Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 1, стр. 40-51

ВВЕДЕНИЕ

Самоассоциация пептидов, в ряде случаев сопровождающаяся их агрегацией, является достаточно распространенным явлением в биологических средах. Известно, что ряд антимикробных пептидов, таких как протегрин и мелиттин, в результате самоассоциации образуют каналы в мембранах микроорганизмов, приводя к их гибели [1–4].

Известен ряд химических веществ, способных искусственно индуцировать ассоциацию биологических полимеров. Явления как самоассоциации, так и индуцированной ассоциации (например, за счет наночастиц [5–7]), лежат в основе возникновения целого ряда патологических процессов в организме человека. Среди них актуальна болезнь Альцгеймера, сопровождающаяся ассоциацией пептидов βAP(1–40)–βAP(1–42), наблюдаемых в организме человека в виде бляшек [8]. В этой связи представляется важным выявление веществ, которые могли бы быть ингибиторами этих процессов.

Причем существует еще альтернативная гипотеза, что отложения этих ассоциатов на стенках сосудов являются не причиной болезни, а защитной реакцией организма по предотвращению нежелательного взаимодействия βAP с тау-белком, агрегация которого приводит к деменции [9]. В этой связи индукторы, стимулирующие запуск процессов ассоциации, также могут представлять определенный медицинский интерес.

Как показали данные наших экспериментов, в качестве индукторов и ингибиторов подобных процессов могут выступать азолоазины – синтетические аналоги пуриновых оснований [10]. Одно из таких соединений, а именно натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло-[5,1-c]-1,2,4-триазин-7-она, в настоящее время выпускается под торговым названием Триазоверин (TZV) в качестве противовирусного препарата [11–13].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения влияния азолоазинов на процесс агрегации пептидов были выбраны пептиды двух типов (табл. 2). Это аналог N-концевого фрагмента β-амилоидного пептида Альцгеймера βAP*(1–21), с преобладанием кислых функциональных групп, и склонный к ассоциации пептид мелиттин с преобладанием основных функциональных групп. Пептиды с разной функциональной активностью были выбраны для того, чтобы понять общность воздействия азолоазинов на объекты белковой природы, не связывая это воздействие с функциональными свойствами конкретных пептидов.

В табл. 1 представлены структурные формулы азолоазинов, а в табл. 2 – аминокислотные последовательности использованных в экспериментах пептидов. Заметим, что пептид βAP*(1−21) является фрагментом β-амилоидного пептида Альцгеймера (βAP), образующего скопления в виде амилоидных бляшек в организме больных болезнью Альцгеймера, а мелиттин − положительно заряженный токсичный пептид из яда пчел. Ассоциаты последнего способны встраиваться в мембраны бактериальных клеток, формируя в их мембранах поры, способные приводить к гибели клеток.

В водных растворах оба пептида хорошо растворимы, однако после внесения в их растворы триазоверина (TZV) все они теряют свою растворимость (табл. 3: № 1, № 5).

Влияние состава среды на агрегацию пептидов βAP*(1–21) и мелиттина в присутствии TZV, как индуктора агрегации. Азолоазины в виде своих натриевых солей нацело диссоцируют в воде с образованием нейтральных растворов. Причина тому – рассредоточение отрицательного заряда аниона по всей объемной ароматической системе, благодаря чему равновесие в водном растворе сильно сдвинуто в сторону диссоциированной формы.

В случае мелиттина эксперимент проводили в бикарбонатном буфере (NH₄HCO₃) с pH 7.8 (близко к физиологическим условиям), поскольку мелиттин – основный пептид, и буфер его агрегации не мешает. Тогда как в экспериментах с βAP*(1–21) бикарбонатный буфер не использовался, поскольку βAP*(1–21) – кислый пептид и в этом буфере осадков с TZV не образует. Из-за отсутствия буфера пришлось контролировать pH среды: водный раствор βAP*(1–21) при концентрации 1 мМ имел pH = 6.5 и оставался таким же в надосадочной жидкости и после добавления TZV. Тем не менее, в отсутствии TZV оба использованных пептида растворимы в широком диапазоне pH, а поэтому эффект седиментации не может быть приписан изменению pH среды из-за смешения растворов.

