Журнал аналитической химии, 2021, T. 76, № 6, стр. 543-554

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты и реактивы. Стандартные образцы стероидных гормонов перечислены в табл. 1. Использовали дигидрофосфат калия (99%, Sigma-Aldrich, США), дитиотреитол (ДТТ) (98%, Sigma-Aldrich, США), гидрокарбонат калия (99.7%, Sigma-Aldrich, США), иодид аммония (99%, Sigma-Aldrich, США), диэтиловый эфир (99%, Fisher Chemical, США), β-глюкуронидазу E. coli K12 (Roche, Германия), N-метил-N-триметилсилил-трифторацетамид (МСТФА) (99%, Macharey-Nagel, Германия), безводный сульфат натрия (99%, Sigma-Aldrich, США), гелий 6.0 (Линде газ Рус, Россия), аргон 6.0 (Линде газ Рус, Россия).

Оборудование. Использовали газовый хроматограф Thermo Trace-1310, оснащенный капиллярной колонкой Agilent HP Ultra-1 (17 м × 0.2 мм, толщина пленки неподвижной жидкой фазы 0.11 мкм) со следующей температурной программой: начальная температура термостата колонок 180°C с последующим нагревом до 235°C со скоростью 4°C/мин c последующей интенсификацией скорости нагрева термостата до 20°C/мин до достижения температуры 310°C. Общая продолжительность анализа составила 22 мин. Масс-спектрометрическое детектирование осуществляли с применением тандемного масс-спектрометрического детектора Thermo TSQ Quantum XLS. Задержка на время элюирования растворителя – 4.25 мин. Температура инжектора – 300°C, температура переходной линии – 300°C, газ-носитель – гелий, скорость потока газа-носителя через колонку – 0.6 мл/мин, температура источника ионизации – 250°С, давление газа-мишени (аргона) в ячейке соударений – 1.5 мТорр. Данные обрабатывали с использованием программного пакета STATISTICA 10 (StatSoft).

Биологические образцы. В исследование были включены 10915 образцов мочи (4402 женских и 6513 мужских) профессиональных спортсменов в рамках программы допинг-контроля 2014 и 2015 гг. В изучаемой выборке 140 женских и 95 мужских проб мочи имели явные признаки деградации в соответствии с действующими критериями ВАДА. Пробы анализировали непосредственно после их доставки в лабораторию организацией, занимающейся пробоотбором, в соответствии с регламентом пробоотбора и транспортировки ВАДА.

Подготовка проб к анализу соответствовала рутинной пробоподготовке, используемой в практике антидопинговых лабораторий [7]. Непосредственно после получения образцов измеряли значения рН и плотности. Пробоподготовка для хромато-масс-спектрометрического исследования состояла из трех основных стадий: гидролиза, экстракции, дериватизации. К 3 мл мочи добавляли 50 мкл раствора дейтерированных внутренних стандартов (табл. 2), 1 мл фосфатного буферного раствора (рН 6.4), содержащего 30 мкл β-глюкуронидазы E. coli K12 и дополнительный внутренний стандарт (ДВС) для оценки воспроизводимости и работоспособности оборудования (метилтестостерон с концентрацией 150 нг/мл) и инкубировали при 57°С. Экстракцию проводили 5 мл диэтилового эфира после добавления 1 мл карбонатного буферного раствора для придания раствору достаточно высокого pH. Для высаливания и более четкого разделения фаз вода–эфир в пробу добавляли 1.5 г сульфата натрия. После тщательного перемешивания в течение 10 мин и центрифугирования (5 мин при 4000 об/мин) пробу охлаждали в криостатической бане при –30°С, верхний слой (эфирный) переливали в чистые пробирки и упаривали досуха в твердотельном нагревателе при 70°С. После охлаждения в пробирку добавляли 50 мкл дериватизирующего раствора (20 мг ДТТ и 15 мг NH₄I на 10 мл МСТФА) и инкубировали в течение 20 мин при 70°С. Реакционную смесь охлаждали и переносили в виалу с силанизированной вставкой объемом 100 мкл.

