Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 1, стр. 36-46

Выбор стратегии синтеза

Последовательность 29-членного галанина, приведенная на рис. 1, представляется достаточно сложной для ступенчатого твердофазного синтеза (ТФС). При многостадийном ТФС длинных пептидов за счет неколичественных выходов на стадиях деблокирования α-аминогрупп и последующего создания амидных связей образуются “ложные” пептиды с пропуском (делецией) отдельных аминокислотных остатков или их сочетаний. Последовательность галанина содержит ряд трифункциональных аминокислот (таких как Trp, Asp, Ser, Thr, Arg), легко вступающих в побочные реакции в ходе ТФС или постсинтетических процедур. Так, например, при синтезе аспартилпептидов на стадиях отщепления Fmoc-защит действием вторичных аминов происходит образование циклического аспартимида, результатом чего является α→β-перегруппировка амидной связи с образованием изомерного побочного продукта.

Рис. 1.

Аминокислотная последовательность галанина крысы (G29). Стрелками показаны места разбиения на фрагменты.

Образование аспартимида, катализируемое кислотой или основанием, является одной из наиболее серьезных побочных реакций в ТФС пептидов, содержащих аспарагиновую кислоту, и до сих пор не разработана экономически эффективная стратегия ее подавления [12, 13]. Степень протекания транспептидации главным образом определяется конкретной аминокислотной последовательностью. Наиболее подвержены этой побочной реакции последовательности Asp-Gly, Asp-Asn, Asp-Asp [14, 15]. Для подавления транспептидации применяют различные методические приемы (использование объемных, стерически затрудненных защитных групп для β-карбоксильной функции аспарагиновой кислоты, модификации деблокирующего реагента для отщепления Fmoc-защиты, сокращение суммарного времени воздействия основных реагентов), однако полностью исключить эту побочную реакцию до сих пор не удается. В связи с вышесказанным очистка продукта ТФС, содержащего близкие по составу и свойствам примеси, – сложный многостадийный процесс.

Для преодоления перечисленных проблем был разработан конвергентный, или блочный [16–18] синтез полипептидов. В соответствии с этой стратегией последовательность пептида разбивается на относительно короткие фрагменты, которые получают на твердой фазе или в растворе и, после соответствующей очистки, конденсируют на полимерном носителе или в растворе. Этот метод был успешно применен при синтезе ряда полипептидов, насчитывающих от 24 до 100 а.о. [19–21]. В нашей лаборатории этот подход был использован в синтезе последовательности 1-42-β-амилоида [22] и 26-членного фрагмента, соответствующего иммунодоминантной последовательности 197–222 β₁-адренорецептора [23]. Сравнительная оценка ступенчатого и фрагментного синтеза этих двух пептидов убедительно показала преимущества последнего подхода [22–24].

В этой связи для получения галанина был выбран комбинированный способ наращивания пептидной цепи: на отдельный участках пошагово, а на других – конденсацией фрагментов. Последовательность пептида была разбита на фрагменты по остаткам глицина (разбиение показано стрелками на рис. 1), соответствующие последовательностям 23–27 (ФI), 9–12 (ФII) и 1–8 (ФIII). На участке 13–22, не содержащем “удобных” для фрагментации (нерацемизующихся при конденсации) аминокислотных остатков, было решено наращивать пептидную цепь ступенчато по одной аминокислоте. В сочетании с Fmoc-защитой α‑аминогруппы для блокирования боковых функций аминокислот использовали Bu^t – для гидроксильных групп Ser, Thr, Tyr и карбоксильной группы Asp; Boc – для ε-аминогруппы Lys и индольного кольца Trp; Pbf – для гуанидиновой группы Arg; Trt – для карбоксамидной группы Asn и имидазола His.