Результаты экспериментов по влиянию различных добавок на агрегацию пептидов βAP*(1–21) и мелиттина в водной среде представлены в табл. 3: № 2–4, № 6–8.

Из полученных данных следует, что в случае пептида βAP*(1–21) присутствие 25 мМ NH₄HCO₃ препятствует агрегации, обычно вызываемой TZV (табл. 3: № 6), тогда как в случае мелиттина ни одна из использованных добавок инициированной агрегации не препятствует.

Причина столь разного поведения объясняется различием в содержании остатков основных и кислых аминокислот. Так, в составе молекулы мелиттин полностью отсутствуют кислые остатки, но присутствует множество основных, способных к взаимодействию с анионом TZV, несущим противоположный заряд. Тогда как в составе молекулы пептида βAP*(1–21), кроме основных кислот, присутствуют три кислых аминокислотных остатка, которые в ионизированной форме имеют, как и TZV, отрицательный заряд.

Этому объяснению не противоречит и тот факт, что агрегация пептида βAP*(1–21) сохраняется даже в присутствии трифторуксусной кислоты (TFA) (табл. 3: № 3, № 8), которая подавляет ионизацию остатков карбоксилсодержащих аминокислот.

Использование MALDI-MS для количественного определения содержания пептидов и TZV в смесях. Количественное определение пептидов βAP*(1–21) и мелиттин в осадках ассоциатов и надосадочной жидкости над осадками проводили с использованием масс-спектрометрического метода MALDI-MS в режиме положительных ионов, с учетом особенностей масс-спектрометрической детекции пептидов в присутствии азолоазинов.

Количественное определение пептида βAP*(1–21). Для определения пептида βAP*(1–21) был получен стандарт пептида βAP*(1–21) с включенными в него атомами стабильного изотопа ¹⁸О. Получение стандарта осуществляли путем изотопного обмена в сильно кислой среде, как это описано в работах [14–16]. Изотопное распределение исходного соединения и полученного из него стандарта (в виде их смеси) представлено на рис. 1. Из спектра видно, что кислороды всех 5 карбоксильных групп (Glu + Asp + концевая COOH) проявили способность замещаться на изотоп ¹⁸О. И, как следствие, позволило получить идеальный внутренний стандарт для количественного анализа из-за полного отсутствия перекрывания между паттернами анализируемого вещества и стандарта.

Расчет исходной концентрации пептида проводили по данным MALDI-MS анализа. Концентрации рассчитывали из сопоставления суммарных площадей изотопных распределений ионов пептида и его смеси со стандартом с известной концентрацией, согласно методике, описанной в работах [14–16].

Количественное определение пептида мелиттина. Определение мелиттина проводили по спектрам MALDI-MS продуктов его триптического гидролиза, применяя в качестве внутреннего стандарта тех же продукты гидролиза, меченных путем изотопного обмена, изотопом по C-концевым карбоксильным группам, аналогично описанному выше подходу для βAP*(1–21).

Необходимость использования трипсинолиза обусловлена тем, что мелиттин не содержит остатков дикарбоновых аминокислот, а его C‑концевая карбоксильная группа амидирована. и, следовательно, в этом случае отсутствует возможность введения изотопной ¹⁸O-метки в исходную молекулу путем обмена. Тогда как у продуктов трипсинолиза появляются свободные карбоксильные группы, в которую метку ввести уже можно.

Из двух продуктов предельного гидролиза выбран “маркерный” фрагмент мелиттина Mel(6–16) с m/z = 1511.9 с последовательностью VLTTGLPALISWIK и наибольшей интенсивностью в спектре (рис. 2а). Из гидролизата, путем изотопного обмена в C-концевых карбоксильных группах, был получен меченный стандарт (рис. 2б), который добавляли к триптическому гидролизату анализируемой пробы. А из соотношения интенсивностей меченных и немеченых ионов “маркерного” фрагмента (рис. 2в) рассчитывали концентрацию анализируемого пептида в пробе.

