Журнал аналитической химии, 2023, T. 78, № 4, стр. 365-375

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Растительный материал. Объекты исследования – цветки ромашки аптечной (Matricаria chamomilla L.) производителя “Родные травы” (республика Адыгея, партия 250321); цветки ромашки (Chamomillae flores) торговых марок “ФармаЦвет” (Московская обл., Красногорск, партия 210820), “Грин Сайд” (Алтайский край, Барнаул, партия 02) и “Фитофарм” (Краснодарский край, Анапа, серия 010215). Также осуществляли сбор ромашки в стадии цветения на территории г. Краснодара (Краснодарский край). Растительное сырье предварительно измельчали и просеивали, выделяя фракции размером 0.5–1.0 мм, затем растительный материал усредняли путем перемешивания [8].

Реактивы и стандартные образцы. Использовали ацетонитрил (HPLC-S, Biosolve BV, Нидерланды), муравьиную кислоту (85%, ЛенРеактив, Россия), этанол (ректифицированный, высшей очистки) и метанол х.ч. (Вектон, Россия). Деионизованную воду с удельным сопротивлением 18.2 МОм⋅см (25°С) получали на установке Milli-Q-UV (Millipore, Франция).

Для идентификации аналитов использовали стандартные образцы хлорогеновой кислоты, лютеолин-7-О-гликозида, транс-феруловой кислоты, цикориевой кислоты и апигенина (Sigma-Aldrich, Германия).

Экстракция фенольных компонентов из ромашки аптечной. Извлечение фенольных соединений из ромашки аптечной проводили с учетом рекомендаций Государственной Фармакопеи РФ (ГФ) [8], традиционными и современными способами с интенсификацией процесса ультразвуком и микроволновым излучением, а также при повышенных давлении и температуре.

Для извлечения ФС из ромашки аптечной рекомендованным ГФ методом навеску пробы (1.0000 г) помещали в колбу со шлифом емк. 250 мл, прибавляли 70%-ный этанол (100 мл). Колбу с содержимым присоединяли к обратному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 45 мин, периодически встряхивая. Затем колбу с экстрактом охлаждали до комнатной температуры, фильтровали раствор через вату в мерную колбу емк. 100 мл, объем раствора доводили до метки 70%-ным этанолом. Перед хроматографическим анализом полученный экстракт фильтровали через фильтр с диаметром пор 45 мкм.

Для экстракции ФС мацерацией из ромашки аптечной навеску пробы (1.0000 г) помещали в коническую колбу со шлифом емк. 250 мл, добавляли растворитель (100 мл) и оставляли отстаиваться при комнатной температуре. В качестве растворителя использовали 70%-ный этанол. Перед хроматографическим анализом полученный экстракт фильтровали через фильтр с диаметром пор 45 мкм.

Для извлечения ФС ромашки аптечной также готовили настой. Для этого навеску измельченной пробы (0.5000 г) помещали в коническую колбу с притертой пробкой объемом 100 мл и заливали деионизованной водой (25 мл) при ~95°С. Перед хроматографическим анализом полученный экстракт фильтровали через фильтр с диаметром пор 45 мкм.

Для проведения ультразвуковой экстракции (УЗЭ) ФС из ромашки аптечной навеску сухой измельченной пробы (0.5000 г) помещали в коническую колбу с притертой пробкой объемом 100 мл. В качестве растворителя использовали водно-спиртовые смеси разного состава (25 мл). Экстракция проходила в ультразвуковой ванне УЗВ–4.0/1 ТТЦ (Сапфир, Россия) с частотой ультразвукового излучения 35 кГц в течение 30 мин. После фильтрования через вату в мерную колбу емк. 25 мл объем раствора доводили до метки растворителем. Перед хроматографическим анализом полученный экстракт фильтровали через фильтр с диаметром пор 45 мкм.

