Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 1, стр. 52-57

ВВЕДЕНИЕ

Активность специфических тирозиновых протеинкиназ, как известно, связана с продукцией онкогенов семейства scr ретровирусов [1]. Эта киназная активность значительно коррелирует со способностью ретровирусов к трансформации клетки, при этом мутанты со сниженной активностью тирозиновых протеинкиназ имеют низкую способность к трансформации, а мутанты с отсутствием этой активности полностью лишены такого свойства [2]. Кроме того, фосфорилирование остатков тирозина, возможно, контролирует пролиферацию клеток, а также клеточную сигнализацию и метаболизм, необходимый для быстрой сборки мультибелковых сигнальных комплексов в таких фундаментальных метаболических путях, как например, окислительное фосфорилирование, передача сигнала о митохондриальном редокс-статусе к другим компартментам клетки и др. [3].

Фосфорилирование белков растений по остаткам тирозина мало изучено. Предполагали, что этот тип фосфорилирования в растениях осуществляется митоген-активируемыми протеинкиназами, широко представленными в растениях [4]. Установлено, что в геноме арабидопсиса имеется 57 генов, кодирующих различные протеинкиназы, имеющие тирозинкиназные мотивы [4].

Несмотря на то что тирозиновые киназы и фосфатазы главным образом представлены в цитозоле или ядре, некоторые из них локализованы в митохондриях. В частности, было показано, что протеинкиназы Lyn, Fyn, Csk и Fgr семейства Src-киназ обнаруживаются в межмебранном пространстве митохондрий. Подобная локализация тирозиновых протеинкиназ может указывать на участие этих протеинкиназ в регуляции окислительного фосфорилирования [5]. Исходя из этих данных и предположений, специфический ингибитор для тирозиновых протеинкиназ может быть эффективным не только в качестве противоопухолевого агента, но и как действенное средство для изучения физиологической роли тирозинового фосфорилирования. Среди подобных ингибиторов, как было показано, наиболее специфичным оказался флавоноид генистеин. Этот агент практически полностью ингибировал фосфорилирование по тирозиновым остаткам, в то время как активность сериновых и треониновых протеинкиназ подавлял слабо; при этом другой флавоноид кверцетин одинаково эффективно снижал и тирозинкиназную активность, и активность других протеинкиназ [6].

Целью работы было исследование влияния генистеина на фосфорилирование белков по остаткам тирозина в митохондриях кукурузы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В работе использовали иммунохимические методы анализа для определения специфических сайтов фосфорилирования по остаткам тирозина. Как видно из представленных на рис. 1 данных, специфическому фосфорилированию подвергаются остатки тирозина митохондриальных белков 66 и 90 кДа. Следует отметить, что белок с молекулярной массой около 90 кДа выявляется только при обработке изолированных митохондрий ингибитором тирозиновых протеинкиназ генистеином.

Рис. 1.

Исследование с помощью иммуноблотинга влияния генистеина на фосфорилирование белков по тирозиновым остаткам в препаратах экстрактов митохондрий кукурузы. Линии 1 и 2 в отсутствие генистеина, линии 3 и 4 в присутствии 2.5 мкМ генистеина: 1, 3 –интактные митохондрии, полученные из проростков кукурузы; 2, 4 – митопласты, полученные из митохондрий проростков кукурузы.

Далее мы попытались идентифицировать белок с молекулярной массой около 66 кДа (рис. 2) иммунохимически. С помощью иммунодетекции с антителами против HSP60 удалось установить, что фосфобелок с молекулярной массой около 66 кДа является белком HSP60. Как было показано нами раннее [16], уровень фосфорилирования белков в митопластах и в наружной мембране митохондрий кукурузы был значительно выше, чем в интактных митохондриях. Одно из возможных объяснений этого феномена – наличие так называемых “субстратных фосфатаз” в митохондриальной наружной мембране, которые в первую очередь дефосфорилируют белки внутренней мембраны митохондрий [16]. Поэтому, чтобы избежать действия этих протеинфосфатаз, мы использовали митопласты. Предполагалось, что в митопластах уровень фосфорилирования будет выше. В митопластах, получаемых путем удаления наружной мембраны митохондрий, наблюдается фосфорилирование только белка HSP60 по остатку тирозина (рис. 2). Следует отметить, что кажущийся размер в геле HSP60 в наших исследованиях несколько отличается от предсказанных размеров этого белка на основании анализа нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих этот белок у кукурузы. Эти результаты коррелируют с другими исследованиями митохондриальных белков кукурузы [7].