Синтез защищенных фрагментов

Синтез фрагментов ФI и ФIII был проведен с использованием Fmoc-методологии на полимерном носителе с 2-хлортритил-хлоридной якорной группой [24], которая обеспечивает получение защищенных пептидных блоков со свободной С‑концевой карбоксильной группой благодаря возможности “мягкого” расщепления якорной сложноэфирной связи (например, действием смеси уксусной кислоты и трифторэтанола в дихлорметане), при котором сохраняются защитные группы боковых цепей аминокислот.

Фрагмент ФII был получен классическими методами пептидной химии в растворе по схеме 1 , исходя из бензилового эфира глицина. Пептидную цепь наращивали с использованием Boc- и Z-производных соответствующих аминокислот последовательным синтезом с использованием избытков смешанных ангидридов [25]. Полупродукты синтеза выделяли из реакционных смесей путем экстракции и промывок с последующей кристаллизацией из подходящих растворителей. Индивидуальность полупродуктов получения фрагмента ФII контролировали с помощью ТСХ. Вос-группу удаляли действием трифторуксусной кислоты, а Z-защиту отщепляли каталитическим гидрогенолизом над 5% палладием на угле (Pd/C). На заключительной стадии синтеза ФII после отщепления Z-группы в пептид вводили Fmoc-защитную группу действием Fmoc-ONSu по известной методике [26].

Схема 1 . Синтез пептидного фрагмента Fmoc-Tyr(Bu^t)-Leu-Leu-Gly-OH (ФII).

Индивидуальность полученных фрагментов ФI–ФIII анализировали с помощью ТСХ и ВЭЖХ (после полного деблокирования соответствующих образцов). По данным аналитической ВЭЖХ чистота полученных фрагментов была не менее 90%. Структура пептидных фрагментов ФI–ФIII подтверждена данными ¹Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Характеристики фрагментов приведены в эксп. части.

Синтез галанина G29

ТФС G29 проводили с С-конца (см. схему 2 ) с использованием 3-кратных избытков N^α-Fmoc-защищенных аминокислот и пептидных фрагментов на амидном полимере Ринка. На первом этапе синтеза ступенчато присоединяли остатки Thr²⁹ и Leu²⁸, затем к дипептидилполимеру PI присоединяли пептапептид ФI и получали гептапептидилполимер PII. Начиная с Phe²² и до Pro¹³ (в течение 10 циклов ТФС) синтез вели ступенчато, присоединяя по одной аминокислоте DIC/HOBt-методом. На завершающем этапе к пептидилполимеру РIII последовательно присоединяли блоки ФII и ФIII. Для конденсации пептидных фрагментов мы использовали комплекс F (аддукт N,N '-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в мольном соотношении 1 : 3) [21], хорошо зарекомендовавший себя в блочном ТФС [27]. Полноту протекания фрагментных конденсаций контролировали тестом Кайзера c нингидрином [28].

Схема 2 . Конвергентный синтез галанина крысы G29. (Комплекс F – аддукт N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в мольном отношении 1 : 3.)

Деблокирование α-аминогруппы в ходе синтеза G29 проводили 25% раствором 4-MePip в DMF. Выше уже говорилось о том, что последовательность Asp-Asn, присутствующая в молекуле галанина, склонна к образованию аспартимида и последующей α→β-перегруппировке амидной связи в условиях ТФС с использованием Fmoc-методологии [15]. Для минимизации этой побочной реакции, начиная со стадии деблокирования остатка Asn¹⁸, для отщепления Fmoc-защиты мы использовали модифицированный деблокирующий реагент – 25% раствор 4-метилпиперидина с добавкой 0.1 М 1-гидроксибензотриазола, как было предложено в работе [29]. В результате конвергентного синтеза, проведенного в соответствии со схемой 2 , был получен пептидилполимер PV, после удаления N^α-Fmoc-защиты целевой продукт был отщеплен от полимера и полностью деблокирован действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками. Неочищенный продукт G29 содержал по данным аналитической ВЭЖХ 77.1% основного вещества (рис. 2а). Для дополнительной оценки содержания аспартимидов в неочищенном продукте ТФС галанина G29 образец N^α – свободного пептидилполимера PV был обработан деблокирующей смесью, не содержащей воды. Масс-спектрометрия полученного продукта показала, что, наряду с целевым пептидом G29 (m/z 3165.48), в его состав входит вещество с молекулярной массой на 18 Да меньше (m/z 3147.306), которое может быть побочным аспартимидом (продуктом дегидратации) по остатку аспарагиновой кислоты, участвующей в образовании связи Asp-Asn. Соотношение интенсивностей целевого и побочного продуктов в масс-спектре составило 100 : 4.6 (Δ – 18). Галанин был очищен с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой (рис. 2б). Полученный пептид имел корректную молекулярную массу (по данным масс-спектрометрии) и оказался идентичен коммерческому образцу галанина крысы (GeneCust, Люксембург).