Количественное определение TZV и его аналогов. Концентрацию TZV определяли с использованием MALDI-MS в режиме отрицательных ионов, применяя в качестве стандарта его изотопно-замещенный аналог TZV-A, синтезированный с изотопами ²H и ¹⁵N из изотопно-замещенных реактивов (табл. 1). На рис. 3 в качестве примера представлены данные масс-спектрометрического анализа по определению его концентрации в осадке (табл. 4: № 3) Концентрацию TZV-A определяли из относительной интенсивности его иона по сравнению с ионом TZV.

Для прочих азолоазинов концентрации определяли из соотношения интенсивностей их ионов с интенсивностью ионов TZV-A по предварительно построенным калибровочным кривым. Так для TZV и TZV-A было показано экспериментально, что соотношение интенсивностей этих соединений пропорционально соотношению их концентраций, как это показано в качестве примера на рис. 3.

Изменение агрегатного состояния βAP*(1–21) и мелиттина в зависимости от количества добавленного TZV и его аналога. Разработка метода количественного анализа компонентов, участвующих в изменении агрегатного состояния пептидов в присутствии азолоазинов, позволила в последующих экспериментах дополнить визуальные наблюдения количественными данными по их содержанию в осадках и в надосадочной жидкости. Полученные результаты представлены в табл. 4 для βAP*(1–21), а в табл. 5 для мелиттина. В случае пептида βAP*(1–21) эксперименты проводили в водных растворах, а в случае мелиттина в растворе бикарбонатного буфера (25 мМ NH₄HCO₃). Условия выбраны с учетом результатов, ранее представленных в табл. 3.

Прежде всего, была оценена способность аналогов TZV вызывать агрегацию обоих пептидов в сопоставимых условиях. Из полученных данных следует, что, помимо TZV, агрегацию пептида βAP*(1–21) способен вызывать еще и TZV-A (табл. 4: № 6, 13). Тогда как TZV-B, напротив, подавляет агрегацию, вызываемую TZV, будучи добавленным в концентрации 20–25% от концентрации последнего (табл. 4: № 8–12). Кроме того, образующийся осадок при агрегации пептида βAP*(1–21) с TZV, нерастворимый в воде без буфера (25 мМ NH₄HCO₃), хорошо растворяется в водном растворе с TZV-B.

В отношении мелиттина наблюдается схожая картина – агрегацию по-прежнему вызывают TZV и TZV-A (табл. 5: № 2, 4, 6), тогда как TZV-B и TZ агрегацию не вызывают (табл. 5: № 1, 5). Однако в этом случае TZV-B при сопоставимых концентрациях агрегацию не подавляет (табл. 5: № 8).

Выявленная способность TZV-B ингибировать агрегацию может быть объяснена тем, что это соединение обладает большей ароматичностью из-за замены в пятичленном кольце атома N на С. И если ароматичность оказывается решающей в ингибировании агрегации, тогда аналогичным действием в качестве конкурента за связывание с TZV должен обладать, например, пиридин.

Проверка этой гипотезы была выполнена экспериментально путем добавления пиридина в опытах с пептидом βAP*(1–21) (табл. 4: № 14–18) и с мелиттином (табл. 5: № 10–13). Из полученных результатов следует, что пиридин оказывает ингибирующее действие только на агрегацию пептида βAP*(1–21), но не влияет на агрегацию мелиттина. Причем, ингибирующее действие TZV-B и пиридина начинает проявляться при достижении мольного отношения к TZV, близкого к единице (табл. 5: № 10–13). Т.е. одна молекула ингибитора нейтрализует действие одной молекулы индуктора.

Определение соотношение пептидов βAP*(1–21) и мелиттина с азолоазинами в осадках. Для количественного определения соотношений компонентов в осадках для каждого из пептидов выбирались соотношения, близкие к достаточным для агрегации пептидов, без большого избытка TZV.

Состав осадков, образующихся в процессе агрегации, практически не зависит от избытка реагентов и составляет 2 молекулы TZV на одну молекулу βAP*(1–21) и (табл. 4: № 2–4). Так же ведет себя и TZV-A (табл. 4: № 6). При одновременном добавлении смеси TZV и TZV-A в осадке присутствуют оба азолоазина с небольшим преимуществом TZV (табл. 4: № 13).

