Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 1, стр. 88-95

ВВЕДЕНИЕ

Генная терапия – это один из перспективных методов лечения наследственных и приобретенных заболеваний человека на молекулярном уровне, который активно развивается в последние годы [1, 2]. Механизм ее действия основан на доставке экзогенных терапевтических нуклеиновых кислот в клетки-мишени. Как правило, генно-терапевтические лекарственные средства состоят из действующего вещества – нуклеиновых кислот (плазмидные ДНК, малые интерферирующие РНК, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, аптамеры, ДНК-энзимы) и транспортного средства, обеспечивающего их доставку в клетки-мишени. Для достижения максимального терапевтического эффекта нуклеиновых кислот необходимо создать транспортные средства, которые будут эффективно доставлять генетический материал в клетку, оказывая при этом минимальное токсическое воздействие на организм. Катионные липосомы являются одной из перспективных систем доставки, обладающей рядом преимуществ по сравнению с вирусными системами: они не инфекционны, не иммуногенны, способны переносить короткие и протяженные нуклеиновые кислоты и защищать их от инактивации ферментами [3–5].

На сегодняшний день известны различные типы катионных липосом, обеспечивающих доставку нуклеиновых кислот в клетки. Причем разные нуклеиновые кислоты нуждаются в создании индивидуальных липосом с определенными физико-химическими параметрами. Для решения этих задач необходима разработка оптимальных методов получения катионных липосом и их комплексов с нуклеиновыми кислотами, обеспечивающих высокую эффективность и стабильность полученных частиц.

Физико-химические характеристики липосом (размер, дзета-потенциал) значительно отличаются в зависимости от липидного состава и способа получения липосом [6, 7]. Размер липосом может варьировать от 25 нм до 2.5 мкм. Однако оптимальный размер наночастиц, предназначенных для системного введения в организм, составляет от 10 до 100 нм, поскольку более крупные частицы захватываются в организме ретикулоэндотелиальной системой, а небольшие частицы (менее 10 нм) быстро выводятся почками [8]. Одним из ключевых параметров, определяющих эффективность доставки катионных липосом в клетки, является их заряд, который должен быть положительным и обеспечивать взаимодействие липосом как с отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой, так и последующее взаимодействие положительно заряженных комплексов c отрицательно заряженной мембраной эукариотических клеток [9, 10]. Кроме того, эффективность доставки напрямую зависит от способности катионных липосом обеспечивать компактизацию и полное включение нуклеиновых кислот в состав комплексов.

Целью нашего исследования была оптимизация технологии получения катионных липосом, которая включала исследование их физико-химических характеристик и биологической активности в зависимости от метода получения, типа водной фазы и ряда технологических параметров получения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве компонентов катионных липосом были использованы поликатионный липид 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (2Х3) (рис. 1) и липид-хелпер 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), который работает как коадъювант трансфекции [11–15]. Для формирования липосом липиды 2Х3 и DOPE были взяты в мольном соотношении 1 : 1. В качестве водной фазы использовались стерильная вода или раствор Рингера.

На первом этапе был проведен выбор способа получения липосом и типа водной фазы, поскольку оба эти фактора напрямую влияют на физико-химические и биологические свойства липосом. Липосомы получали двумя способами: ультразвуковой (УЗ) обработкой и экструзией [16]. Первый способ включал в себя УЗ обработку липидной дисперсии, полученной в результате гидратации липидной пленки, второй способ – продавливание (экструзию) липидной дисперсии через поликарбонатные фильтры с размером пор 100 нм. Было получено три образца катионных липосом, а именно: образец (I) приготовлен в стерильной воде методом УЗ обработки, образец (II) приготовлен в стерильной воде методом экструзии, образец (III) приготовлен в растворе Рингера методом УЗ обработки.

С помощью метода динамического лазерного светорассеяния были определены размеры и дзета-потенциалы катионных липосом (I)–(III). Липосомы (I) имели средний размер 85 ± 1 нм, липосомы (II) – 154 ± 2 нм. Индексы полидисперсности этих образцов свидетельствуют об образовании основной фракции частиц с узким распределением по размерам (табл. 1). Образец (III) характеризовался наличием двух фракций частиц (80 ± 24 и 329 ± 66 нм), при этом относительное количество частиц меньшего размера значительно превышало количество частиц большего размера (71.5%). Все липосомы (I)–(III) были положительно заряжены (табл. 1). Разница в значениях дзета-потенциалов связана с ионной силой растворов, в которых были приготовлены липосомы.

