Биоорганическая химия, 2019, T. 45, № 2, стр. 184-192

ВВЕДЕНИЕ

Бактериальные инфекции у глубоко недоношенных детей имеют склонность к быстрой генерализации и тяжелому течению в силу недостаточного формирования компонентов врожденного иммунитета на ранних сроках гестации. В частности, пневмония и сопутствующий ей сепсис являются одной из причин возникновения угрожающих жизни состояний при недоношенности. Развитие данных осложнений может быть вызвано отсроченной постановкой диагноза и, как следствие, поздним началом целенаправленной терапии [1].

Ранняя диагностика септического процесса у недоношенных новорожденных достаточно сложна ввиду неспецифического характера клинических симптомов, отсутствия надежных диагностических биомаркеров. Основными методами обследования новорожденных детей при подозрении на развитие сепсиса в настоящее время являются микробиологические (посев крови на стерильность), клинико-лабораторные (клинический анализ крови с определением количества лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови, подсчет нейтрофильного индекса, определение белков острой фазы воспаления) и инструментальные (рентгенологическое исследование органов грудной полости) [2]. Анализ гемокультуры, считающийся на сегодняшний день “золотым стандартом” в диагностике септических состояний, имеет низкую чувствительность и требует длительного времени для проведения исследования. Частота обнаружения возбудителя в крови у больных с сепсисом по данным различных авторов не превышает 45%, а отсутствие бактериемии не исключает развития сепсиса при наличии основных критериев этого заболевания [3, 4]. В случае выявления возбудителя сепсиса у новорожденных, как правило, требуется не менее 48 ч для идентификации вида и определения чувствительности к антибиотикам. Кроме этого, учитывая незначительное количество возбудителя в кровотоке у новорожденных, прямое определение микроорганизмов в крови может иметь недостаточную чувствительность для ранней диагностики [5, 6].

Таким образом, разработка альтернативных подходов диагностики развития воспалительных патологических процессов, особенно в первые часы жизни новорожденного, является актуальным направлением исследований в современной неонатологии.

В последние годы значительный интерес проявляется к профилированию белков и метаболитов в плазме крови человека с целью поиска диагностических и прогностических маркеров патологических процессов. Высокопроизводительный анализ молекулярного состава компонентов биологических сред стал возможен благодаря совершенствованию и доступности оборудования для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии (МС). В ряде работ с использованием методов ВЭЖХ-МС было показано значительное изменение состава липидов плазмы крови у взрослых пациентов при развитии системного воспаления [7, 8]. При этом, изменение липидного состава плазмы крови при воспалительных процессах у недоношенных детей остается малоизученным. В данной работе мы провели профилирование липидов плазмы крови у новорожденных детей первых суток жизни, имеющих очень низкую и экстремально низкую массу тела. В исследовании был осуществлен мониторинг изменения профилей липидов при развитии пневмонии, а также при осложнении пневмонии сепсисом. В качестве группы сравнения исследовались пациенты с респираторным дистресс-синдромом, являющимся неинфекционной патологией органов дыхания у новорожденных. Анализ полученных данных выявил характерные изменения профилей липидов у исследуемых групп пациентов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В исследовании был проведен анализ образцов плазмы крови недоношенных детей первых суток жизни, у которых впоследствии были диагностированы респираторный дистресс-синдром (РДС), пневмония и пневмония, осложнившаяся сепсисом. С использованием метода ВЭЖХ-МС были получены данные о молекулярном составе экстрактов исследуемых образцов плазмы крови. Экстракция плазмы крови органическими растворителями приводит к преимущественному выделению гидрофобных метаболитов, в том числе различных классов липидов и их производных. Важной особенностью жидкостной хроматографии гидрофильных взаимодействий, используемой в данной работе, является разделение смесей липидов на отдельные классы и подклассы, с характерными интервалами времен удерживания [9]. Для установления соответствия интервалов времен удерживания различным классам липидов использовался анализ с помощью тандемной масс-спектрометрии, позволяющей идентифицировать липид по точной массе иона и пикам в его тандемных масс-спектрах, которые характерны для того или иного класса [10]. После установления диапазонов времен удерживания различных классов липидов, их идентификацию проводили на основании точной массы и времени удерживания. Репрезентативные хроматограммы и масс-спектры экстрактов плазмы крови представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Характерные хроматограммы и масс-спектр экстрактов липидов плазмы крови, зарегистрированные в режиме положительных ионов: (а) – хроматограмма полного ионного тока с указанными примерными диапазонами времен выхода идентифицированных классов липидов; (б) – хроматограммы экстрагированных токов ионов, представляющих отдельные классы липидов: 1 – PE 34:6; 2 – LPE 20:4; 3 – PC 30:0; 4 – SM 34:1; 5 – LPC 20:4; (в) – масс-спектр, усредненный по диапазону времен удерживания фосфатидилхолинов.