Микроволновую экстракцию (МВЭ) ФС из ромашки аптечной проводили с использованием микроволновой системы ETHOS EX (Milestone, Италия). Навеску сухой измельченной пробы (0.5000 г) помещали в ячейку-экстрактор, куда добавляли растворитель (25 мл). В качестве растворителя использовали водно-спиртовые смеси различного состава. Продолжительность экстракции составляла 30 мин при мощности микроволнового излучения 300 Вт и температуре 75°С. Далее экстракт фильтровали через вату в мерную колбу емк. 25 мл и доводили объем раствора до метки растворителем. Перед хроматографическим анализом экстракт пропускали через фильтр с диаметром пор 45 мкм.

Экстракцию ФС из ромашки аптечной в динамических условиях при повышенных температуре и давлении (субкритическая экстракция, СКЭ) проводили на экспериментальной установке, подробно описанной в работе [26]. Экстрагент (деионизованная вода/водно-спиртовые смеси) подавали насосом от жидкостного хроматографа LC20AD (Shimadzu, Япония), в качестве ячейки-экстрактора использовали стальной корпус хроматографической колонки размером 150 × 4.6 мм, которую подключали к установке двумя стальными капиллярами. Для предотвращения закипания экстрагента и поддержания требуемого давления в системе использовали ограничитель давления P-455 (Upchurch Scientific, США). Высушенную и измельченную навеску пробы (0.2000 г) помещали в ячейку-экстрактор в печи термостата. Экстрагент предварительно продували азотом для удаления растворенного кислорода и с помощью насоса заполняли им систему. Затем останавливали поток экстрагента и включали нагрев термостата. По достижении термостатом заданной температуры выдерживали систему в течение 10 мин при постоянной температуре и остановленном потоке экстрагента, после чего его подавали в систему со скоростью 1 мл/мин. Давление в системе по показаниям манометра насоса составляло 80–150 атм. На выходе собирали 10 мл экстракта в стеклянные емкости. Перед хроматографическим анализом экстракт пропускали через фильтр с диаметром пор 45 мкм.

ВЭЖХ-определение фенольных соединений с диодно-матричным и масс-спектрометрическим детектированием в экстрактах ромашки аптечной. ВЭЖХ-определение ФС в полученных экстрактах проводили на хроматографе LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония), состоящем из дегазатора DGU-20A₅, насоса LC20AD, автоматического дозатора SIL-20A, термостата колонок CTO-20AC, спектрофотометрического детектора на основе диодной матрицы SPD-M20A, масс-спектрометрического детектора LCMS2010EV. Фенольные соединения разделяли на хроматографической колонке Luna C18 100А, 250 × 2.0 мм, 5 мкм (Phenomenex, США) с предколонкой C18 4 × 2.0 мм, 5 мкм (Phenomenex, США) в режиме градиентного элюирования. Подвижной фазой являлась смесь ацетонитрил (А)–0.1%-ная муравьиная кислота (В): 0.01–2 мин от 95 до 90% В, 2–10 мин от 90 до 80% В, 10–18 мин от 80 до 70% В, 18–28 мин от 70 до 10% В, 28–30 мин 10% В, 30–31 мин от 10 до 95% В. Скорость потока подвижной фазы составляла 0.40 мл/мин при температуре термостата колонки 40°С и объеме вводимой пробы 5 мкл. Спектрофотометрическое детектирование на диодно-матричном детекторе осуществляли в диапазоне длин волн 190–800 нм. При МС-детектировании веществ применяли ионизацию электрораспылением: напряжение интерфейса – 3.5 кВ, напряжение на скимере – 1.5 В, температура ионного источника – 180°C, скорость потока азота – 1.5 л/мин, скорость сканирования масс-спектра 2000 а.е.м./с, диапазон сканируемых масс 120–700 m/z. Анализ проводили в режиме отрицательной ионизации. Сбор и последующую обработку первичных данных осуществляли с помощью программного обеспечения LCMS Solution (Shimadzu, Япония).