В случае мелиттина образуется осадок, в котором на одну молекулу мелиттина приходится около 6 молекул TZV (табл. 5: № 2–3).

Определение участков связывания пептида βAP*(1–21) с TZV. Наличие основных кислот в последовательности пептида позволило использовать трипсин для получения его более коротких фрагментов. В полученном гидролизате (30 мин гидролиза) зарегистрировано три основных пептида: βAP*(1–5) − DAEFR с m/z = 637.17; βAP*(6–16) HDSGYEVHHQK с m/z = 1336.6 и его ион с Nа с m/z = 1358.6, а также пептид βAP*(17–21) KLVFF с m/z = 653.27 (рис. 4а).

При добавлении раствора TZV к продуктам трипсинолиза βAP*(1–21) исчезает практически только пептид KLVFF c m/z = 653.27 (рис. 4а). Этот эффект хорошо виден на рис. 4б в сравнении с фрагментами βAP*(1–5) с m/z = 637.17, и βAP*(6–16) с m/z = 1336.6, которые остаются в растворе.

Из полученных данных следует, что в пептиде βAP*(1–21) центром связывания с TZV является участок KLVFF. В этом фрагменте хорошо сочетается наличие положительного заряда у Lys (K) и двух ароматических аминокислот – Phe-Phe (FF) для связывания c TZV, имеющим отрицательный заряд и ароматическую часть для стекинга с FF.

Определение участков связывания TZV c мелиттином. Для выявления участков связывания, определяющих агрегацию мелиттина, была использована особенность его масс-спектрометрической детекции в присутствии TZV. Она заключалась в том, что при нанесении на мишень смеси пептидов с TZV, агрегированные пептиды в масс-спектрах себя не проявляют. В качестве примера на рис. 5 представлен спектр природного мелиттина, содержащего гомологичные примеси. Видно, что в присутствии TZV мелиттин не регистрируется в связи с его агрегацией, однако в спектре по-прежнему присутствуют примеси, представляющие собой укороченные гомологи мелиттина, неспособные к агрегации.

Из представленных данных следует, что в спектре коммерческого препарата, мелиттин регистрируется в виде интенсивного молекулярного иона с присутствием некоторого количества примесных ионов, представляющих собой укороченные пептидные цепочки, по-видимому, представляющие собой промежуточные продукты его биосинтеза. В присутствии TZV ион мелиттина из спектра исчезает, тогда как примесные ионы остаются, и доминантным становится один из примесных ионов с m/z = 2585. Аминокислотный состав последнего определить не удалось. Одновременно существенно возростает относительная интенсивность остальных примесных ионов, многие из которых представляют собой гомологи мелиттина, укороченные с C-конца (табл. 6), очевидно не участвующие в образовании недетектируемых ассоциатов.

Для определения в мелиттине аминокислотных последовательностей, участвующих в связывании или ассоциации при взаимодействии с TZV, использовали триптические фрагменты мелиттина. С этой целью был получен триптический гидролизат мелиттина, MALDI-спектр которого представлен на рис. 6б. Затем к полученному гидролизату был добавлен TZV. Как следует из сравнения спектров на рис. 6б и рис.6в, при добавлении TZV в спектре исчез фрагмент GIGAVLKVLTTGLPALISWIKR (ион с m/z = = 2306.4), тогда как его составные фрагменты – GIGAVLK (в виде пары ионов M + H⁺ с m/z = = 657.4 и M + Na⁺ с m/z = 679.4) и VLTTGLPALISWIKR (в виде пары ионов M + H⁺ с m/z = 1668.0 и M + Na⁺ с m/z = 1690.0) остались в растворе. Кроме того, в растворе остался пептид VLTTGLPALISWIK (в виде пары ионов M + H⁺ с m/z = 1511.9 и M + Na⁺ с m/z = 1533.9).

В области низких значений m/z, в растворе, в присутствии TZV, виден весь спектр пептидов, содержащих N-концевые пептиды: RKRQQ (m/z = = 714.4), KRQQ (m/z = 558.3 и m/z = 430.2), оставшиеся в растворе. Из этого следует, что они не осаждаются в присутствии TZV.

