1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 45, № 2, 2019

Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 2, стр. 166-172

Обнаружение активности дивинилэфирсинтазы и нового оксилипина (1'Z)-колнелевой кислоты в спарже (Asparagus officinalis L.)

А. В. Огородникова , Ф. К. Мухитова , И. Р. Чечёткин , Б. И. Хайрутдинов , А. Н. Гречкин 

Казанский институт биохимии и биофизики – обособленное структурное подразделение ФГБУН “Федеральный исследовательский центр Казанский научный центр Российской академии наук”,
г. Казань, Россия

Поступила в редакцию 27.04.2018
После доработки 02.06.2018
Принята к публикации 09.05.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

В корнях и стеблях спаржи Asparagus officinalis L. обнаружена активность дивинилэфирсинтазы (КФ 4.2.1.121) – фермента, участника липоксигеназного каскада ненасыщенных жирных кислот в растениях. Инкубация гомогенатов корней и/или этиолированных стеблей спаржи Asparagus officinalis L. с линолевой кислотой приводила к преимущественному образованию дивинилового эфира (9Z,11Z,1'E)-12-(1'-гексенилокси)-9,11-додекадиеновой кислоты (11Z-этеролевой кислоты), а также минорного количества его геометрического изомера (9Z,11E,1'E)-12-(1'-гексенилокси)-9,11-додекадиеновой кислоты (этеролевой кислоты). Образование этих соединений из линолевой кислоты опосредовано-последовательным действием 13-региоспецифичной липоксигеназы и дивинилэфирсинтазы. Кроме того, было обнаружено минорное соединение, количество которого увеличилось после инкубации гомогенатов с 9-гидроперекисью линолевой кислоты ((9S,10E,12Z)-9-гидроперокси-(10,12)-октадекадиеновой кислотой). Оно было идентифицировано как (8E,1'Z,3'Z)-9-(1',3'-нонадиенилокси)-8-ноненовая кислота ((1'Z)-колнелевая кислота). Полученные данные указывают на наличие в нефотосинтезирующих тканях спаржи активности новой 13/9-дивинилэфирсинтазы.

Ключевые слова: линолевая кислота, оксилипины, дивинилэфирсинтаза, дивиниловые эфиры, колнелевая кислота ((8E,1'E,3'Z)-9-(1',3'-нонадиенилокси)-8-ноненовая кислота), этеролевая кислота ((9Z,11E,1'E)-12-(1'-гексенилокси)-9,11-додекадиеновая кислота)

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время достигнут значительный прогресс в изучении липоксигеназного каскада полиненасыщенных жирных кислот в растениях. В результате метаболических превращений образуются физиологически активные соединения – оксилипины, которые играют важную роль в клеточной сигнализации и защите растений [1, 2]. Разнообразие оксилипинов обеспечивается рядом ферментов, включающих в себя липоксигеназы, пероксигеназы, эпоксиалкогольсинтазы (EAS), дивинилэфирсинтазы (DES), гидропероксидлиазы (HPL) и алленоксидсинтазы (АОS) [3]. АОS, HPL, DES и EAS образуют отдельный монофилетический таксон в составе суперсемейства Р450 – клан CYP74, состоящий из одного семейства [4]. В отличие от АОS и HPL, DES изучены в значительно меньшей степени. В качестве субстратов DES используют 9- и 13-гидроперекиси линолевой и α-линоленовой кислот. При этом DES различаются по субстратной специфичности и по геометрической изомерии образуемых ими дивиниловых эфиров [5, 6]. К настоящему времени клонировано только девять генов, кодирующих дивинилэфирсинтазы, включая четыре 9-DES [5, 7–9], четыре 13-DES [11–13] и одну 13/9-DES [10]. Эти ферменты катализируют образование таких дивиниловых эфиров, как колнелевая, колнеленовая, этеролевая и этероленовая кислоты, а также их ω5Z- и 11Z-изомеры. В то же время отсутствуют молекулярно-биологические данные о DES, участвующих в образовании 8Z- и 1'Z-изомеров.