Линейность диапазона определяемых концентраций позволяет воспользоваться методом ограничивающих растворов. В нижнем калибровочном диапазоне использовали калибратор “низкий”, соответствующий пределу количественного обнаружения (ПКО), в верхнем – “высокий” (табл. 3). Верификацию калибровки проводили с помощью образца контроля качества (КК), содержание аналитов в котором соответствовало рассчитанной на предварительной выборке (100 образцов) медиане маркеров стероидного профиля. Растворы калибраторов готовили на матрице мочи, очищенной от стероидов методом твердофазной экстракции. Допустимым считалось отклонение от приписанных значений КК до 3%. Рассчитанная стандартная неопределенность измерений (u_c) на уровне ПКО и 5-кратном ПКО приведена в табл. 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку процесс биодеградации образцов поливариантен и непредсказуем, при представлении данных целесообразно не только выделение доли подвергшихся деградации образцов относительно общего числа проб, но и указание показателей в соответствии с критериями ВАДА, на основании которых они могут быть признаны деградировавшими (рис. 1).

Рис. 1.

Соотношение общего числа проанализированных образцов к количеству. продеградировавших проб с указанием несоответствующего норме показателя.

Несмотря на то, что в рассматриваемой выборке доля деградировавших образцов невысока, общее количество проб велико и выборка является репрезентативной.

Очевидно, что объективная оценка процесса деградации образцов в отсутствие возможности введения ингибиторов деятельности микроорганизмов или иных компонентов, повышающих стабильность образцов, возможна исключительно с использованием эндогенных соединений, в частности, других андрогенных стероидов и их соотношений, присутствующих в образцах. К такими соединениям относятся 5α-андростандион, тестостерон, андростерон и эпитестостерон, определение которых является обязательным для описания стероидного профиля человека, а также форместан.

На сегодняшний день известно большое количество различных статистических методов анализа, однако при их апробации на больших массивах данных могут возникать ложные корреляции и взаимосвязи между данными, что будет приводить к увеличению числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Таким образом, интересно рассмотрение наиболее распространенных методов статистического анализа данных с целью выявления их ограничений и возможностей при работе с большими выборками данных.

В целях выявления отличий между образцами, подвергшимися деградации, и недеградированными пробами построили диаграммы рассеяния, представленные на рис. 2. Из этого рисунка невозможно сделать однозначный вывод о наличии корреляции между использованными показателями, однако на первый взгляд может показаться, что существует тренд, свидетельствующий об уменьшении концентраций 5α-диол и этиохоланолона в ходе деградации. При детальном рассмотрении диапазона, соответствующего области, в которой лежит большая часть результатов анализа деградировавших проб, не удалось выявить явные взаимосвязи, поэтому приняли решение использовать статистические методы анализа.

Рис. 2.

Диаграммы рассеяния для мужских (а), (б) и женских (в), (г) проб: (⚪) – образцы, в которых не было найдено запрещенных ВАДА соединений, (◻) – признаки деградации по отношению 5β-дион/этиохоланолон, (△) – признаки деградации по pH, (◇) – признаки деградации по pH и отношению 5β-дион/этиохоланолон.

Статистический анализ данных применяли для исследования влияния процесса деградации на профиль основных параметров, контролируемых ВАДА, выявления дополнительных признаков, по которым можно бы было судить о деградации проб, помимо уже установленных, и для оценки эффективности установления факта деградации образцов мочи при сочетании комбинаций различных параметров. Для выявления показателей, наиболее подверженных изменениям в процессе деградации, целесообразным представлялось применение метода главных компонент (МГК). Решение задачи установления факта деградации возможно с применением различных классификационных алгоритмов. Наиболее интересным представляется дискриминантный анализ, преимуществом которого является возможность “визуализации” эффективности разделения проб на группы посредствам канонического анализа, предусматривающего разделение исследуемых групп в двумерном пространстве функций (канонических корней). Одним из условий применения предлагаемых методов статистической обработки данных является нормальность распределения параметров исследуемой выборки с допустимыми умеренными отклонениями. Поэтому на первоначальном этапе оценивали нормальность распределения исследуемых показателей, для чего использовали гистограммы и тест Колмогова–Смирнова. Распределение основного массива показателей было близко к нормальному, однако имело положительную асимметрию. В случае показателей Т, и отношений Т/ЭпиТ и Андро/Т наблюдалось бинормальное распределение. Для нормализации данных предприняли попытку применить степенное преобразование Бокса–Кокса. Распределение большинства переменных удалось привести к нормальному, однако применение данного приема привело к искажению данных, существенному изменению корреляционных связей между показателями и значительному ухудшению производительности построенных моделей, вследствие чего массив данных подвергали статистической обработке без предварительной нормализации. Учитывая возможные ограничения, связанные с использованием описанных выше статических методов, для анализа исследуемого массива данных целесообразным представлялось применение более сложных методов, использование которых не предусматривает требований к распределению данных и ориентированных на обработку больших массивов данных, в частности, нейронных сетей.