Фенольные соединения идентифицировали сопоставлением времен удерживания, спектров поглощения и масс-спектров с аналогичными характеристиками стандартов индивидуальных соединений, приведенными в литературе (табл. 2). Пример хроматограммы водно-спиртового экстракта ромашки аптечной, полученного по методике Фармакопеи РФ, в оптимальных условиях хроматографирования представлен на рис. 1.

Рис. 1.

ВЭЖХ-хроматограмма этанольного экстракта цветов ромашки аптечной, полученного по методике Фармакопеи РФ, в режиме диодно-матричного и масс-спектрометрического детектирования: 1 – хлорогеновая кислота, 2 – гликозид феруловой кислоты I, 3 – гликозид феруловой кислоты II, 4 – лютеолин-7-О-глюкозид, 5 – дикофеилхинная кислота, 6 – цикориевая кислота, 7 – апигенин-7-глюкозид, 8 – апигенин.

При оценке содержания ФС в экстрактах ромашки аптечной использовали рассчитанные метрологические характеристики (табл. 3). Для всех соединений получили градуировочные зависимости, диапазоны линейности, пределы определения и обнаружения с использованием соответствующих стандартных образцов в 70%-ном этаноле. Все градуировочные кривые строили по данным шести параллельных измерений; в каждом случае проводили не менее трех параллельных определений одной концентрации раствора ФС. Содержание гликозидов феруловой кислоты в сырье определяли по градуировочной зависимости, полученной для феруловой кислоты, умножая на отношение молекулярной массы аналита к молекулярной массе феруловой кислоты ввиду их структурного подобия и схожести коэффициентов поглощения [28]. Аналогично рассчитывали содержание дикофеилхинной кислоты по градуировочной зависимости цикориевой кислоты, апигенин-7-глюкозида – по апигенину.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимальный состав растворителя для экстракции фенольных соединений из цветов ромашки аптечной. Правильный выбор растворителя позволяет повысить эффективность извлечения ФС из ромашки аптечной. Учитывая накопленный опыт [26, 29] и литературные данные [30], сравнили эффективность извлечения фенольных соединений из ромашки аптечной при УЗЭ и МВЭ с использованием водно-этанольных и водно-метанольных смесей с различной концентрацией спирта (30, 50, 70 и 100%, по объему). Эффективность извлечения компонентов оценивали по суммарному содержанию ФС: лютеолин-7-О-глюкозида, гликозидов феруловой кислоты, апигенин-7-глюкозида, апигенина, хлорогеновой, дикофеилхинной и цикориевой кислот (рис. 2). Из полученных диаграмм видно, что эффективность 70%-ных водно-метанольной и водно-этанольной смесей при извлечении суммы ФС из растительного материала способами УЗЭ и МВЭ сопоставима. С другой стороны, 70%-ный этанол – более экологичный растворитель и перспективен для дальнейшего практического использования в медицинской практике, поэтому его выбрали для дальнейших исследований.

Рис. 2.

Суммарное содержание фенольных соединений в экстрактах ромашки аптечной, полученных под воздействием ультразвука и микроволнового излучения.

Эффективность экстракции фенольных соединений из ромашки аптечной различными способами. Изучали и сравнивали различные способы экстракции компонентов: экстракцию по Государственной Фармакопее РФ [8], мацерацию, настаивание, ультразвуковую, микроволновую и субкритическую экстракцию. Параметры каждого из способов экстракции оптимизировали по суммарному содержанию ФС в экстрактах ромашки.

Для определения оптимального времени экстрагирования строили зависимости суммарного содержания ФС от времени проведения мацерации, настаивания и УЗЭ (рис. 3). В качестве экс-трагентов для мацерации и УЗЭ использова-ли 70%-ный этанол, а для экстракции настаиванием – свежекипяченую деионизованную воду. Для построения кинетической кривой извлечения ФС из ромашки различными способами отбирали аликвоты экстракта объемом 1 мл через заданный промежуток времени.