Недостаток сведений по молекулярному клонированию DES и биохимическому исследованию рекомбинантных ферментов CYP74 частично компенсируется данными, полученными в ходе исследования метаболизма in vitro в растениях с неизученными или мало изученными геномами. Продукты дивинилэфирсинтазной реакции были обнаружены у филогенетически отдаленных видов, в том числе в бурых [14] и красных [15] морских водорослях, в высших растениях семейства лютиковых [16, 17], льне [18], а также в семействе пасленовых [19–21]. Кроме того, ранее [22–27] мы сообщали об обнаружении активности дивинилэфирсинтазы в нефотосинтезирующих тканях некоторых растений, принадлежащих к разным семействам порядка Asparagales, а именно в луковицах чеснока (Allium sativa L., Amaryllidaceae), корнях ландыша (Convallaria majalis L., Asparagaceae) корнях и луковицах ириса (Iris germanica L., Iridaceae) и гладиолуса (Gladiolus communis L., Iridaceae). В настоящей работе нами был продолжен скрининг дивинилэфирсинтазной активности в растениях из порядка Asparagales, в результате чего в корнях и стеблях спаржи (Asparagus officinalis L., Asparagaceae) была обнаружена активность новой дивинилэфирсинтазы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для характеристики метаболизма ненасыщенных жирных кислот в корнях и этиолированных стеблях спаржи Asparagus officinalis L. in vitro супернатанты 15 000 g гомогенатов корней и/или стеблей были проинкубированы с линолевой кислотой. Первичный качественный анализ продуктов (в виде метиловых эфиров) проводился с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии. В результате реакций образовались соединения (1), (2) и (3). При этом профиль продуктов реакции для корней и стеблей спаржи был идентичен и характеризовался значительным преобладанием продукта (2) (рис. 1).

Рис. 1.

Продукты инкубации (в виде метиловых эфиров) линолевой кислоты с 15000 g супернатантами корней (а) и стеблей (б) спаржи A. officinalis L. ГХ-МС-анализ, хроматограмма по полному ионному току.

Фрагментация соединений (1)–(3) в масс-спектре электронного удара приведена в табл. 1.

Таблица 1.  

Данные масс-спектров электронного удара соединений (1)–(4) (фрагментные ионы, значения m/z)

Ионы Соединения
(1) (2) (3) (4)
[M ]+ 308 308 308 308
[M–CH3O]+ 277 277 277 277
[M–(CH2)3CH3]+ 251 251 251 251
[M–CH3(CH2)3CH=CHO]+ 209 209 – –
[209-CH3OH]+ 177 177 – –
[M–(CH2)6COOMe]+ 165 165 165 165
Не идентифицировано 159 159 – –
Не идентифицировано 149 149 – –
[M–CH3(CH2)4CH=CH–CH=CHO–CH3OH]+ – – 137 137
Не идентифицировано 135 135 – –
Не идентифицировано  95  95  95  95
Не идентифицировано  81  81  81  81
Не идентифицировано  67  67  67  67