МГК предусматривает факторный анализ, позволяющий оценить значимость факторов и их вклад в объяснение общей вариации посредствам графиков “каменистой осыпи” (рис. 3). Как видно, основной вклад в объяснение общей вариации вносят первые четыре фактора, на долю которых приходится 68–69% общей вариации.

Рис. 3.

Графики “каменистой осыпи”: (а) – мужчины, (б) – женщины.

Наибольшие корреляции показателей с факторами наблюдались в случае следующих групп показателей: 1 группу составил ряд стероидов, обычно не используемых для выявления деградации; 2 группу – соотношения этих показателей; в 3 группу в мужской популяции вошло одно соотношение 5α-диол/ЭпиТ, в женской – 5α-диол/ЭпиТ и Т/ЭпиТ; в 4 группу вошли основные показатели, по которым на сегодняшний день оценивают деградацию пробы: pH и 5α-андростан-3,17-дион (табл. 4).

Для оценки эффективности выявления факта деградации строили классификационные модели с применением дискриминантного анализа. Модели были построены в три этапа: на первом этапе оценивали эффективность выявления факта деградации с применением стандартных параметров, по которым судят о деградации (pH и 5β-дион). Затем оценивали способность совокупности остальных показателей, мониторинг которых проводится в рамках контроля стероидного профиля, и их соотношений выявлять продеградировавшие пробы. На завершающем этапе строили модели, сочетающие комбинацию как основных, так и остальных показателей.

На рис. 4а, 4б представлена визуализация распределения проб в зависимости от наличия деградации и ее характера, построенная исключительно на основе параметров, по которым судят о деградации (pH и 5β-дион). Значения лямбды Уилкса позволяет оценить качество построенных моделей. Значения данного показателя изменяются в пределах от 0 до 1 и чем ближе значения к нулю, тем лучше качество модели. В случае мужчин значение лямбды Уилкса составило 0.298, женщин – 0.482, что свидетельствует об относительно неплохом качестве модели. Если судить исключительно по правильности отнесения нормальных проб и деградированных вне зависимости от причин деградации, то в мужской популяции 3 пробы из 6418 нормальных были отнесены к деградированным по pH, и 4 из 18 проб деградированных по 5β-диол были отнесены к нормальным; в женской популяции из 4262 нормальных проб 12 было отнесено к деградированным по pH, а 14 из 32 проб, деградированных по 5β-диол, были отнесены к нормальным. Остальные ошибки классификации связаны с неправильным указанием причины деградации, что не столь существенно для решения общей поставленной задачи.

Рис. 4.

Диаграммы рассеяния канонических значений для образцов мочи в зависимости от наличия деградации и ее характера на основании различных параметров: 1) pH и 5β-диол у мужчин (а) и женщин (б); 2) все параметры, кроме pH и 5β-диол у мужчин (в) и женщин (г); 3) все параметры у мужчин (д) и женщин (е): (⚪) – образцы, в которых не было найдено запрещенных ВАДА соединений, (◻) – признаки деградации по отношению 5β-дион/этиохоланолон, (∆) – признаки деградации по pH, (◇) – признаки деградации по pH и отношению 5β-дион/этиохоланолон.

При рассмотрении всех параметров, за исключением основных (pH и 5β-дион), значение лямбды Уилкса для мужчин составило 0.904, а для женщин – 0.883, что свидетельствует о значительном ухудшении качества модели. Таким образом, можно сделать вывод, что выявление деградации на основании показателей стероидного профиля, контролируемых ВАДА, без основных показателей (pH и 5β-дион) не представляется возможным, и деградация незначительно отражается на основных показателях (рис. 4в, 4г). Анализ значений параметров р-критерия, лямбды Уилкса и частной лямбды в модели позволил выявить компоненты, вклад которых в классификацию наиболее значимый (табл. 5).