Коллоидная стабильность липосом в процессе длительного хранения является важным параметром, влияющим на эффективность доставки нуклеиновых кислот в клетки [17]. Согласно мониторингу физико-химических характеристик липосом, образцы (I), (II) оставались стабильными в течение 46 недель. Для липосом (III) наблюдалось увеличение диаметра частиц фракции большего размера до 700 нм, а также увеличение значений индекса полидисперсности в период с 6 по 12 неделю. Нестабильность полученного образца может объясняться агрегированием частиц, обусловленным наличием неорганических солей в растворе Рингера.

Согласно данным трансмиссионной электронной микроскопии, липосомы (I), полученные УЗ обработкой, имели сферическую форму; средний диаметр частиц составлял около 90 нм (рис. 2). Экструзионные липосомы (II) имели средний диаметр около 150 нм. Липосомы (III), приготовленные в растворе Рингера, представляли собой частицы неопределенной формы и размера, при этом наименьший размер частиц составлял около 30 нм.

Для оценки биологической активности полученных образцов липосом необходимо было определить соотношение компонентов комплексов N/P (отношение количества аминогрупп катионного липида к количеству фосфатных групп нуклеиновой кислоты), при котором происходит полное включение нуклеиновой кислоты в комплекс. Способность катионных липосом образовывать комплексы с различными типами нуклеиновых кислот была изучена с помощью метода задержки в геле (гель-электрофорез в нативных условиях) и флуоресцентной спектроскопии [18].

Согласно полученным данным (рис. 3), при соотношении N/P, равном 1/1, не более 50% олигодезоксирибонуклеотида (см. Эксперим. часть) включается в комплекс с катионными липосомами (I) и (II). Увеличение количества липосом (I) и (II) в составе комплекса (N/P = 2/1 и 4/1) приводит к полному включению олигонуклеотида в его состав. В случае липосом (III) включение олигонуклеотида в комплексы при всех использованных соотношениях N/P было лишь незначительным. Аналогичные результаты были получены при исследовании связывания катионных липосом (I)–(III) с плазмидной ДНК (пДНК) (данные не приведены).

При взаимодействии липосом (I)–(III) с ДНК тимуса теленка долю свободной нуклеиновой кислоты определяли методом флуоресцентной спектроскопии. В качестве интеркалирующей метки использовали этидий бромид. Проведенный анализ показал, что эффективность включения ДНК в состав комплекса определяется как типом препарата, так и соотношением зарядов (N/P). При соотношении N/P = 1/2 и 1/1 количество этидий бромида, связанного с ДНК, оставалось значительным, что свидетельствует о неполном связывании ДНК с липосомами (рис. 4). Увеличение количества катионных липосом приводило к вытеснению метки липосомами и тушению флуоресценции. Для образцов (I) и (II) полное включение ДНК в состав комплексов наблюдалось при соотношении N/P = 1.5/1, в то время как для липосом (III) взаимодействие с ДНК при всех исследуемых соотношениях N/P было незначительным.

Оценку трансфицирующей активности катионных липосом (I)–(III) проводили в ходе эксперимента по доставке малой интерферирующей РНК (siРНК), мишенью которой является мРНК гена LIVIN, в клетки карциномы НТ-29. Продукт гена LIVIN – один из ингибиторов апоптоза – экспрессируется в злокачественных опухолях и рассматривается в качестве перспективной мишени для таргетной терапии с использованием siРНК [19]. Анализ эффективности доставки показал, что при соотношениях N/P, равных 4/1 и выше (рис. 5), при которых зафиксировано полное включение нуклеиновых кислот в состав комплексов по данным электрофореза и флуоресцентной спектроскопии, наибольшей активностью обладали катионные липосомы (I). Они доставляли siРНК в 90% клеток. Эффективность липосом (II) и (III) была в 2–4 раза ниже, несмотря на способность липосом (II) образовывать комплексы с нуклеиновой кислотой. Дальнейшие исследования проводили с липосомами (I), которые проявили наибольшую трансфицирующую активность среди образцов липосом (I)–(III).