Анализ масс-спектра электронного удара соединения (1) и сравнение с аутентичными соединениями показало, что масс-спектр и время удерживания соединения (1) соответствует метиловому эфиру этеролевой кислоты – (9Z,11E,1'E)-12-(1'-гексенилокси)-9,11-додекадиеновой кислоты. Соединение (2) было выделено и очищено в виде метилового эфира с помощью ВЭЖХ на обращенной и нормальной фазах, был получен его масс-спектр. Для установления структуры соединения (2) был использован метод ядерного магнитного резонанса – одномерный 1H-ЯМР и двумерный гомоядерный корреляционный 1Н-1Н-COSY. Были определены значения химических сдвигов сигналов протонов и константы их спин-спинового взаимодействия. Использование 1Н-1Н-COSY позволило определить протоны, связанные скалярным спин-спиновым взаимодействием, и выполнить отнесение спектров ЯМР. Из анализа значений констант спин-спинового взаимодействия определялась геометрия двойных связей. Спектр соединения (2) идентичен спектру этеролевой кислоты (соединение (1)). Так, сигналы с химическими сдвигами 1.52 и 1.18 м.д. соответствуют протонам Н3, Н4-Н7. Химические сдвиги сигналов протонов двойных связей и значения констант спин-спинового взаимодействия Н9-Н10 и Н1'-H2' (5.4, 6.8 м.д., J = 11.0 Гц и 6.09, 5.11 м.д., J = 12.2 Гц) также соответствуют аналогичным сигналам этеролевой кислоты. Ключевым отличием спектра соединения (2) является значение константы спин-спинового взаимодействия H11-H12-двойной связи J = 6.2 Гц, что однозначно указывает на cis-конфигурацию этой связи (табл. 2). Таким образом, соединение (2) является (9Z,11Z,1'E)-12-(1'-гексенилокси)-9,11-додекадиеновой кислотой, т.е. 11Z-этеролевой кислотой (рис. 2). В нефотосинтезирующих органах растений, которыми являются корни и этиолированные стебли, это соединение обнаружено впервые. Ранее соединение (2) было найдено только в фотосинтезирующих тканях растений [17, 28].

Таблица 2.

Химические сдвиги для соединения (2) — 11Z-этеролевой кислоты (метилового эфира). 600 МГц, 298 К, [2H6]бензол

Протон Химический сдвиг, δ, м.д. Мультиплетность Константа спин-спинового взаимодействия, Гц
H2 2.11 т 7.4 (H3)
H3 1.52 м  
H4 1.18 м  
H5 1.18 м  
H6 1.18 м  
H7 1.18 м  
H8 2.11 м 1.4; 7.4 (H9)
H9 5.40 м 1.4; 7.4 (H8); 11.0 (Н10)
H10 6.80 м 1.1; 1.6; 11.0 (Н9) 11.5 (Н11)
H11 5.51 ддд 1.1; 6.2 (Н12); 11.5 (Н10)
H12 6.00 д 6.2 (Н11)
H1′ 6.09 дт 1.4; 12.2 (H2′)
H2′ 5.11 дт 7.5; 12.2 (H1′)
H3′ 1.75 м  
H4′ 1.18 м  
H5′ 1.18 м  
H6′ 0.83 т 7.1 (H5′)
H(OMe) 3.36 с  
Рис. 2.

Соединения (1),(2), (3) и (4), структура и фрагментация в масс-спектре электронного удара.

Образование соединений (1) и (2) (положение кислорода эфирной группы на месте тринадцатого атома углерода) свидетельствует о том, что превращение линолевой кислоты в эти дивиниловые эфиры опосредовано, в первую очередь, действием 13-региоспецифичной липоксигеназы, а затем и дивинилэфирсинтазы. На схеме приведен механизм превращения линолевой кислоты в дивиниловый эфир – этеролевую кислоту. Ранее было показано, что данный механизм реализуется в луковицах чеснока [23].

Схема 1 . Механизм превращения линолевой кислоты в (9Z,11E,1'E)-12-(1'-гексенилокси)-9,11-додекадиеновую кислоту (этеролевую кислоту).

Минорное соединение (3) имело в масс-спектре фрагментацию, которая позволяла предположить, что оно может являться дивиниловым эфиром, образующимся в результате действия другой, а именно 9-региоспецифичной липоксигеназы, что не исключает присутствия 9-липоксигеназной активности в исследуемых тканях. Для выявления роли 9-липоксигеназы в метаболизме линолевой кислоты гомогенат корней спаржи A. officinalis L. проинкубировали с 9-гидроперекисью линолевой кислоты (9-HPOD). На рис. 3 приведен профиль продуктов инкубации, он заметно отличался от такового, приведенного на рис. 1 – значительно выросло содержание соединения (3) и появилось соединение (4).