Рис. 3.

Зависимость суммарного содержания фенольных соединений в экстракте ромашки аптечной от времени мацерации (а), настаивания (б) и воздействия ультразвука (в).

Суммарная концентрация ФС в экстракте мацерацией достигала максимальных значений в течение 1440 мин (24 ч) и далее оставалась неизменной (рис. 3а). В случае извлечения аналитов настаиванием (рис. 3б), концентрации соединений при экстрагировании сырья в течение свыше 15 мин не менялись. Более продолжительное время экстракции данным способом способствовало деградации некоторых фенольных соединений, например, лютеолин-7-О-глюкозида и дикофеилхинной кислоты. При настаивании практически не извлекается апигенин, так как агликоны флавоноидов нерастворимы в воде [31, 32]. Кинетическая кривая УЗЭ аналитов из ромашки аптечной (рис. 3в) позволила установить, что суммарное содержание ФС достигает максимальных значений (9.1 ± 0.1 мг/г) при экстракции в течение 30 мин непрерывного воздействия ультразвуком.

Субкритическая экстракция широко используется для извлечения различных классов соединений, в том числе фенольных, из лекарственного растительного сырья. При этом на эффективность извлечения компонентов влияют температура и состав используемого экстрагента. Для установления оптимальных значений данных параметров исследовали зависимость суммарного содержания ФС в экстракте ромашки от температуры СКЭ с использованием различных экстрагентов (рис. 4). В качестве экстрагентов использовали деионизованную воду [11, 24], 50 и 70%-ный этанол [24]. Температуру варьировали в диапазоне 100–165°С с шагом в 15°С. Эффективность субкритического способа экстракции для извлечения ФС также оценивали по суммарному содержанию ФС в экстракте. Как известно [11, 24], применение воды и 70%-ной водно-этанольной смеси в качестве экстрагентов для СКЭ ФС различных классов из растительного материала достаточно эффективно. При 120°С эффективность извлечения суммы аналитов водой и 70%-ным этанолом максимальна (6.6 ± 0.2 и 11.7 ± 0.3 мг/г соответственно), но дальнейшее ее повышение приводит к снижению концентрации ФС, что обусловлено их термической деградацией (рис. 4). С учетом полученной зависимости можно заключить, что оптимальная температура СКЭ ФС из ромашки аптечной деионизованной водой и 70%-ным этиловым спиртом составляет 120°С.

Рис. 4.

Зависимость суммарного содержания фенольных соединений в экстракте ромашки аптечной от температуры субкритической экстракции различными экстрагентами.

По данным [24], использование 50%-ного этанола в качестве экстрагента для СКЭ ФС из ромашки аптечной считается предпочтительным. В связи с этим изучили зависимость суммарного содержания ФС ромашки аптечной от температуры СКЭ 50%-ным этанолом. Полученные зависимости показывают целесообразность проведения СКЭ при более низких температурах (рис. 4). Строили зависимость суммарного содержания ФС от температуры в диапазоне от 75 до 135°С. Наибольшая суммарная концентрация ФС (11.1 ± ± 0.7 мг/г) в экстракте наблюдается при 100°С. Отметим, что эффективность извлечения ФС СКЭ 70%-ным этанолом при 120°С и 50%-ным этанолом при 100°С сопоставима.

Содержания ФС в экстрактах ромашки аптечной, полученные в оптимальных условиях для различных способов экстракции, представлены в табл. 4. Можно отметить, что выбор способа экстракции неоднозначен, и во многом он определяется поставленными задачами. Тем не менее отметим ряд отличий. Использование МВЭ для экстракции ФС малоэффективно, так как концентрации хлорогеновой кислоты и гликозидов феруловой кислоты имеют наименьшие значения, что, вероятно, связано с их деградацией под действием температуры и микроволнового излучения.