На втором этапе работы проводили оценку влияния на физико-химические характеристики образующихся частиц таких технологических параметров получения липосом (I) как температура и время УЗ обработки. Мы показали, что увеличение времени озвучивания от 5 до 20 мин приводит к уменьшению среднего диаметра липосом от 147 до 90 нм (рис. 6а). Для дальнейшей оптимизации нами были выбраны два режима озвучивания: 10 и 15 мин. Увеличение температуры озвучивания в пределах одного временного интервала, начиная с 65°С, не влияло на размер образующихся липосом, а наименьшим размером обладали липосомы, приготовленные УЗ обработкой в течение 15 мин (рис. 6б, в). С помощью трансмиссионной электронной микроскопии была установлена и подтверждена морфология катионных липосом (рис. 6г), которые представляли собой сферические частицы диаметром от 30 до 90 нм.

Для оценки влияния времени и температуры озвучивания на трансфицирующую активность катионных липосом проводили эксперименты по доставке плазмидной ДНК (пДНК) pEGFP-C2, кодирующей усиленный зеленый флуоресцентный белок, в клетки НЕК 293, а также по доставке siРНК, направленной к мРНК ЕGFP, в трансгенные клетки BHK IR780, стабильно экспрессирующие усиленный зеленый флуоресцентный белок. Эффективность доставки пДНК или siРНК анализировали с помощью проточной цитометрии, в первом случае определяя количество EGFP-положительных клеток в популяции, то есть тех клеток, в которые была доставлена пДНК и прошла экспрессия белка EGFP, и средние значения интенсивности флуоресценции клеток в популяции, которые соответствуют уровню экспрессии EGFP. В случае доставки siРНК, эффективность доставки определяли по уровню подавления экспрессии EGFP по сравнению с контролем – необработанными клетками BHK IR780. Трансфицирующую активность липосом сравнивали с активностью коммерческого препарата Lipofectamine 2000 (Lf 2000, Invitrogene Inc.).

Эффективность трансфекции клеток комплексами пДНК с катионными липосомами, полученными при различных условиях, увеличивалась с ростом соотношения N/P (рис. 7а, б). Однако в пределах одного соотношения N/P образцы липосом (Iа), (Iб), (Iв), (Iг), (Iд) (для расшифровки см. подпись к рис. 7) показали сходные или превосходящие Lipofectamine 2000 результаты.

При изучении эффективности доставки siРНК также было выявлено, что подавление экспрессии белка усиливалось с ростом количества липосом в составе комплекса. При этом варьирование времени и температуры озвучивания при получении катионных липосом не привело к значительному изменению эффективности трансфекции (рис. 7в).

Таким образом, нами получены образцы катионных липосом на основе катионного липида (2Х3) и нейтрального липида (DOPE) и показано, что физико-химические характеристики и биологические свойства катионных липосом зависят от способа их получения и типа водной фазы. Наименьшим размером и дзета-потенциалом обладали катионные липосомы (I), полученные в стерильной воде УЗ обработкой. Результаты трансфекции эукариотических клеток показали, что липосомы (I) обеспечивали максимальную эффективность доставки нуклеиновых кислот. Проведена оптимизация технологии получения катионных липосом путем варьирования двух параметров – температуры и времени озвучивания. Показано, что при ультразвуковой обработке в течение 15 мин при 65–75°С образуются липосомы наименьшего размера. При этом достоверного различия в биологической активности липосом, полученных при варьировании указанных технологических параметров, не обнаружено.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорида (2Х3) был осуществлен согласно описанному ранее методу [20].