Рис. 3.

Продукты инкубации (в виде метиловых эфиров) 9-HPOD с 15000 g супернатантом корней спаржи A. officinalis L. ГХ-МС-анализ, хроматограмма по полному ионному току.

Согласно данным ГХ-МС-анализа, соединение (4) имеет такую же-молекулярную массу (М+ при m/z 308) и фрагментацию, что и соединение (3), но отличается временем выхода и соответствует метиловому эфиру (8E,1'E,3'Z)-9-(1',3'-нонадиенилокси)-8-ноненовой, т.е. колнелевой кислоты (табл. 1).

Для определения точной структуры соединения (3) были записаны его 1H-ЯМР спектр и гомоядерный корреляционный спектр 1H-1H-COSY (рис. 4). В слабопольной области спектров ЯМР наблюдаются шесть хорошо разрешенных мультиплетных сигналов олефиновых протонов. Проследив пути переноса намагниченности по наличию кросспиков в спектре 1H-1H-COSY, удалось выполнить практически полное соотнесение спектральных линий (табл. 3). Химические сдвиги сигналов протонов одинарных связей соединения (3) полностью соответствуют химическим сдвигам сигналов протонов колнелевой кислоты. Важным отличием, позволяющим утверждать, что соединение (3) является изомером колнелевой кислоты, послужила геометрия Н1'-H2'-двойной связи (хим. сдвиг протонов 6.00 и 5.51 м.д. соответственно). Значение константы спин-спинового взаимодействия этой двойной связи J = 6.2 Гц указывает на cis-конфигурацию. Таким образом, соединение (3) является (8E,1'Z,3'Z)-9-(1',3'-нонадиенилокси)-8-ноненовой, т.е. 1'Z-колнелевой кислотой. Его масс-спектр и фрагментация приведены на рис. 2.

Рис. 4.

Корреляционный спектр ЯМР 1H-1H-COSY соединения (3), записанный в [2H6]бензоле при температуре 298 К.

Таблица 3.

Химические сдвиги для соединения (3) — 1'Z-колнелевой кислоты (метилового эфира). 600 МГц, 298 К, [2H6]бензол

Протон Химический сдвиг, δ, м.д. Мульти-плетность Константа спин-спинового взаимодействия, Гц
H2 2.10 т 7.5 (Н3)
H3 1.52 м  
H4 1.12 м  
H5 1.12 м  
H6 1.12 м  
H7 1.72 м  
H8 5.10 дт 7.4 (Н7); 12.2 (Н9)
H9 6.10 д 12.2 (Н8)
H1′ 6.00 д 6.2 (H2′)
H2′ 5.51 ддд 0.7; 6.2 (H1′); 11.4 (H3′)
H3′ 6.80 дд 10.9 (H4′); 11.4 (H2′)
H4′ 5.41 дт 7.6 (H5′); 10.9 (H3′)
H5′ 2.12 м  
H6′ 1.33 м  
H7′ 1.24 м  
H8′ 1.23 м  
H9′ 0.87 т 7.1 (H8′)
H(OMe) 3.37 с  

Полученные данные демонстрируют наличие в корнях и этиолированных стеблях спаржи активности дивинилэфирсинтазы, эффективно утилизирующей как 13-HPOD, так и 9-HPOD. Ранее 13/9-дивинилэфирсинтазы были обнаружены в листьях ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.), луковицах чеснока (Allium sativa L.), а также корнях ландыша (Convallaria majalis L.) и ириса (Iris germanica L.) [10, 17, 22, 27]. В листьях ломоноса дивинилэфирсинтаза утилизировала преимущественно 9- и 13-гидроперекиси α-линоленовой кислоты, приводя к образованию 8Z-колнеленовой и ω5Z-этероленовой кислот, соответственно [17]. Три остальных растения, филогенетически близких спарже и принадлежащих к порядку Asparagales, синтезировали этеролевую и колнелевую кислоты из 13-HPOD и 9-HPOD, соответственно [10, 22, 27]. Однако в отличие от этих объектов в корнях и этиолированных стеблях спаржи синтезируется совсем другой набор продуктов, а именно, происходит преимущественное превращение 13-HPOD и 9-HPOD в 11Z-этеролевую и 1'Z-колнелевую кислоты. Это указывает на наличие в спарже новой дивинилэфирсинтазы.