После выравнивания хроматограмм, детектирования пиков и удаления шумовых сигналов при помощи программного пакета Progenesis, с учетом примененных параметров было обнаружено 64 884 иона в диапазоне m/z от 100 до 1500, в том числе 20 260 однозарядных ионов, которые были отобраны для дальнейшего анализа. С использованием встроенных в программное обеспечение методов были также проведены сравнения площадей хроматографических пиков для исследуемых групп и статистическая оценка достоверности их отличий.

Для уменьшения размерности многокомпонентных наборов данных и для визуализации кластеризации групп образцов по профилям метаболитов был применен анализ методом главных компонент (Principal component analysis – РСА) [11]. Как показано на рис. 2, анализ профилей метаболитов у недоношенных детей с РДС или пневмонией позволил выявить четкую кластеризацию точек данных, соответствующих группам с разными патологиями, что свидетельствует о существенных различиях между этими группами по уровням метаболитов. Также были показаны (рис. 3) разделение и кластеризация образцов, соответствующих группам пациентов с пневмонией и пневмонией, осложненной сепсисом.

Рис. 2.

График счетов, построенный по результатам применения метода главных компонент для ВЭЖХ-МС профилей метаболитов для групп недоношенных детей с пневмонией (1) и РДС (2).

Рис. 3.

График счетов, построенный по результатам применения метода главных компонент для анализа ВЭЖХ-МС профилей метаболитов для групп недоношенных детей с пневмонией (1) и пневмонией, осложненной сепсисом (2).

Для выявления липидов, обеспечивающих кластеризацию образцов в группах сравнения, был проведен сравнительный анализ кратности и достоверности изменений площадей хроматографических пиков между группами. Для дальнейшей идентификации выбирали те пики, у которых усредненные по группе площади отличались более, чем в два раза с достоверностью на уровне p < 0.05. Аннотацию дифференциально представленных ионов проводили по выявленным характерным временам удерживания для отнесения к тому или иному классу и по их массе, используя базу данных липидов Lipidmaps, с допустимой ошибкой определения массы не более 10 м.д. В качестве возможных способов образования ионов липидов рассматривали протонирование [M + H]⁺, а также присоединение катионов натрия [M + Na]⁺ или аммония [M + NH₄]⁺. Результаты идентификации липидов приведены в табл. 1. Анализ уровней липидов при попарном сравнении между группами “Пневмония” и “РДС”, а также “Пневмония” и “Пневмония + Сепсис” выявил соединения, относящиеся к основным классам липидов, с разнонаправленными изменениями в сравниваемых группах. Так, при сравнении профилей липидов в группах пациентов с пневмонией и пневмонией, осложненной сепсисом, большая часть дифференциально представленных липидов относится к ди- и триглицеридам. Обращает на себя внимание преимущественное снижение содержания ряда диглицеридов и повышение уровня триглицеридов у пациентов группы “Пневмония + Сепсис”.

Заметные изменения наблюдались также в содержании фосфатидилхолинов и выражались в преимущественном снижении содержания представителей данного класса липидов в группе “Пневмония + Сепсис” по сравнению с группой “Пневмония”. При сравнении образцов групп пациентов с пневмонией и РДС в основном наблюдалось заметное увеличение содержания диглицеридов, а также фосфатидилэтаноламинов.

Повышение уровня триглицеридов при различных инфекционных процессах и при сепсисе у детей и взрослых было показано ранее в ряде работ [12, 13]. Также, в работе [14] была выявлена корреляция между повышением уровня триглицеридов в сыворотке и снижением смертности пациентов с сепсисом.