На основании полученных результатов в модели, построенные на pH и 5β-дион, добавили значимые параметры, выявленные на предыдущем этапе для популяций мужчин и женщин. Наблюдали уменьшение значения параметра лямбды Уилкса по сравнению с моделью, построенной исключительно на pH и 5β-дион: оно составило 0.284 для мужчин и 0.467 для женщин, однако улучшения оказались незначительными (рис. 4д, 4е). При оценке значимости факторов их вклад может быть неочевиден, поэтому из исходной модели исключили заведомо весомые показатели, что позволило выявить наиболее чувствительные к процессу деградации показатели. Однако для получения комплексной оценки к вновь выявленным критериям добавили уже известные ранее рН и 5β-диол с последующим построением итоговой модели (табл. 5). Интересно, что в мужской популяции параметры Андро, Т и 5β-диол теряют свою значимость на фоне pH и 5β-дион, а также значимость всех остальных параметров на фоне pH и 5β-дион значительно снижается.

На основании полученных из дискриминантного анализа данных построили по две нейросетевые модели типа многослойный персептрон с одним скрытым слоем для каждой из исследуемых популяций: включающие только основные показатели pH и 5β-дион и включающие основные показатели в совокупности с наиболее значимыми показателями для мужской и женской популяций. Для обучения нейронных сетей применяли алгоритм Бройдена−Флетчера−Гольдфар-ба−Шанно. Выборку предварительно разделили на три части: обучающую, контрольную и тестовую (60, 10 и 30%). Оптимизация параметров модели осуществляется при обучении, где для проверки точности обучения используется контрольная выборка. После завершения процесса обучения сеть тестируется на независимом тестовом наборе данных. Исследованы различные топологии нейронных сетей и выбраны параметры моделей, обеспечивающие наилучшую производительность: для женской популяции наилучшими оказались сети с логистической функцией активации нейронов скрытого слоя и softmax (обобщение логистической функции для многомерного случая) – выходного слоя, для мужской популяции – гиперболическая функция активации нейронов скрытого слоя и softmax – выходного. Количество нейронов на выходном слое соответствовало количеству исследуемых групп (4). Количество нейронов в скрытом слое варьировалось для каждой модели и составило для основных параметров в мужской популяции – 4, в женской – 3, для основных параметров с добавлением наиболее значимых показателей в мужской популяции – 9, в женской – 7.

В табл. 6 приведены матрицы классификаций моделей, построенных с применением дискриминантного анализа и нейронных сетей на всем массиве данных. По горизонтали отображено количество случаев, задействованных в построении модели, по вертикали – количество случаев, отнесенных в группу соответствующим классификационным алгоритмом.

Задача верного установления факта деградации является основной, поэтому в первую очередь обращали внимание на ошибки, связанные с отнесением продеградированных проб к чистым и наоборот. С данной точки зрения добавление параметров в модель приводит к увеличению таких ошибок при использовании любого метода классификации, что негативно отражается на решении основной задачи, однако в женской популяции можно наблюдать улучшение качества классификации относительно причины деградации. При сравнении используемых алгоритмов классификации видно, что нейронные сети позволяют правильно классифицировать большее число наблюдений, а также наблюдается большая устойчивость модели при добавлении других факторов (например: количество неправильно классифицированных чистых и продеградированных проб увеличивается с 7 до 20 в случае дискриминантного анализа, а при использовании нейронных сетей – с 4 до 8), однако дискриминантный анализ позволяет визуализировать качество дискриминации, что удобно для представления данных. Использование комбинации статистических методов позволило наиболее полно проанализировать данные с точки зрения группировки исследуемых показателей, классификации данных на основе разных показателей и визуализации полученных результатов.

* * *

Таким образом, деградация пробы сказывается не только на рН и концентрации 5β-диона, но и других компонентах, представленных в табл. 5, однако использовать их в качестве маркеров деградации пробы не представляется возможным, так как их изменение является недостаточно значимым, чтобы надежно описывать протекающий процесс как у мужчин, так и у женщин по сравнению с основными весомыми показателями. Следует отметить, что исключение их из модели приводит к ухудшению ее прогностической способности. Значимость соотношения Андро/Этио в табл. 5 может быть обусловлена высоким уровнем значимости в модели самого Андро. Представленные модели также позволяют визуализировать и эффективно классифицировать результаты, особенно с применением дискриминантного анализа, в то время как применение нейросетей может способствовать автоматизации и повышению надежности процесса потокового анализа.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 21-13-00240) с использованием оборудования ЦКП “Эколого-аналитический центр” ФГБОУ ВО КубГУ.