Рис. 2.

Профили ВЭЖХ неочищенного (а) и очищенного (б) галанина крысы. Колонка Kromasil C18-100-5 4.6 × 250 мм, размер частиц сорбента 5 мкм; пептиды элюировали со скоростью 1 мл/мин градиентом буфера Б в буфере А от 20 до 80% за 30 мин, буфер А – 0.05 М KH₂PO₄, pH 3.0, буфер Б 70% ацетонитрил в буфере А, детекция при 220 нм (условия 1).

Таким образом, использованные нами конвергентный подход и модифицированный реагент для отщепления Fmoc-защит обеспечили получение неочищенного галанина крысы с хорошей чистотой и относительно низким содержанием побочных продуктов транспептидации (менее 2.5%); продукт, как видно на рис. 2а, не содержал трудноотделимых примесей с близкими временами удерживания. Выбранные для фрагментной конденсации пептидные блоки были хорошо растворимы в NMP, реакции образования амидной связи в присутствии комплекса F протекали достаточно быстро (в течение 4 ч) и с высокими выходами.

Оценка биологической активности пептида G29 у крыс in vivo

Нами была использована модель региональной ишемии и реперфузии сердца крыс Вистар. На начальном этапе было изучено дозозависимое влияние внутривенного введения G29 в начале реперфузии (после периода региональной ишемии) на размеры инфаркта миокарда (ИМ). Гистохимический анализ срезов левого желудочка (ЛЖ) сердца в конце реперфузии не выявил различий между экспериментальными группами в зоне риска (ЗР). Величина ЗР/ЛЖ, % в контроле, в группе G29 и растворителя пептида G29 (0.2% DMSO) была близкой и составляла в среднем 41.1 ± 0.9%. Это означает, что повреждение сердца было стандартно моделировано у всех животных. В контроле величина инфаркта миокарда, выраженная отношением ИМ/ЗР, составила 43.0 ± 2.0%. Введение 0.2% DMSO не влияло на этот показатель. Любая из изученных доз G29 достоверно ограничивала размеры ИМ (P < 0.005–0.001 (рис. 3а). В наибольшей степени отношение ИМ/ЗР (в %) снижалось под действием дозы 0.5 мг/кг – до 60% от величины в контроле. В дальнейшем она была использована в качестве оптимальной для изучения влияния пептида на активность маркеров некроза в плазме и метаболическое состояние ЗР.

Рис. 3.

Уменьшение повреждения сердца пептидом G29 у крыс in vivo. (a) Дозозависимое снижение размеров инфаркта миокарда (ИМ/ЗР, %) при внутривенном введении G29 после региональной ишемии. Данные представлены как M ± m для серий из 8 опытов. K – контроль. * P < 0.001 от К, ^# P < 0.005 от К. (б, в) Влияние внутривенного введения оптимальной дозы G29 (0.5 мг/кг) на активность креатинкиназы-МВ (-МВ- КК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в плазме в конце реперфузии. Данные представлены как M ± m для серий из 8 опытов. ИС – исходное состояние; K – контроль; DMSO – введение 0.2% DMSO. * P < 0.05 от К и DMSO.