Повышение уровня триглицеридов может быть связано с замедлением их гидролиза (о чем может свидетельствовать наблюдаемое нами понижение уровня диглицеридов) и повышением их биосинтеза. В моделях на животных было показано повышение уровня триглицеридов при участии провоспалительных цитокинов, образующихся при развитии воспалительного процесса [15].

В частности, TNF-α способен стимулировать накопление жирных кислот и синтез триглицеридов клетками печени, а также тормозить распад липопротеинов очень низкой плотности, которые обеспечивают транспорт триглицеридов [16]. Липопротеины, в свою очередь, способны оказывать иммуномодулирующее действие за счет связывания гидрофобных бактериальных токсинов и ингибирования их взаимодействия с рецепторами активации острого иммунного ответа, чем, возможно, объясняется неблагоприятный прогноз у пациентов с генерализованным инфекционным процессом при пониженном уровне липопротеинов в крови [17, 18].

Важно отметить, что во всех работах по исследованию уровня липидов и липопротеинов плазмы крови при инфекционных процессах и сепсисе анализ проводился у пациентов с выраженными проявлениями осложнений и установленным диагнозом. Таким образом, регистрируемые изменения соответствовали наступившей острой фазе воспалительного процесса. В нашем исследовании был проведен анализ состава липидов до манифестации выраженных симптомов и развития осложнений. Поскольку одним из критериев успешной терапии сепсиса является ранняя диагностика и быстрое начало адекватного лечения, идентификация специфичных маркеров, способных дифференцировать сепсис от других воспалительных процессов, необходима для контроля за угрожающими состояниями у недоношенных детей раннего срока гестации.

Необходимо отметить, что в большинстве опубликованных работ изменения уровня липидов оценивались по результатам измерения общего содержания триглицеридов, холестерина и липопротеинов, тогда как профилирование отдельных соединений из основных классов липидов практически не проводилась. Недавно, Мекатти (Mecatti G.C.) c соавторами [19] в своей работе провели профилирование липидов при изучении сепсиса у пациентов старше 35 лет. Авторы показали снижение содержания фосфосфинголипидов и лизофосфатидихолинов, а также повышение фосфатидилхолинов в плазме крови пациентов, страдающих сепсисом. В наших исследованиях наблюдалось преимущественное снижение уровня фосфатидилхолинов в группе “Пневмония + Сепсис” по сравнению с группой “Пневмония”, тогда как в группе “Пневмония” отмечалось преимущественное повышение уровня представителей фосфатидилэтаноламинов и сфингомиелинов по сравнению с группой РДС.

Некоторые расхождения в направлении изменений содержания липидов, в частности фосфатидилхолинов, могут быть связаны с возрастными особенностями, стадией развития процесса, а также отсутствием “нормального контроля” без патологий в условиях недоношенности у исследуемых групп детей. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными о том, что сам по себе воспалительный процесс и ассоциированные с ним патологии в значительной степени изменяют обмен липидов в пораженных органах и их представленность в крови. Эти изменения отличаются при различных патологиях, таких как сепсис, пневмония или РДС, что позволяет с помощью исследования липидного профиля не только идентифицировать воспаление как таковое, но и дифференцировать связанные с ним заболевания.

Выявленные нами различия в составе плазмы крови при указанных заболеваниях свидетельствуют о необходимости дальнейшего прицельного поиска, структурной и количественной идентификации отдельных соединений в качестве потенциальных липидных маркеров. Кроме этого, необходима оценка динамики изменений липидов плазмы в сопоставлении с динамикой развития заболевания и его тяжестью, что позволит оценить диагностическую и прогностическую ценность липидных маркеров, а также их роль в патогенезе ассоциированных заболеваний.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Образцы. Для исследования были взяты образцы крови (500 мкл) в первые часы жизни у недоношенных новорожденных детей со сроком гестации от 24 до 31 недель. Образцы крови получали до начала терапевтических мероприятий по поводу осложнений. Образцы крови с признаками гемолиза не использовали в исследовании. Плазму крови выделяли сразу после забора. Для ее получения образцы центрифугировали 20 мин при 300 g и 4°С, супернатант отбирали и центрифугировали при 14 000 g 10 мин и комнатной температуре. Полученную плазму крови хранили до анализа при –80°С.

