7.

Предлагаемая интерпретация зарегистрированного масс-спектра вероятного метаболита унифирама М2 (ТМ – теоретическая масса, НМ – наблюдаемая масса, ООМ – ошибка определения массы).

Все предположения базируются на соотнесении наблюдаемых и теоретических масс и их изотопного распределения (табл. 3).

Полученные результаты справедливы в отношении проб после ферментативного гидролиза. Образцы, подвергшиеся минеральному гидролизу, исключили из рассмотрения ввиду их деградации в процессе инкубирования с соляной кислотой, вероятно, приводившей к разрушению аналитов. В ряде случаев не представлялось возможным обнаружить даже стероидные гормоны, также склонные к деградации в условиях высокотемпературного и продолжительного минерального гидролиза.

К сожалению, зачастую применение масс-спектрометрии не позволяет установить точное положение заместителя (в частности, гидроксильной группы), а достоверное подтверждение возможно исключительно лишь после препаративного выделения предполагаемых метаболитов в достаточных количествах с дальнейшим описанием методами ЯМР- и ИК-спектроскопии (помимо масс-спектрометрии) или путем встречного синтеза предполагаемых метаболитов и сопоставления их параметров удерживания и масс-спектральных характеристик с наблюдаемыми в образце.

Методология нецелевого поиска метаболитов в данном случае построена на постепенном увеличении элюирующей силы подвижной фазы при использовании хроматографического разделения с быстрой регистрацией спектра ионов-прекурсоров и ионов-продуктов. Для повышения экспрессности анализа, а также уменьшения ширины хроматографических пиков помимо градиента по составу подвижной фазы (ПФ) возможно также изменение скорости еe подачи. Подобная плавная развертка градиента позволяет уменьшить количество коэлюирующихся соединений и обеспечить лучшую работу масс-спектрометра в целях нецелевого поиска соединений ввиду меньшего гашения ионизации, для чего в случае масс-спектрометрии высокого разрешения оптимальным выбором является режим auto MS/MS. В случае применения этого режима особое внимание следует уделить критериям выбора ионов-прекурсоров и условиям их динамического исключения. Для проведения экспериментов в рамках поставленной нами задачи было принято решение использовать семь наиболее интенсивных ионов-прекурсоров с их динамическим исключением после трех циклов сканирования и возможностью повторного сканирования при выполнении одного или всех следующих условий: интенсивность иона возрастает до 1 млн имп/с или по прошествии 30 с после последнего сканирования данного иона. Весь цикл сканирования ионов-продуктов и ионов-прекурсоров осуществлялся за 2 с, что при оптимизации метода на быстрое разделение могло бы привести к возникновению ложноотрицательных результатов из-за низкой скорости сканирования, в то время как ее существенное повышение привело бы к значительному падению интенсивности сигналов.

Применение режима сканирования full MS, в свою очередь, часто позволяет добиться максимальной чувствительности для QTOF-систем (ввиду отсутствия потерь в процессе соударительной ионизации), что немаловажно при оценке временных окон обнаружения потенциальных метаболитов после употребления нативного вещества после подтверждения их структуры.

В то же время градиент по скорости подачи подвижной фазы может негативно сказаться на чувствительности анализа, поскольку параметры температуры источника ионизации, напряжения на капилляре и расхода газов на распыление и осушение напрямую зависят от скорости ее потока.

При оптимизации условий качественного и количественного анализа уточнение окон обнаружения, как правило, проводят рутинным для лаборатории методом. В предложенных нами условиях определение нативного унифирама в моче возможно в течение до трех суток с момента его однократного употребления с использованием процедуры разбавления проб мочи. Обнаружение М2 возможно с третьих по пятые сутки, М1 – с третьего по шестой день после применения ферментативного гидролиза.

Исследования проводили при поддержке проектов Госзадания Минобрнауки РФ (проект FZEN-2020-0022) и РФФИ, проект № 19-43-230004 р_а, с участием специалистов ЦКП “Эколого-аналитический центр” Кубанского государственного университета, уникальный идентификатор центра RFMEFI59317Х0008.