Активность маркеров некроза креатинкиназы МВ (МВ-КК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в плазме крови в исходном состоянии (перед окклюзией ПНА) составляла 270.2 ± 28.5 и 92.8 ± ± 18.5 МЕ/л соответственно. Развитие ИМ в контроле сопровождалось увеличением активности обоих ферментов в конце реперфузии по сравнению с исходным состоянием – до 2350.1 ± ± 80.7 и 1415.0 ± 112.6 МЕ/л для МВ-КК и ЛДГ соответственно (рис. 3б, 3в). Введение оптимальной дозы G29 перед началом реперфузии достоверно снижало активность МВ-КК и ЛДГ на 25 и 30% соответственно, по сравнению с контролем.

Влияние введения пептида G29 на показатели метаболического состояния ЗР в конце реперфузии представлено в табл. 1. Ишемическое и реперфузионное повреждение вызывало значительные изменения в содержании метаболитов энергетического обмена и лактата в сердце. В контроле в конце реперфузии содержание АТP было снижено в 4.5 раза, а общий пул адениннуклеотидов (ΣAH) за счет уменьшения АDP – в 3 раза по сравнению с исходным состоянием. Содержание ФКр снижалось до 35%, что вызывало уменьшение общего креатина (ΣКр) до 64% от исходных значений при практически неизменном уровне Кр. Недостаточное восстановление аэробного обмена в ЗР к окончанию реперфузии сопровождалось активацией гликолиза/гликогенолиза. Это приводило к накоплению лактата, содержание которого увеличивалось почти на порядок по сравнению с исходным значением. Введение пептида G29 увеличивало содержание АТP (P = 0.088) и достоверно АDP и АМP (P < 0.01) по сравнению с контролем. В результате ΣAH был увеличен в 1.7 раза. Одновременно отмечено лучшее восстановление ФКр (на 48% по сравнению с контролем), что сопровождалось сохранением более высокого содержания ΣКр и отношения ФКр/Кр, отражающего фосфорилирование Кр. Эти данные свидетельствуют о более эффективном энергообеспечении ЗР под действием G29, одновременно наблюдалось снижение содержания лактата в ткани сердца до значения, близкого к исходному.

Полученные результаты однозначно указывают на способность пептида G29 уменьшать летальные повреждения кардиомиоцитов при ишемии и реперфузии сердца in vivo. Кардиозащитное действие пептида проявляется в ограничении размеров острого инфаркта, уменьшении активности маркеров некроза в кровотоке и в улучшении энергетического состояния инфарцированного миокарда.

Синтез пептидных фрагментов (общие методики)

Пептидные фрагменты ФI и ФIII получали на 2-хлортритилхлоридной смоле (Iris Biotech, ФРГ), содержащей 1.2 экв. Cl/г. К 3.0 г (3.6 ммоль) смолы прибавляли раствор 3.2 г (10.8 ммоль) Fmoc-Gly-OH в 30 мл DCM, в полученную суспензию приливали 4.25 мл (15.0 ммоль) DIEA и перемешивали 30 мин при 25°С, полимер отфильтровывали, промывали DCM 2 × 30 мл, DMF 2× 30 мл, DCM 2 × 30 мл. Остаточный хлор отщепляли смесью DCM–MeOH–DIEA (32 : 6 : : 2 v/v), промывали DCM 2 × × 30 мл и DMF 2 × × 30 мл. Содержание стартовой аминокислоты составило 0.46 ммоль Fmoc-Gly/г аминоацилполимера. При синтезе фрагментов ФI и ФIII, исходили из 3 г (1.4 ммоль) Fmoc-Gly-аминоацилполимера. Цикл ТФС включал следующие основные стадии: 1) деблокирование α-аминогрупп 25% 4-Ме Pip/DMF в течение 10 мин, 2) промывка DMF, 3) конденсация 4-кратного избытка Fmoc-AA/ DIC/HOBt в смеси DMF/NMP (1 : 1) в течение 2 ч, 4) промывка DMF. Защищенные пептиды отщепляли от полимерного носителя смесью (40 мл) AcOH–трифторэтанол–DCM (1 : 2 : 7) в течение 40 мин. Полимер отфильтровывали, промывали 2 × 30 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали, продукт осаждали сухим эфиром и после высушивания кристаллизовали из подходящего растворителя.