Рис. 2.

Анализ наличия фософрилированных белков митохондрий и идентификация среди них белка HSP60 как фосфорилируемого. Иммуноблотинг с помощью антител против фосфотирозина (а) и антител против HSP60 (б). Линия 1 – митохондрии + генистеин (2.5 мкМ); 2 – митопласты; 3 – митохондрии; 4 – митохондрии + генистеин (2.5 мкМ); 5 – митопласты; 6 – митохондрии.

Таким образом, показано, что локализованный в митохондриях и митопластах кукурузы HSP60 может фосфорилироваться по остаткам тирозина.

При исследовании фосфорилирования митохондриальных белков с помощью включения радиоактивно меченного фосфата было обнаружено дополнительное фосфорилирование белков с мол. массой 66, 60 и 59 кДа, и такое фосфорилирование наблюдалось при обработке генистеином (2.5 мкМ) в отличие от контроля, в котором оно отсутствовало (рис. 3а). Как видно из рисунка, происходило именно изменение уровня фосфорилирования белков, т.к. общее количество митохондриального белка было идентичным (рис. 3б).

Рис. 3.

Электрофоретическое разделение и анализ фосфорилирования митохондриальных белков кукурузы: (а) радиавтография; (б) окрашивание Кумасси R-250. Дорожки 1 – препарат белков митохондрий; дорожки 2 – препарат белков митохондрии с добавлением 2.5 мкМ генистеина.

В процессе выполнения работы возник вопрос, почему ингибитор тирозиновых протеинкиназ генистеин не снижал фосфорилирование белков, а, напротив, стимулировал этот процесс. Возможно несколько объяснений данного феномена. Одним из объяснений может быть нечувствительность митохондриальных растительных тирозинкиназ к этому ингибитору. Более того, увеличение количества идентифицируемых фосфорилированных белков при обработке генистеином, может указывать на возможное участие митохондриальных протеинкиназ в регуляции активности протеинфосфатаз, так как известно, что ряд фосфатаз активируется только путем фосфорилирования специфической аминокислотной группы протеинкиназами [8].

Изучение активности V дыхательного комплекса митохондрий показало значительное снижение гидролизной активности митохондриальной АТР-азы при действии генистеина (рис. 4). Действие генистеина было сходно с действием специфического ингибитора мембранно-связанной митохондриальной АТР-азы олигомицина.

Рис. 4.

Влияние генистеина на активность митохондриальной АТP-азы митохондрий кукурузы. О повышении активности фермента судили по падению оптической плотности.

Как известно, генистеин является изофлавоноидом растительного происхождения. Как и многие изофлавоноиды, генистеин обладает мощным антиоксидантным действием. Ингибирование активности АТР-азы генистеином сходно с действием такого сильного антиоксиданта как ресвератрол [9]. Как показано, мощный эффект ресвератрола, как и генистеина связан, прежде всего, с ингибированием активности митохондриальной АТР-азы [10]. Генистеин подобно ресвератролу ингибирует как активность ATP-азы, так и ATP-синтазную активность. Мишень ресвератрола для ингибирования F₀F₁-ATP-азы – это F₁ компонент, в то время как генистеин действует на F₀ компонент [11].

По-видимому, снижение активности митохондриальной АТР-азы генистеином, может приводить к изменению редокс-состояния митохондрий [11]. Поскольку многие протеинкиназы и протеинфосфатазы митохондрий редокс-чувствительны [12] можно предположить, что именно сдвиг в редокс-статусе приводит к увеличению количества фосфорилированных белков при обработке изолированных митохондрий генистеином.