Полученный результат свидетельствует о том, что участком связывания мелиттина с TZV, является протяженный участок Mel(1–22), тогда как более короткие фрагменты Mel (1–7), Mel (8–22) и Mel (23–26) с TZV не связываются.

На примере двух типов функционально значимых пептидов – пептида из C-концевой последовательности пептида Альцгеймера и “катионного” пептида мелиттина, выявлено, что азолоазины (TZV и некоторые его аналоги) индуцируют самоассоциацию и агрегацию пептидов.

Мелиттин и βAP*(1–21) отчетливо проявляют особенности взаимодействия с TZV и его аналогами. Можно полагать, что эти особенности обусловлены существенными различиями их аминокислотного состава.

Показано, что в образующихся нерастворимых ассоциатах существенно отличаются молярные соотношения пептида и TZV. На 1 молекулу βAP*(1–21) приходится 2 молекулы TZV, тогда как 1 молекулу мелиттина их приходится 6. Если учесть, что ароматическая система аниона TZV имеет отрицательный заряд на одном из атомов N (формула в табл. 1), то можно предположить, что ее взаимодействие с пептидами, в первую очередь, будет определять электростатическим взаимодействием с основными аминокислотами. Можно ожидать, что электростатическое взаимодействие зависит от микроокружения вблизи предполагаемых сайтов связывания. В табл. 7 наглядно представлен баланс основных и кислых аминокислотных остатков в этих пептидах в сравнении с числом молекул TZV, приходящих на одну молекулу пептида в осадке.

В пептиде βAP*(1–21), с учетом N-концевой аминогруппы и двух основных аминокислот (2Lys + + Arg + NH₂), имеют место 4 потенциальных центра связывания, два из которых дезактивированы: N-концевая аминогруппа Asp¹ дезактивирована близостью боковой карбоксильной группы того же остатка, а основная группа Arg⁵ дезактивирована своим ближайшим микроокружением (3 кислые группы по соседству: у остатков Glu¹ + Asp³ + Glu⁷). В итоге у пептида βAP*(1–21) остаются лишь 2 возможных центра связывания – Lys¹⁵ и Lys¹⁶, а у его аналога βAP – только один Lys¹⁵ (табл. 2).

Таким образом для агрегации мелиттина в присутствии TZV необходима полная последовательность, содержащая 5 основных аминокислот и N-концевую аминогруппу. При этом в образовании ассоциатов участвуют уже 6–7 молекул TZV. Тогда как для агрегации βAP*(1–21) достаточно наличие короткой последовательности KLVFF.

Кроме того, существенным различием является разный эффект воздействия пиридина на ассоциацию этих пептидов в присутствии TZV: пиридин не препятствует ассоциации βAP*(1–21), но не мешает ассоциации мелиттина.

Аналогично воздействию пиридина, по разному проявляется и влияние TZV-B на ассоциацию пептидов в присутствии TZV. Добавление TZV-B в существенно меньших концентрации, чем TZV, препятствует агрегации βAP*(1–21), но не оказывает влияния на агрегацию мелиттина. Кроме того, замечено, что TZV-B не только препятствует образованию нерастворимых ассоциатов βAP*(1–21) с TZV, но и способен их растворять. Из экспериментов следует, что TZV-B конкурирует с TZV за центры связывания βAP*(1–21), участвующие в образовании ассоциатов.

Оценивая результаты влияние всех использованных азолоазинов на агрегацию обоих пептидов (см. табл. 4, 5) можно отметить, что способность вызывать агрегацию βAP*(1–21) присуща TZV и TZV-A примерно в равной мере, судя их соотношению в составе осадка. Тогда как TZ не влияет на агрегацию и не препятствует ассоциации βAP*(1–21) в присутствии TZV. Однако в случае мелиттина TZ может способствовать ассоциации. Важно заметить, что азолоазины в разной степени способны к комплексообразованию с обоими типами пептидов, но их действие определяется исключительно свойствами самих пептидов.