Фрагмент (ФII) Fmoc-Tyr(Bu^t)-Leu-Leu-Gly-OH получали, исходя из 6.74 г (20 ммоль) H-Gly-OBzl ⋅ Tos-OH, методом смешанных ангидридов по приведенной ниже методике.

К охлажденному до –15°С раствору 24.0 ммоль карбоксильного компонента в 80 мл DMF прибавляли 2.66 мл (24 ммоль) NMM и 3.12 мл (24 ммоль) изо-бутилхлорформиата, выдерживали 5 мин и приливали охлажденный до –15°С раствор 20 ммоль аминокомпонента и 2.22 мл (20.0 ммоль) NMM в 30 мл DMF. Реакционную смесь выдерживали 20 мин при –15°С и 1 ч при 0°С. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ в системе 1. В реакционную смесь прибавляли раствор KHCO₃ до начала слабого выделения углекислого газа и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в 200 мл этилацетата и промывали 2% раствором H₂SO₄ (3 × 50 мл), водой (3 × 50 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 × 50 мл) и водой до нейтральной реакции. Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали. Остаток обрабатывали трифторуксусной кислотой в течение 1 ч, реакционную смесь упаривали, трифторацетат пептида осаждали диэтиловым эфиром, осадок отфильтровывали, промывали на фильтре диэтиловым эфиром, высушивали и вводили в конденсацию с новым карбоксильным компонентом.

К раствору 10.7 г (14.4 ммоль) тетрапептида Z-Tyr(Bu^t)-Leu-Leu-Gly-OBzl в 300 мл этанола прибавляли 1.4 г 5% Pd/C и в эту суспензию при перемешивании пропускали ток водорода в течение 2 ч, затем в реакционную смесь приливали 14 мл 1 M NaOH. По окончании реакции катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали. В полученный пептид Н-Tyr(Bu^t)-Leu-Leu-Gly-ОН вводили N^α-Fmoc-защиту по описанной методике [26]. Фрагмент ФII кристаллизовали из смеси изо-пропиловый спирт–гексан.

Ниже приведены выходы и характеристики фрагментов ФI–ФIII. Кроме этого образцы полученных фрагментов были полностью деблокированы, после чего их чистоту анализировали с помощью ВЭЖХ. Содержание основного вещества в полученных образцах составило 90–95%.

Fmoc-Ser(Bu^t)-Asp(OBu^t)-Lys(Boc)-His(Trt)-Gly-OH (ФI). Получено 1.3 г (74.0% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру), R_f 0.23 (система 1), 0.62 (система 2). MS, m/z (I_отн, %): 1241.756 (100) [M + Na]⁺, 1257.777 (38) [M + K]⁺, 1263.772 (14) [M + 2Na-H]⁺. Спектр ¹H-ЯМР: 1.21 (с, 9H, –Ser(Bu^t)), 1.32–1.37 (м, 1 H, γ'CH₂, Lys), 1.37–1.42 (м, 19 H, –Asp(OBu^t ), –Boc, γCH₂, Lys), 1.41–1.60 (м, 2 H, δCH₂, Lys), 1.64–1.74 (м, 2 H, βCH₂, Lys), 2.45 (дд, 1H, J 16.5, 7.3, β'CH₂, Asp), 2.69 (дд, 1H, J 16.5, 7.4, β"CH₂, Asp), 2.74–2.96 (м, 4 H, εCH₂, Lys; βCH₂, His), 3.72 (дд, 2 H, J 6.0, 3.0, βCH₂, Ser), 3.69 (д, 2 H, J 5.8, αCH₂, Gly), 4.11–4.21 (м, 1 H, αCH, Lys), 4.24–4.28 (м, 1 H, αCH, Ser), 4.22–4.27 (м, 3 H, O(CH₂), CH, Fmoc), 4.46–4.51 (м, 1 H, αCH, His), 4.60–4.66 (м, 1 H, αCH, Asp), 6.69–6.75 (м, 1 H, εNH, Lys), 6.92–7.05 (м, 5 H, –CH, Trt), 7.16–7.21 (м, 1 H, αNH, Ser), 7.23–7.47 (м, 19 H, CH, Trt, Fmoc; C(4)H, His), 7.59–7.62 (м, 1 H, C2H, His), 7.82 (д, 1 H, J 9.3, αNH, Lys), 7.98 (д, 1 H, J 9.3, αNH, Gly), 8.1 (д, 1 H, J 9.4, αNH, His), 8.23 (т, 1 H, J 5.8, αNH, Asp).