Приготовление катионных липосом. Навески катионного липида и липида-хелпера (DOPE, Avanti Polar Lipids, США) растворяли в смеси CНCl₃ – МеОН (5 : 1 об.) и в CНCl₃ соответственно. Полученные растворы смешивали в соотношении 1 : 1 (мольн.). Растворители удаляли в вакууме водоструйного насоса, образовавшуюся липидную пленку сушили 4 ч в вакууме масляного насоса (0.01 Торр). К сухой пленке добавляли необходимое количество стерильной воды или раствора Рингера (концентрация по липиду (2Х3) 1 мM) и диспергировали при 50–60°С до полного отслоения пленки со стенок колбы. Образовавшуюся дисперсию обрабатывали на ультразвуковой бане (Bandelin Sonorex Digitec DT 52H, Германия) 15 мин при температуре 70°С для получения образцов (I), (III) или пропускали через экструдер (LiposoFast-Basic, Avestin, Канада) 13 раз (размер пор поликарбонатной мембраны 100 нм) для получения образца (II). Дисперсии катионных липосом фильтровали через стерильный фильтр (Chromafil CA-45/25 (S), Macherey-Nagel, Германия) с размером пор 450 нм и хранили при температуре 4°С.

Определение размера и поверхностного потенциала липосом. Гидродинамический диаметр и дзета-потенциал липосом измеряли с помощью метода динамического лазерного светорассеяния на приборе Delsa Nano С (Beckman Coulter, США). Измерения проводили при концентрации 0.05 мМ при температуре 25°C в трех повторах.

Трансмиссионная электронная микроскопия. Исследование морфологии липосом проводили на трансмиссионном электронном микроскопе Zeiss LIBRA®120 PLUS (Германия), с ускоряющим напряжением 80 кВ. Образцы получали нанесением исследуемой липидной суспензии (15–20 мкл 0.3 мМ или 1 мМ) на покрытую углеродной пленкой медную сетку, с последующим негативным контрастированием уранилацетатом (15–20 мкл 2% водный раствор). Через 2 мин после каждого добавления избыток жидкости удаляли фильтровальной бумагой.

Нуклеиновые кислоты. 25-звенный олигодезоксирибонуклеотид (ОДН) с аминогексильным линкером на 3'-конце (5'-TACAGTGGAATTGTATGCCTATTAT-3') синтезировали твердофазным фосфитамидным методом и выделяли с помощью ВЭЖХ). Чистота олигонуклеотида, согласно анализу с помощью электрофореза в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях, составляла 95–98%. Концентрацию олигонуклеотида определяли на спектрофотометре BioMate 3 (Termo Electron Corporation, США).

siРНК к мРНК гена LIVIN получали путем отжига двух комплементарных олигорибонуклеотидов как описано ранее [19].

В экспериментах использовали пДНК pEGFP-C2 (Clontech, Германия), кодирующую EGFP. siРНК-EGFP последовательности 5'-GAACGGCAUCAAGGUGAACTT-3' (смысловая цепь) и 5'-GUUCACCUUGAUGCCGUUCTT-3' (антисмысловая цепь) была получена, как описано ранее [21]. Отжиг цепей siРНК проводили при концентрации 50 мкM в 30 мM HEPES-KOH (pH 7.4), 100 мM ацетата натрия, 2 мM ацетата магния, 90°C, 5 мин, затем раствор РНК в течение 1 ч охлаждали до комнатной температуры. Полученные дуплексы siРНК анализировали электрофорезом в 15% ПААГ в нативных условиях. Полученный раствор siРНК хранили при –20°C.

Клеточные культуры. Культуру клеток карциномы толстой кишки НТ-29 пассировали стандартным образом. Для культивирования использовали среду RPMI-1640® с глютамином, 10% FBS и антибиотики пенициллин/стрептомицин.

Клетки почки эмбриона человека HEK 293 получены из банка клеточных культур института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Генетически модифицированные клетки BHK IR780, экспрессирующие EGFP, любезно предоставлены профессором В.С. Прасоловым (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарта РАН, Москва).

Клетки HEK 293 и BHK IR780 культивировали в среде DMEM, в присутствии 10% FBS, антибиотиков (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина) в атмосфере 5%-го СО2 при 37 °С, и регулярно пассировали для поддержания экспоненциального роста.

Приготовление комплексов катионных липосом с нуклеиновыми кислотами. Для проведения трансфекции клеток НТ-29 комплексы готовили следующим образом: растворы катионных липосом и siРНК-LIVIN в концентрациях, соответствующих необходимым соотношениям N/P, смешивали в среде RPMI-1640^® с добавлением 1% FBS и инкубировали 20 мин при 24°С.