Сравнительный анализ способов извлечения (ГФ, мацерация, настаивание и СКЭ) по суммарному содержанию ФС показывает, что по своей эффективности они сопоставимы. Эффективность извлечения выбранных компонентов свежекипяченой деионизованной водой при настаивании оказалась сопоставима со способами, в которых в качестве экстрагентов использовали водно-спиртовые растворы. Однако, как отмечено ранее, водные системы не извлекают агликоны флавоноидов – достаточно ценные соединения, и это значительно снижает перспективность практического использования такой процедуры для экстракции ФС из ромашки аптечной. Содержания компонентов, полученных при мацерации и настаивании различными растворителями, сопоставимы, несмотря на схожий процесс их осуществления (табл. 4).

Суммарное содержание извлеченных при УЗЭ ФС несколько выше, чем при МВЭ, и ниже, чем при других способах экстракции (табл. 4). Однако процедура УЗЭ более экспрессна и позволяет оперативно проводить предварительный скрининг и идентификацию ФС, характерных для экстрактов ромашки аптечной.

Анализ экстрактов цветов ромашки аптечной различных торговых марок. Данные о качественном и количественном составе растительного материала используют при установлении качества выпускаемой продукции. Однако содержание активных компонентов в ромашке аптечной в значительной степени может зависеть от географических особенностей произрастания лекарственного растительного сырья, условий выращивания и хранения [21, 27]. В табл. 5 приведены содержания ФС в полученных при УЗЭ экстрактах образцов ромашки аптечной различных производителей, а также в собранном самостоятельно на территории г. Краснодара образце.

Содержания ФС в образцах торговых марок “Грин Сайд” и “Фитофарм” близки между собой как по концентрациям индивидуальных соединений, так и по суммарному содержанию аналитов. Такое сходство, вероятно, связано с использованием одного и того же растительного материала со схожими климатическими условиями его выращивания. Отметим высокое содержание хлорогеновой (2.0 ± 0.1 мг/г), дикофеилхинной (1.2 ± ± 0.3 мг/г) и цикориевой кислот (0.12 ± 0.01 мг/г), а также лютеолин-7-О-глюкозида (0.64 ± 0.05 мг/г) в экстракте образца “Родные травы” по сравнению с экстрактами ромашки аптечной других компаний.

Содержания ФС в экстрактах ромашки аптечной из полученного при самостоятельном сборе растительного материала сильно отличаются от их концентраций в других образцах. Показатель суммы ФС в данном образце (14.9 ± 0.5 мг/г) определяет дикофеилхинная кислота (12.0 ± 0.4 мг/г). В других образцах максимальное содержание ФС определяется концентрациями гликозидов феруловой кислоты (около 60%), что согласуется с данными [21, 27]. Кроме этого, содержание апигенина и цикориевой кислоты в образце, собранном на территории г. Краснодара, на порядок выше, чем в других образцах. Вероятно, что данный образец содержал ромашку других видов [27], однако это требует дальнейших исследований и подтверждения.

* * *

Изучены содержания нативных форм некоторых ФС в водных и водно-спиртовых экстрактах цветов ромашки аптечной (Matricаria chamomilla L.), полученных мацерацией, настаиванием, ультразвуковым, микроволновым, фармакопейным и субкритическим способами. Эффективность применения всех рассмотренных способов экстракции, за исключением ультразвуковой экстракции, по суммарному извлечению фенольных соединений из растительного сырья сопоставима. Определены суммарные содержания и концентрации индивидуальных фенольных соединений в экстрактах цветов ромашки аптечной различных производителей. Максимальное суммарное содержание фенольных соединений (10.1 мг/г) наблюдали в экстракте ромашки аптечной торговой марки “ФармаЦвет”.

Работа выполнена в рамках Госзадания Минобрнауки РФ (проект № FZEN-2020-0022) с использованием научного оборудования ЦКП “Эколого-аналитический центр” Кубанского госуниверситета.