Fmoc-Tyr(Bu^t)-Leu-Leu-Gly-OH (ФII). Получено 10.7 г (71.5% в расчете на исходный бензиловый эфир глицина), R_f 0.19 (система 1), 0.50 (система 2). MS, m/z (I_отн, %): 765.471 (100) [M + Na]⁺, 781.455 (16) [M + K]⁺, 787.456 (10) [M + 2Na-H]⁺. Спектр ¹H-ЯМР: 0.86 (дд, 12H, J 9.2, 6.8, δ(CH₃)₂, Leu), 1.18 (с, 9H, Bu^t), 1.46–1.53 (м, 4H, βCH₂, Leu), 1.59–1.61 (м, 2H, γCH, Leu), 2.71 (т, 1H, J 1.0, β'CH, Tyr), 2.93 (т, 1H, J 1.0, β"CH, Tyr), 3.69–3.74 (м, 2H, αCH₂, Gly), 4.16–4.21 (м, 3H, O(CH₂), CH, Fmoc), 4.25 (дт, 1H, J 9.1, 7.5, αCH, Tyr), 4.30–4.37 (м, 2H, αCH, Leu), 6.77–6.90 (м, 2H, C (3,5) H, Tyr), 7.12–7.19 (м, 2H, C (2,6) H, Tyr), 7.23–7.34 (м, 2H, CH, Fmoc), 7.37–7.42 (м, 2H, CH, Fmoc), 7.56 (д, 1H, J 3.5, αNH, Tyr), 7.59–7.65 (м, 2H, CH, Fmoc), 7.82–7.90 (м, 3H, CH, Fmoc, αNH, Leu), 8.08 (д, 1H, J 7.7, αNH, Leu), 8.13 (т, 1H, J 5.8, αNH, Gly).

Fmoc-Gly-Trp(Boc)-Thr(Bu^t)-Leu-Asn(Trt)-Ser(Bu^t)-Ala-Gly-OH (ФIII). Получено 1.7 г (81.8% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру), R_f 0.42 (система 1), 0.69 (система 2). MS, m/z (I_отн, %): 1458.627 (100) [(M–Bu^t) + CH₃OH + H]⁺, 1504.030 (27) [M + Na]⁺. Спектр ¹H-ЯМР: 0.88 (дд, 6H, J 20.0, 6.7, δ(CH₃)₂, Leu), 0.97 (д, 3H, J 5.8, γCH₃, Thr), 1.06-1.18 (м, 21H, Bu^t; βCH₃, Ala), 1.49–1.54 (м, 2H, βCH₂, Leu), 1.58 (с, 9H, –Boc), 1.60–1.62 (м, 1H, γCH, Leu), 2.49–2.53 (м, 1H, β'CH, Asn), 2.71–2.78 (м, 1H, β"CH, Asn), 2.91–2.97 (м, 1H, β'CH, Trp), 2.99–3.12 (м, 1H, β"CH, Trp), 3.29–3.36 (м, 1H, β'CH, Ser), 3.38–3.44 (м, 1H, β"CH, Ser), 3.68 (дд, 4H, J 9.0, 6.6, αCH₂, Gly), 3.75–3.93 (м, 1H, β CH, Thr), 3.99–4.14 (м, 3H, αCH, Ala; –CH, Fmoc; αCH, Ser), 4.19 (д, 2H, J 5.4, O(CH₂), Fmoc), 4.28–4.40 (м, 2H, αCH, Thr; αCH, Leu), 4.60 (дт, 1Н, J 9.3, 7.3, αCH, Asn), 4.78 (дд, 1Н, J 9.0, 6.6, αCH, Trp), 7.05–7.47 (м, 18H, C5H, C6H, Trp; CH, Trt; αNH, Gly), 7.50–7.64 (м, 7H, C2H, Trp; CH, Fmoc; αNH, Ser), 7.66–7.75 (м, 4H, CH, Fmoc; αNH, Leu; C4H, C7H, Trp); 7.79–8.00 (м, 4H, CH, –Fmoc; αNH, Gly; αNH, Thr), 8.01 (д, 1Н, J 9.2, αNH, Ala), 8.13 (д, 1Н, J 9.3, αNH, Trp), 8.32 (т, 1Н, J 5.8, αNH, Asn).