Таким образом, в результате выполненных исследований:

(1) Определен участок и стехиометрия связывания TZV с βAP*(1–21). Показано, что TZV связывается с βAP*(1–21) на гидрофобном участке βAP*(17–21) – KLVFF. Связывание индуцирует процесс агрегации пептида и образование осадка с содержанием TZV и βAP*(1–21) в соотношении 2 : 1.

(2) Определен участок и стехиометрия связывания TZV с мелиттином. Показано, что агрегацию мелиттина индуцирует связывание с молекулами TZV на участке N-концевого фрагмента полипетидной цепи мелиттина (1–22) – GIGAVLKVLTTGLPALISWIKR. Стехиометрия связывания TZV с мелиттином в интервале 6 : 1–7 : 1.

(3) Показано, что близкое производное TZV – TZV-A, индуцирует агрегацию аналогичным TZV образом.

(4) Обнаружено, что производное TZV-B, с большей, по сравнению с TZV ароматичностью, не только не ингибирует агрегацию βAP*(1–21) под воздействием TZV, но и способствует растворению уже образовавшего осадка из агрегированных молекул βAP*(1–21). Показано, что решающим для этого свойства является ароматичность соединения, что продемонстрировано на примере ингибирования агрегации пиридином. Принципиально важным представляется факт, что указанные соединения способны к растворению осадка, содержащего амилоидный пептид βAP*(1–21), но не меллитин. Это указывает на направленность воздействия этих соединений на участок βAP*(17–21) – KLVFF, опосредующий образование нерастворимых фибрилл, вызывающих болезнь Альцгеймера.

В целом, настоящая работа является важным этапом на пути понимания процессов формирования нерастворимых агрегатов из полипептидов и поиска соединений, способных ингибировать процессы агрегации и даже растворять такие агрегаты. Кроме того, отметим, что исследования взаимодействия азолоазинов с пептидами стимулируют работы по созданию новых модифицированных форм азолоазинов в качестве перспективных регуляторов агрегации пептидов, участвующих в формировании амилоидоза, в том числе и болезни Альцгеймера.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пептид βAP*(1–21) был синтезирован компанией “Verta Ltd”. Мелиттин (≥85% HPLC) от компании “Sigma”, трипсин от компании “Promega”.

Азолоазины были синтезированы и любезно предоставлены профессором В.П. Русиновым из Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина. H₂¹⁸O (97% ¹⁸O) использовалась от Sigma.

Масс-спектрометрические измерения и расчеты. Масс-спектры получены с помощью масс-спектрометра Ultraflex II MALDI-ToF/ToF (Bruker Daltonics, Германия), оборудованного Nd:YAG лазером (neodymium-doped yttrium aluminum garnet; Nd:Y₃Al₅O₁₂).

Пептиды детектировали в виде положительных ионов с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Точность измерения моноизотопных масс была не хуже 25 миллионный долей (ppm).

Азолоазины детектировали в виде отрицательных ионов с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричная кислоты.

Количественное определение пептида βAP*(1–21) в осадках проводили с использованием ¹⁸O-меченного стандарта βAP*(1–21), после растворения осадка в 25 мМ NH₄HCO₃ (pH = 7.8). Осадок отделяли в 25 мМ NH₄HCO₃ (pH = 7.8). К аликвоте анализируемого раствора добавляли раствор стандарта. Количество пептида в осадке рассчитывали из сопоставления суммарных площадей изотопного распределения в масс-спектре анализируемого пептида и его стандарта с учетом известной концентрации стандарта, согласно методике, описанной в работах [14–16].

Получение стандарта пептида βAP*(1–21). 20 мкл пептида с концентрацией 10^–4 М высушивали в вакуумной центрифуге, растворяли в смеси 18 мкл H₂¹⁸O + 2 мкл 100% TFA и инкубировали в течение 90 минут при 70°С. Реакционную смесь высушивали в вакуумной центрифуге, а затем растворяли в воде. Смесь использовали для добавления к анализируемым образцам в качестве стандарта.