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом ФГБУ “НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова” Минздрава России. От представителей пациентов было получено информированное согласие на проведение исследования.

На основании установленного диагноза для анализа было отобрано 22 образца из группы пациентов с пневмонией, 11 образцов из группы пациентов с пневмонией, осложненной сепсисом, и 4 образца из группы пациентов с респираторным дистресс-синдромом. В исследование не вошли образцы пациентов, у которых развились другие патологии одновременно с указанными выше.

Экстракция и ВЭЖХ-анализ. Экстракцию липидов и других гидрофобных метаболитов из плазмы крови проводили смесью метанола, хлороформа и метил-трет-бутилового эфира в соотношении 4 : 3 : 3 [20]. Для этого к 100 мкл плазмы добавляли 1900 мкл смеси растворителей, перемешивали 25 мин, и центрифугировали 10 мин при 10 000 g и комнатной температуре. Супернатант отбирали и высушивали в струе азота. Полученный экстракт перерастворяли в 50 мкл смеси ацетонитрила и изопропанола (1 : 1).

ВЭЖХ-МС-анализ проводили в хроматографической системе Ultimate 3000 Nano LC System (Thermo Scientific, США), подключенной к масс-спектрометру с гибридным квадруполь-времяпролетным масс-анализатором и источником ионов с ионизацией электрораспылением Maxis Impact (Bruker Daltonics, Германия). Хроматографическое разделение образца выполняли на колонке Spherisorb HILIC длиной 25 см, с внутренним диаметром 1 мм и зерном сорбента 5 мкм (Элсико, Россия). Элюирование компонентов образцов проводили в градиенте подвижной фазы, состав которой менялся от 5 до 30% элюента “В” (5 мМ раствор ацетата аммония в воде) в элюенте “А” (ацетонитрил) в течение 21.5 мин при скорости потока 50 мкл/мин, затем колонку промывали и уравновешивали 3.5 мин 5% раствором фазы “В”. Общее время хроматографического анализа одного образца составляло 25 мин, температура колонки 40°С, объем вводимого образца 3 мкл. Каждый образец анализировали три раза. Масс-спектры получали при разрешении 50 000 в диапазоне m/z 100–1500, в режиме положительно заряженных ионов. Параметры источника ионов были следующие: напряжение на игле 4.5 кВ, давление распыляющего газа 0.3 бар, поток осушающего газа 4 л/мин, температура осушающего газа 180°С.

Для определения характерных для каждого класса времен удерживания использовали соответствующие стандарты (любезно предоставлены лабораторией химии липидов ИБХ РАН). Также для идентификации масс-спектрометрических пиков ряд анализов был выполнен с применением метода тандемной масс-спектрометрии с окном изоляции ионов, равным m/z 5 и энергией столкновений 25 эВ.

Обработку и анализ полученных масс-спектрометрических данных проводили программным пакетом Progenesis QI 2.0 (Waters, Milford, США). В качестве характеристических отбирали пики, соответствующие однозарядным ионам и достоверно отличающиеся между исследуемыми группами минимум в 2 раза. Достоверность отличия проверяли с помощью теста ANOVA статистическим модулем, входящим в программный пакет, с порогом достоверности p-value < 0.05. Для выбранных пиков было проведено сравнительное исследование различных групп эмбриональных сред методом анализа главных компонент (PCA) [11]. Для первичной идентификации отличающихся пиков использовали базу данных LipidMaps (http://www.lipidmaps.org).

БЛАГОДАРНОСТИ

Сотрудникам лаборатории химии липидов ИБХ РАН: д. х. н. Е.Л. Водовозовой и к. х. н. И.А. Болдыреву за предоставленные стандарты липидов.

Заведующей биобанка НМИЦ АГП им. В.И. Ку-лакова, С.М. Муллабаевой.

Разработка метода ВЭЖХ-МС-анализа образцов и анализ данных выполнены при финансовой поддержке РНФ (Соглашение № 16-14-00029).