Для проведения трансфекции клеток HEK 293 и BHK IR780 растворы катионных липосом (25 мкл) и соответствующей нуклеиновой кислоты (25 мкл) в концентрациях, соответствующих необходимым соотношениям N/P, смешивали в среде Opti-MEM^® и инкубировали 20 мин при 24°С.

Электрофорез в ПААГ в нативных условиях. Для анализа комплексов ОДН – липосомы использовали электрофорез в 12%-ном ПААГ при соотношении акриламид – N,N '-метиленбисакриламид (20 : 1) в трис-боратном электродном буфере (ТВЕ) при 20°С и напряженности электрического поля 30–45 В/см. Гель фотографировали при визуализации в ультрафиолетовом свете.

Флуоресцентная спектроскопия. Измерения флуоресценции проводили на флуоресцентном спектрометре Cary Eclipse (Varian, США), в кювете объемом 2 мл из полиметакрилатного материала 1 × 1 см, полосы пропускания (щели) возбуждения и испускания 10 нм, длина волны возбуждения 510 нм, испускания 590 нм. Концентрация этидий бромида составляла 400 нг/мл, концентрация ДНК тимуса теленка (Sigma-Aldrich, США) – 10 мкг/мл. Расчет процента связывания ДНК проводили по формуле:

где F_x – интенсивность флуоресценции ДНК после добавления катионных липосом, F_фон – интенсивность флуоресценции этидий бромида в водном растворе, F₀ – максимальная интенсивность флуоресценции этидий бромида в растворе ДНК [18].

Трансфекция клеток комплексами, сформированными катионными липосомами и нуклеиновыми кислотами. За 2 дня до трансфекции клетки HT-29 высевали в 24-луночные планшеты в концентрации 2.0 × 10⁴ клеток в 1 мл среды. Перед трансфекцией среду культивирования с 10%-ной FBS заменяли на среду с 1%-ной FBS. Полученные комплексы вносили в культуру клеток и выдерживали 16 ч в стандартных условиях в атмосфере 5% СО₂ при 37°С.

Клетки HEK 293 и BHK IR780 высаживали в 24-луночные планшеты (при плотности посадки 0.1 × 10⁵ клеток на лунку для BHK IR780 и 1.2 × 10⁵ клеток на лунку для HEK 293) и инкубировали в течение 24 ч. В день трансфекции культуральную среду заменяли на среду DMEM (200 мкл) с 10%-ной FBS (без антибиотиков). К клеткам добавляли комплексы пДНК (2 мкг/мл) или siРНК (50 нМ) с катионными липосомами, сформированные при различных соотношениях N/P, и инкубировали в стандартных условиях в течение 4 ч, затем заменяли среду на свежую DMEM с 10% FBS (500 мкл) и дополнительно инкубировали при 37°С в течение 44 ч в случае пДНК и 68 ч в случае siРНК.

Проточная цитометрия. Для оценки эффективности доставки siРНК клетки HT-29 обрабатывали трипсином, промывали PBS и анализировали при помощи проточной цитометрии согласно рекомендациям производителя.

Клетки HEK 293 и BHK IR780 промывали PBS и обрабатывали раствором трипсина в PBS (0.5 мг/мл) в течение 2 мин при 37°C для открепления клеток с поверхности лунки. Открепившиеся клетки суспендировали в среде с FBS для ингибирования дальнейшего действия трипсина, переносили в пробирки и осаждали центрифугированием (Contron T42K, Centricon Instruments) при 1000 об./мин (200 g) в течение 10 мин. Супернатант убирали, клетки дважды промывали PBS и фиксировали 2%-ным раствором формальдегида в PBS (600 мкл). Количество трансфицированных клеток и среднее значение интенсивности флуоресценции в клеточной популяции измеряли на цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием программы CXP analysis. В каждом образце анализировали не менее 20 000 клеток. Все экспериментальные точки были получены в результате трех независимых экспериментов. Стандартное отклонение не превышало 5–7%.

БЛАГОДАРНОСТИ

А.С. Алексеевой (Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук) за регистрацию электронных микрофотографий катионных липосом.

Исследование выполнено при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, программа “УМНИК” (договор № 11527ГУ/2017 от 19.05.2017 г.), а также в рамках федеральной целевой программы “Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу” (государственный контракт № 14411.2049999.19.046).