Триптический гидролиз βAP*(1–21). К 50 мкл пептида с концентрацией 10^–5 М в 50 мМ NH₄HCO₃ (pH 7.8) добавляли 5 мкл раствора трипсина с концентрацией 0.05 мг/мл. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 10 мкл 2% TFA. Полученную реакционную смесь высушивали в вакуумной центрифуге.

Триптический гидролиз мелиттина. К 20 мкл раствора мелиттина с концентрацией 10^–5 М в 100 мМ NH₄HCO₃ (pH 7.8) добавляли 5 мкл трипсина с концентрацией 0.05 мг/мл. Смесь инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Гидролиз контролировали масс-спектрометрически до образования пептида в качестве основного продукта гидролиза пептида VLTTGLPALISWIK.

Получение стандарта из триптического гидролизата мелиттина. Гидролизат высушивали в вакуумной центрифуге, образец перерастворяли в смеси 18 мкл H₂¹⁸O + 2 мкл 100% TFA и инкубировали в течение 90 мин при 70°С. Продукты изотопного обмена гидролизата высушивали, растворяли в воде и использовали в качестве стандарта.

Количественное определение мелиттина в осадках. Осадки, содержащие мелиттин (табл. 4) отделяли центрифугированием и растворяли в 20 мкл 50% ацетонитрила. К полученным растворам добавляли 20 мкл раствора трипсина (0.02 мг/мл в 50 мМ NH₄HCO₃) и выдерживали 24 часа при комнатной температуре. Полученные гидролизаты смешивали со стандартом. И из соотношения изотопных распределений, относящихся к анализируемому пептиду и его стандарту с известной концентрацией, рассчитывали количество мелиттина в осадке.

Количественное определение TZV проводили с использованием в качестве стандарта его аналога с изотопами ²H и ¹⁵N, включенных в процессе его синтеза. Для TZV-A концентрацию оценивали из его относительной интенсивности по сравнению с TZV. Определение проводили в осадках с мелиттином после их растворения в 50% ацетонитриле в 25 мМ NH₄HCO₃, и в осадках с пептидом βAP*(1–21), растворенных в 100 мМ NH₄HCO₃.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе исследования были проведены фрагментом βAP, включающим амфифатический заряженный N-конец βAP и центральную гидрофобную область βAP*(17–21) – LVFFA, без гидрофобного C-конца. Как показали предыдущие исследования, именно эта центральная гидрофобная область играет ключевую роль в агрегации βAP [17–20], именно с этого участка начинается процесс образования фибрилл [9]. Яркой особенностью этой области является наличие двух остатков фенилаланина (Phe¹⁹ и Phe²⁰). Известно, что ароматические аминокислоты встречаются во многих белках, которые самоорганизуются и объединяются, вызывая болезни человека [21]. Причем в начале образования фибрилл основную роль играет Phe¹⁹, тогда как присутствие Phe²⁰ несколько замедляет агрегацию [23, 24].

Полученные нами данные по взаимодействию TZV и его аналогов с βAP*(1–21) также подтверждают имеющиеся данные [23, 24] о роли участка Phe¹⁹ – Phe²⁰ в процессах как индукции агрегации, так и ее ингибирования. В целях предотвращения этой агрегации ранее уже предлагались соединения, главным образом пептидной природы, нацеленные на блокирование этого участка [25]. Выгодным свойством TZV и его аналогов в качестве возможных регуляторов агрегации является их высокая стабильность в биологических средах по сравнению с пептидами.

Для TZV показана его низкая токсичность, а потому не следует ожидать высокой токсичности и от его аналогов. Тем более что по своей природе все они являются близкими родственниками природных пуринов и ксантинов. А потому потенциально могут быть положены в основу разработок по созданию фармацевтических средств для ингибирования фибриллогенеза во всех его аспектах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, Соглашение № 14.604.21.0180, уникальный идентификационный номер проекта RFMEFI60417X0180 (методики количественной масс-спектрометрии в определении характеристик ассоциатов), при поддержке грантов РФФИ 17-00-00394 и 18-04-00893 (определение сайтов связывания). Авторы благодарят профессора В.П. Русинова из Уральского федерального университета имени первого Президента России Б.Н. Ельцина за предоставленные образцы азолоазинов.