H-Gly-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-Ala-Ile-Asp-Asn-His-Arg-Ser-Phe-Ser-Asp-Lys-His-Gly-Leu-Thr-NH₂ (G29). Синтез галанина крысы проводили с С-конца (см. схему 2 ) исходя из 0.53 г (0.25 ммоль) полимера Ринка с содержанием аминогрупп 0.47 ммоль/г. Цикл ТФС включал следующие стадии: 1) деблокирование α-аминогрупп 25% 4-Ме Pip/DMF (2 × 5 мл в течение 5 мин); начиная со стадии пептидилполимера PIII деблокирование проводили смесью 25% 4-MePip/0.1 М HOBt в DMF (2 раза по 5 мл в течение 5 мин); 2) промывка DMF, 3) конденсация 0.75 ммоль (3-кратного избытка) Fmoc-AA/ DIC/HOBt в 3 мл смеси DMF/NMP (1 : 1) в течение 2 ч; конденсацию 0.75 ммоль фрагментов ФI–ФIII в присутствии 0.75 ммоль комплекса F проводили в 3–4 мл NMP в течение 4 ч; 4) промывка DMF. Заключительное отщепление от носителя и деблокирование галанина осуществляли действием 10 мл смеси TFА–вода–триизопропилсилан–дитиотреитол–1,3-диметоксибензол (80 : 5 : 5 : 5 : 5) в течение 1.5 ч. По окончании реакции полимер отфильтровывали, промывали 2 × × 2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали, продукт осаждали сухим диэтиловым эфиром, отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром и DCM. Неочищенный продукт ТФС лиофилизовали из 2% АсОН для полного отщепления Trp(Boc) [31]. Было получено 0.52 г неочищенного продукта с чистотой 77.1%, затем пептид очищали методом ВЭЖХ, как описано выше, до 98% чистоты. Получено 0.22 г соединения G29 (28% в расчете на стартовую аминокислоту). G29 MS, m/z: 3163.474 (М_расчет = 3164.45).

Для дополнительной оценки содержания аспартимидов в неочищенном продукте ТФС G29 50 мг N^α – свободного пептидилполимера PV обрабатывали 3 мл смеси TFА–TIS–дитиотреитол– 1,3-диметоксибензол (85 : 5 : 5 : 5) в течение 1.5 ч. Продукт (16 мг) выделяли, как описано выше. MS, m/z (I_отн, %): 3165.480 (100) [M + H]⁺, 3147.306 (4.6) [M – H₂O]⁺, 3221.481 (8.0) [M + Bu^t], 2690.148 (5.8).

Изучение пептида G29 на модели региональной ишемии и реперфузии сердца у крыс in vivo проведено на самцах крыс Wistar (300–350 г) в соответствии с “Международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с использованием животных”, принятым Международным советом медицинских научных обществ в Женеве в 1985 г.