Таким образом, можно заключить, что в митохондриях кукурузы фосфорилированию по остаткам тирозинов подвергаются HSP60 и неидентифицированный белок с молекулярной массой около 90 кДа. Фосфорилирование белка 90 кДа наблюдалось только при обработке изолированных митохондрий генистеином. Активирующее действие данного агента на митохондриальные тирозиновые протеинкиназы можно объяснить изменением редокс-состояния митохондрий при ингибировании генистеином митохондриальной АТР-азы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали реактивы фирмы “Sigma”, США. TBS – буферный раствор, содержащий 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7.6. Для иммуноблоттинга использовали поликлональные антитела кролика против растительных белков и вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой фирмы “Agrisera”, США.

Получение митохондрий и митопластов. Митохондрии выделяли из 4-дневных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L., гибрид ВИР 42МВ) методом дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в градиенте концентрации сахарозы [13]; митопласты получали согласно методике [14].

Фосфорилирование белков in vitro проводили, как описано в работе [15].

Осадок митохондрий ресуспендировали в 50 мкл буфера, содержащего 0.3 М сахарозу, 50 мМ Hepes (pH 7.4), 5 мМ MgCl₂, 0.1 мМ СaCl₂ и 0.2 мМ (0.4–1.0 Ки/ммоль) [γ-³²Р]ATP (ФГУП “ИРМ”, Россия). Инкубацию проводили в течение 15–20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением буфера для подготовки образца к электрофорезу, содержащего 62.5 мМ Tris-HCl (pH 6.8), 8% SDS, 10% глицерин, 5% β-меркаптоэтанол и 0.001% бромфеноловый синий [16]. Смесь прогревали при температуре 95°С в течение 2 мин. Полученные пробы хранили при температуре −20°С.

Полипептидный состав фосфорилированных белков. Белки митохондриальные (150–200 мкг) анализировали электрофорезом 12.5% ПААГе в присутствии SDS [16]. В качестве маркеров молекулярных масс использовали стандарты фирмы “СибЭнзим” (Россия), содержащие 12 белков с молекулярными массами от 10 до 250 кДа.

Вестерн-блот осуществляли согласно методике Тиммонса и Дунбара [17]. Митохондриальные белки после разделения в SDS-ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану Для заполнения свободных мест на мембране ее инкубировали в буфер TBS c добавлением 5% обезжиренного молока и 0.05% Tween-20, в течение ночи. Затем мембраны инкубировали в растворе первичных антител против фосфотирозина и HSP60 (Agrisera, США) в разведении (1 : 1000). Мембрану промывали буфером TBS c добавлением 0.05% Tween-20 не менее 3 раз и добавляли раствор коньюгата антикролик- щелочная фосфатаза (“Agrisera”, США).

Активность АТP-азы определяли спектрофотометрически при 340 нм [9]. Метод основан на сопряжении пируваткиназной и лактатдегидрогеназной реакции. Реакционная смесь содержала: 100 мМ Tris (рН 8.0), 4 мМ MgATР, 2 мМ MgCl₂, 50 мМ KCl, 0.2 мМ EDTA, 0.23 мМ NADH, 1 мМ фосфоенолпируват, 1.4 ед. акт. пируваткиназы, 1.4 ед.акт. лактатдегидрогеназы и 25–50 мкг митохондриального белка. Измерение оптического поглощения проводили в течение 3 мин. Специфичность F₀F₁АТP-азной активности определяли с помощью специфического ингибитора этого комплекса олигомицина [18]. Как известно, олигомицин ингибирует митохондриальныю АТР-азу до 90%, причем действует на конформационные взаимодействия между F₀ и F1 на мембране митохондрий [18].

БЛАГОДАРНОСТИ

В работе использовано оборудование Байкальского аналитического центра (ЦКП) СО РАН при президиуме ИНЦ СО РАН.