На данный момент не ясно, какое физиологическое значение могут иметь различия в субстратной специфичности дивинилэфирсинтаз и геометрической изомерии образуемых ими продуктов. Известно, что дивинилэфирсинтазы участвуют во врожденном иммунитете растений [29], экспрессия их генов индуцируется в ответ на атаки патогенов [30], а образуемые ими дивиниловые эфиры проявляют высокую цитостастическую активность по отношению к некоторым фитопатогенным бактериям [31]. Кроме того, было описано формирование системной устойчивости растений ячменя к патогенному грибу Blumeria graminis при обработке первых листьев дивиниловыми эфирами, колнелевой и этеролевой кислотами [32]. Возможно, что разнообразие дивинилэфирсинтаз и, соответственно, дивиниловых эфиров в разных растениях имеет адаптивное значение при формировании устойчивости растений к различным патогенным организмам.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Растительный материал – спаржа A. officinalis L. – был приобретен в специализированном магазине и выращен на опытном участке. Корни и/или стебли спаржи измельчали на холоду (4°С, 50 мM Трис-HCl, рН 7.5), гомогенизировали, гомогенат центрифугировали (15 000 g, 4°С, 15 мин). Супернатант использовали в экспериментах. Инкубации ферментного препарата с линолевой кислотой и ее 9- и 13-гидроперекисями проводили, как было описано в работе [22]. Гидроперекиси были предварительно очищены с помощью ВЭЖХ на обращенной и нормальной фазах. Продукты инкубации метилировали диазометаном. Индивидуальные продукты (в виде метиловых эфиров) очищали с помощью ВЭЖХ на обращенной и нормальной фазах. Для ВЭЖХ-анализа использовали хроматографическую систему Gilson (Франция), состоящую из двух насосов (305 и 306), манометрического модуля и ручного инжектора Rheodyne 7125 (Rheodyne, США). Хроматография на колонках с обращeнной фазой (C18) использовалась во всех экспериментах как первый этап разделения оксигенированных жирных кислот. В качестве детектора применяли спектральный детектор с диодной матрицей SHIMADZU SPD-M20A (Япония). Очищенные продукты анализировали методом газовой хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС) в виде метиловых эфиров. Был использован газовый хроматомасс-спектрометр SHIMADZU QP5050 (Япония). Колонка MDN-5S (5% фенил-, 95% метилполисилоксан), 30 м, 0.25 мм в режиме программирования температур от 120 до 240°С (10°С/мин), газ-носитель – гелий.

Спектры 1Н-ЯМР и COSY регистрировали на спектрометре Bruker Avance III 600. Условия съемки: 600 МГц, 298К, [2H6]бензол.

БЛАГОДАРНОСТИ

ГХ-МС-исследования проводились при финансовой поддержке Российского научного фонда грант № 16-14-10286. ВЭЖХ исследования проводились при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований грант № 18-04-00508А.

Список литературы

  1. Blee E. // Prog. Lipid Res. 1998. V. 37. P. 33–72.

  2. Feussner I., Wasternack C. // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. V. 53. P. 275–297.

  3. Howe G.A, Schilmiller A.L. // Curr Opin Plant Biol. 2002. V. 5(3). P. 230–236.

  4. Nelson D.R., Goldstone J.V., Stegeman J.J. // Phil. Trans. R. Soc. 2013. B. 368 20120474.

  5. Gullner G., Künstler A., Király L., Pogány M., Tóbiás I. // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2010. V. 74. P. 387–393.