У наркотизированных 20% уретаном (1200 мг/кг веса, внутрибрюшинно) животных в условиях торакотомии осуществляли искусственную вентиляцию легких комнатным воздухом с помощью аппарата KTR-5 (Hugo Sacks Electronik, Германия). Яремную вену катетеризировали для окрашивания сердца 1% раствором Эванса в конце опыта. Сонную артерию катетеризировали для регистрации артериального давления. После присоединения артериального катетера к тензометрическому датчику регистрировали систолическое артериальное давление (САД) и ЧСС на полиграфе Biograph-4 (Cанкт-Петербургский госуниверситет аэрокосмического приборостроения). Запись на компьютер выполнена с помощью аналого-цифрового преобразователя USB 6210 (National Instruments, США) и программы в системе LabVIEW 7 (National Instruments, США) [10]. После препарирования животного следовал 30-минутный период стабилизации гемодинамических показателей (исходное состояние), затем окклюзия передней нисходящей коронарной артерии (ПНА) в течение 40 мин, продолжительность последующей реперфузии составляла 60 мин. Пептид G29 вводили внутривенно болюсом в дозах 0.25; 0.5; 1.0 или 2.0 мг/кг веса одновременно с началом реперфузии. В контрольной серии опытов – такой же объем физиологического раствора (0.5 мл).

В отдельной серии опытов было изучено влияние растворителя пептида G29 (0.2% раствора DMSO). В конце опыта для идентификации зоны риска (ЗР) и интактной области миокарда реокклюдировали ПНА и в яремную вену вводили болюсно 2% раствор Эванса (2 мл). Затем вырезали сердце и выделяли левый желудочек (ЛЖ) для последующего определения размеров инфаркта миокарда (ИМ). Замороженный ЛЖ разрезали перпендикулярно длинной оси сердца на 4–5 срезов толщиной около 1.5–2.0 мм, которые затем инкубировали 10 мин в 1% растворе 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида в 0.1 М калий фосфатном буфере (рН 7.4 при 37°С). Полученные образцы сканировали, площади ИМ и ЗР определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу Imagecal. После этого срезы взвешивали для определения массы ЛЖ. В каждой группе рассчитывали отношения зона риска/вес левого желудочка (ЗР/ЛЖ) и инфаркт миокарда/зона риска (ИМ/ЗР) в %.

Повреждение мембран кардиомиоцитов оценивали по увеличению активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и МВ-фракции креатинкиназы (MB-КK) в плазме крови. Около 0.5 мл крови собирали в гепаринизированные пробирки из венозного катетера в исходном состоянии (перед окклюзией ПНА) и после 1 ч реперфузии. Активность ферментов в плазме определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Япония) при λ 340 нм, используя наборы фирмы BioSystems.

В отдельной серии опытов оценивали влияние внутривенного введения оптимальной дозы пептида (0.5 мг/кг) на энергетическое состояние ЗР. По окончании реперфузии ЗР быстро выделяли из ЛЖ и замораживали щипцами Волленбергера, охлажденными в жидком азоте. Замороженную ткань гомогенизировали в холодной 6% HClO₄ (10 мл/г ткани) в гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 (IKA-Labortechnik, Германия). Белки осаждали центрифугированием (центрифуга Sorvall RT1, Thermo Fisher Scientific, США) при 2800 g в течение 10 мин при 4°С. Супернатанты нейтрализовали 5 М К₂СО₃ до рН 7.4. Осадок KСlO₄ отделяли центрифугированием в тех же условиях. Безбелковые экстракты хранили при –20°С до определения метаболитов. Сухой вес гомогенизированной ткани определяли после высушивания образцов в течение 1 сут при 110°С. Содержание адениннуклеотидов, фосфокреатина (ФКр), креатина (Кр) и лактата в тканевых экстрактах определяли энзиматическими методами [32], используя спектрофотометр Shimadzu UV-1800 (Япония). Таким же образом оценивали метаболическое состояние ЗР в конце реперфузии в контроле (в опытах с внутривенным введением физиологического раствора) и в исходном состоянии (до окклюзии ПНА).