  6. Hughes R.K., Domenico S. De, Santino A. // ChemBioChem. 2009. V. 10. P. 1122–1133.

  7. Itoh A., Howe G.A. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 3620–3627.

  8. Stumpe M., Kandzia R., Göbel C., Rosahl S., Feussner I. // FEBS Lett. 2001. V. 507. P. 371–376.

  9. Fammartino A., Cardinale F., Göbel C., Mène-Saffrané L., Fournier, I. Feussner J., Esquerré-Tugayé M.T. // Plant Physiol. 2007. V. 143. P. 378–388.

  10. Stumpe M., Carsjens J.-G., Göbel C., Feussner I. // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 907–915.

  11. Gogolev Y.V., Gorina S.S., Gogoleva N.E., Toporkova Y.Y., Chechetkin I.R., Grechkin A.N. // Biochim. Biophys. Acta. 2012. V. 1821(2). P. 287–294.

  12. Gorina S.S., Toporkova Y.Y., Mukhtarova L.S., Chechetkin I.R., Khairutdinov B.I., Gogolev Y.V., Grechkin A.N. // Biochim. Biophys. Acta – Mol. Cell Biol. Lipids. 2014. V. 1841(9). P. 1227–1233.

  13. Gorina S.S., Toporkova Y.Y., Mukhtarova L.S., Smirnova E.O., Chechetkin I.R., Khairutdinov B.I., Gogolev Y.V., Grechkin A.N. // Biochim. Biophys. Acta – Mol. Cell Biol. Lipids. 2016. V. 1861(4). P. 301–309.

  14. Proteau P.J., Gerwick W.H. // Lipids. 1993. V. 28. P. 783–787.

  15. Jiang Z.D., Gerwick W.H. // Lipids. 1997. V. 32. P. 231–235.

  16. Hamberg M. // Lipids. 2002. V. 37. P. 427–433.

  17. Hamberg M. // Lipids. 2004. V. 39. P. 565–569.

  18. Chechetkin I.R., Blufard A., Hamberg M., Grechkin A.N. // Phytochemistry. 2008. V. 69. P. 2008–2015.

  19. Galliard T., Phillips D.R. // Biochem. J. 1972. V. 129. P. 743–753.

  20. Galliard T., Phillips D.R., Frost D.J. // Chem. Phys. Lipids. 1973. V. 11. P. 173–180.

  21. Galliard T., Mathew J.A. // Biophys. Acta. 1975. V. 398. P. 1–9.

  22. Ogorodnikova A.V., Latypova L.R., Mukhitova F.K., Mukhtarova L.S., Grechkin A.N. // Phytochemistry. 2008. V. 69. P. 2793–2798.

  23. Grechkin A.N., Fazliev F.N., Mukhtarova L.S. // FEBS Lett. 1995. V. 371. P. 159–162.

  24. Grechkin A.N., Hamberg M. // FEBS Lett. 1996. V. 388. P. 112–114.

  25. Grechkin A.N., Ilyasov A.V., Hamberg M. // Europ. J. Biochem. 1997. V. 347. P. 137–142.

  26. Stumpe M., Carsjens J.G., Gobel C., Feussner I. // J. Exp. Bot. 2008. V. 59. P. 907–915.

  27. Огородникова А.В., Мухитова Ф.К., Гречкин. А.Н. // Доклады академии наук. 2013. Т. 449(6). С. 719–721.

  28. Ogorodnikova A.V., Mukhitova F.K., Grechkin A.N. // Phytochemistry. 2015. V. 118. P. 42–50.

  29. Balaji V., Sessa G., Smart C.D. // Phytopathology. 2011. V. 101. P. 349–357.

  30. Grechkin A.N. // Prostag. Oth. Lipid Mediat. 2002. V. 70. P. 157.

  31. Prost I. et al. // Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 1902–1913.

  32. Grechkin A.N. // Prostag. Oth. Lipid Mediat. 2002. V. 70. P. 157.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал