Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 6, стр. 708-718

ВВЕДЕНИЕ

Гемсодержащий белок цитохром с, один из важнейших компонентов электрон-транспортной или дыхательной цепи (ЭТЦ) митохондрий, переносит электроны от убихинол-цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс III) к цитохром с-оксидазе (комплекс IV). Наряду с участием в электронном транспорте, другой его важнейшей функцией является инициация клеточного апоптоза путем участия в формировании апоптосомы [1]. В настоящий момент значительные усилия направлены на исследование цитохрома с в качестве триггера и посредника апоптотических событий.

Программируемая клеточная гибель, или апоптоз, имеет исключительную важность для нормальной жизнедеятельности организма в целом. Во время активации каскада событий, приводящих к апоптозу клетки, цитохром с транслоцируется через внешнюю мембрану митохондрии в цитозоль, где он либо усиливает внешний апоптотический сигнал, либо инициирует активацию каспазного каскада по собственному (цитохром с-зависимому) апоптотическому пути. Ключевым событием в цитохром с-зависимом апоптотическом пути является пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны, в результате чего в цитозоль выходят различные апоптогенные факторы, в том числе и цитохром с. В связи с этим большой интерес вызывает изучение механизмов взаимодействия цитохрома с с липидными мембранами. Взаимодействие цитохрома с с кардиолипином – липидом, входящим в состав внутренней мемебраны митохондрии, – значительно усиливает его пероксидазную активность [2, 3]. Предполагается, что посредством запуска перекисного окисления мембранных липидов именно пероксидазная активность способствует транслокации цитохрома с через внешнюю мембрану митохондрий [4]. Следует отметить также, что кардиолипин, сам по себе [5] или в комплексе с цитохром с-оксидазой [6], формирует мембранный сайт связывания цитохрома с на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий и в условиях гомеостаза.

Известно, что связывание цитохрома с с кардиолипином на первых стадиях обратимо, зависит от pH [5] и приводит к изменению третичной и вторичной структуры молекулы цитохрома с [7]. Фактором, влияющим на стабильность комплекса цитохром с/кардиолипин, является окисление кардиолипина, так как цитохром с имеет пониженное сродство к окисленному липиду [8]. Вместе с тем, механизмы взаимодействия цитохрома с с кардиолипином в митохондриальной мембране остаются не до конца изученными и привлекают пристальное внимание исследователей [9–14].

При помощи флуоресцентно-меченого варианта лошадиного цитохрома с методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) исследовано взаимодействие экзогенного цитохрома с с природными (митохондрии и митопласты) и искусственными (кардиолипин-содержащими липосомами) липидными мембранами, а также влияние на этот процесс ионной силы и содержания кардиолипина в липидной мембране.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение флуоресцентно-меченого цитохрома с. В качестве стратегии мечения цитохрома с нами была выбрана конъюгация молекул белка и малеимидного производного сульфоцианина 3 через остаток Cys, введенный в цитохром с с помощью сайт-направленного мутагенеза. Реакция тиолов с малеимидами широко используется для биоконъюгации и мечения биомолекул, в том числе белков и пептидов [15]; данную реакцию можно проводить в водной среде, что существенно облегчает процедуру.

Введение в молекулу цитохрома с тиоловой группы может быть осуществлено путем единичной замены в ходе мутагенеза поверхностного или концевого аминокислотного остатка на остаток Cys. Очевидно, что остаток, заменяемый на остаток Cys, не должен быть вовлечен во взаимодействия с кардиолипином и белками-партнерами цитохрома с, а также быть значимым для структурно-функциональной целостности белка.

Известно, что на поверхности цитохрома с имеется три участка связывания с кардиолипином: сайт связывания A, состоящий из остатков K72, K73, K86, K87 и R91 [16]; сайт связывания L, состоящий из остатков K22, K25, K27, а также H33, который принимает участие в связывании цитохрома с с кардиолипином при рН < 7.0; сайт связывания С, содержащий остатки N52, H26 и P44 [17]. Кроме того, известны участки связывания цитохрома с c цитохром с-оксидазой (а.к.о. К8, К13, К72, K86, и К87) [18], с убихинол-цитохром с-оксидоредуктазой (а.к.о. K7, K8, K13, K39, K72, K79, K86, K87) [19] и цитохром с-пероксидазой (а.к.о. K13, K27, K72, K86, K87, Q12 и Q16) [20, 21].

Для введения флуоресцентной метки в молекулу цитохрома с нами был сконструирован и получен мутантный вариант цитохрома с с заменой остатка G56 на остаток Cys, так как функциональная группа остатка G56 расположена на поверхности белковой глобулы и не входит ни в один из известных сайтов связывания белка.

Реакцию мечения, а также очистку и анализ продуктов реакции проводили согласно методике, описанной в экспериментальной части. Фракции, в которых соотношение пиков цитохрома с и сульфоцианина было сопоставимым (рис. 1), объединяли и обессоливали на этой же колонке, уравновешенной бессолевым буфером, после чего анализировали спектрофотометрически.

Рис. 1.

Спектр флуоресцентно-меченого цитохрома с с заменой G56C. Поглощение при 412 нм соответствует максимуму поглощения цитохрома с, при 549 нм – максимуму поглощения сульфоцианина.

Исследование взаимодействия флуоресцентно-меченого цитохрома с с липидными мембранами осуществляли при помощи ФКС. Этот метод основан на регистрации флуктуаций флуоресценции отдельных частиц, возникающих в результате броуновского движения через освещенный лазером малый объем пространства (конфокальный объем). Традиционно ФКС используется для исследования процессов, связанных с изменением подвижности молекул и комплексов: агрегации частиц, взаимодействия флуоресцирующих молекул с надмолекулярными комплексами, липидными везикулами, при этом диапазон размеров изучаемых объектов очень широк – от молекул красителей до частиц с размерами, составляющими сотни нанометров [22].

В ходе работы аналитическим сигналом для идентификации связывания являлось изменение количества пиков, регистрируемых в конфокальном объеме. Пики сигнала флуоресценции связаны с перемещением флуоресцирующих частиц через измеряемый объем при перемешивании суспензии частиц. Это могут быть как свободные молекулы меченого белка, так и намного ярче светящиеся частицы мембран со связавшимися с ними несколькими молекулами белка. На рис. 2 представлены типичные записи сигнала для суспензии митопластов и раствора меченого цитохрома с (фЦит). Связывание фЦит с митопластами характеризовалось большим количеством пиков с высокой интенсивностью флуоресценции (1), тогда как в растворе несвязанного флуоресцентно-меченого цитохрома с (3) регистрировались фоновые пики небольшой интенсивности. В суспензии митопластов в отсутствие меченого белка практически отсутствовали характерные для комплексов пики (4), так же, как и в случае дестабилизированного повышением ионной силы комплекса фЦит/митопласты (2).

Рис. 2.

Временные зависимости интенсивности пиков флуоресценции суспензии митопластов (4), раствора меченого цитохрома с (3), суспензии митопластов в присутствии меченого цитохрома с (1), суспензии митопластов в присутствии меченого цитохрома с и 50 мМ KCl (2). Измерения проводили в сахарозном буфере (180 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7.4). Конечная концентрация митопластов составила 0.1 мг/мл, концентрация меченого цитохрома с 0.26 мкМ, время сбора данных составляло 30 с.

На рис. 3 представлено типичное распределение пиков флуоресценциии по их интенсивности после обработки экспериментальных данных в программе Saligat. Для идентификации связывания нами был выбран феноменологический порог интенсивности в 1.4 МГц. Использование большей величины порога слишком сильно обедняло статистику по пикам, в то время как меньшая величина порога была слишком близка к шуму усилителя, что вносило искажения в регистрируемую статистику.

Рис. 3.

Распределение регистрируемых пиков флуоресценции по интенсивности в суспензии митопластов и растворе меченого цитохрома с, а также при взаимодействии меченого цитохрома с с митопластами, в том числе в условиях повышенной ионной силы 50 мM KCl. Условия измерений даны в подписи к рис. 2.

Роль кардиолипина в связывании цитохрома с с липосомами. На рис. 4 представлена зависимость эффективности связывания меченого цитохрома с с липосомами, содержащими различное количество кардиолипина (от 0 до 100%). Анализируя полученные результаты, можно сделать заключение, что эффективность связывания фЦит с липидной мембраной возрастает при увеличении содержания в ней кардиолипина и это, по-видимому, связано с тем, что количество сайтов связывания цитохрома с на поверхности липосом напрямую зависит от процентного содержания в них кардиолипина и достигает максимального значения при взаимодействии с липосомами, состоящими на 100% из кардиолипина.

Рис. 4.

Влияние содержания (%) кардиолипина в составе липосом на сродство цитохрома с к липосомам, выраженное в количестве пиков с интенсивностью 1.4 МГц. Данные приведены для липосом состава “яичный фосфатидилхолин–кардиолипин” в различных соотношениях. Измерения проводили в сахарозном буфере (180 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7.4). Конечная концентрация липосом различного состава ‒ 0.5 мг/мл, концентрация меченого цитохрома с ‒ 0.26 мкМ.

Определение кажущихся констант вытеснения цитохрома с с различными мембранами. Для определения кажущихся констант вытеснения цитохрома с из комплекса с липидными мембранами был использован метод вытеснения фЦит из комплекса с мембранами при помощи немеченого цитохрома с с подсчетом количества пиков флуоресценции с интенсивностью 1.4 МГц (рис. 5). Метод вытеснения основывается на понижении концентрации флуоресцентно-меченого компонента комплекса путем замещения немеченым белком при повышении концентрации последнего в растворе. При этом наблюдаемое уменьшение количества пиков было вызвано вытеснением флуоресцентно-меченого цитохрома с из комплекса с исследуемой липидной мембраной по мере увеличения в среде концентрации немеченого цитохрома с от 10 нМ до 100 мкМ. Количество пиков подсчитывали при помощи программы Saligat, кривые вытеснения анализировали при помощи программы GraphPrism 8 на основании уравнения y = (B_maxX^H)/($K_{{\text{b}}}^{H}$ + X ^H), и определяли основные характеристики связывания (см. Экспериментальную часть): максимальное количество пиков флуоресценции (B_max), константу вытеснения (K_b) и коэффициент кооперативности связывания (коэффициент Хилла, H). Максимальное количество пиков флуоресценции B_max отражает концентрацию флуоресцирующих частиц в системе, а также зависит от количества сайтов связывания фЦит на одной частице. В этом уравнении X обозначает концентрацию цитохрома с. Константа вытеснения отражает усредненное значение константы диссоциации всех сайтов связывания, с которыми мог связаться меченый цитохром с. Таким образом, различия констант вытеснения обусловлены различием сродства липидных мембран к цитохрому с. Коэффициент Хилла отражает влияние повышения (положительная кооперативность) или понижения (отрицательная кооперативность) сродства сайтов связывания на липидных мембранах при протекании процесса связывания с ними белка. Следует сказать, что данное уравнение применимо для анализа при выполнении двух условий: (1) концентрация фЦит должна быть много больше, чем концентрация центров связывания; (2) при выбранных концентрациях фЦит и мембран должно быть обеспечено насыщение связывания. При проведении наших опытов данные условия соблюдались лишь частично, поэтому вместо истинных констант связывания в опытах оценивались кажущиеся константы связывания. Кажущаяся константа вытеснения в случае комплекса фЦит с митопластами существенно превышает таковые для комплексов с митохондриями и составляет 25 мкМ (табл. 1). При этом максимальное количество регистрируемых пиков флуоресценции в случае комплекса с митопластами больше, чем для комплексов с митохондриями. Поскольку концентрация частиц митохондрий и митопластов в наших опытах была одинакова, то эти данные свидетельствуют о том, что на мембранах митопластов имеется существенно большее количество сайтов связывания фЦит. Однако различия в величинах K_b говорит о том, что сродство к белку для сайтов связывания на митопластах примерно в десять раз ниже, чем сродство аналогичных сайтов для митохондрий.

Рис. 5.

Вытеснение меченого цитохрома с из комплекса с митопластами, митохондриями и липосомами (20% кардиолипина) немеченым цитохромом с. Конечная концентрация митопластов ‒ 0.1 мг/мл, митохондрий ‒ 0.1 мг/мл, липосом ‒ 0.5 мг/мл, меченого цитохрома с ‒ 0.26 мкМ. Измерения проводили в сахарозном буфере (180 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7.4).

Также было изучено влияние ионной силы на кажущуюся константу вытеснения (K_b) и кооперативность связывания (H, табл. 1). Анализ полученных данных позволяет заключить, что в присутствии KCl кажущаяся константа вытеснения увеличивалась, что говорит о снижении сродства цитохрома с к липидным мембранам. Количество пиков с интенсивностью >1.4 MHz уменьшалось с ростом ионной силы раствора. В случае митохондрий и липосом при добавлении 50 мМ KCl наблюдалось многократное увеличение кажущейся константы вытеснения K_b с 2 до 29 мкМ (митохондрии) и с 17 до 88 мкМ (липосомы, табл. 1). Влияние KCl на K_b было значительно слабее в случае митопластов. Снижение связывания фЦит с кардиолипином в составе липосом при повышении ионной силы соответствует имеющимся литературным данным [22].

Определение кажущихся констант вытеснения мутантных форм цитохрома с с различными мембранами. Проведен эксперимент по вытеснению флуоресцентно-меченого цитохрома с из комплексов с липидными мембранами при помощи немеченых мутантных вариантов цитохрома с с единичной заменой K8T и множественными заменами K72E/E69K/K86E/K87E (4Mut), полученными в рамках наших предыдущих работ [23, 24]. Эксперимент проводили аналогично предыдущим экспериментам с титрованием комплекса фЦит/ липидная мембрана немеченым белком в концентрациях от 10 нМ до 100 мкМ, при этом наблюдали характерное падение количества пиков (рис. 6).

Рис. 6.

Вытеснение флуоресцентно-меченого цитохрома с под действием немеченых мутантных вариантов K8T и 4Мut из комплексов с: (а) липосомами (20% кардиолипин, 80% яичный лецитин), (б) митопластами, (в) митохондриями. Графики нормированы на максимальное связывание. Измерения проводили в сахарозном буфере (180 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7.4). Концентрация митопластов ‒ 0.1 мг/мл, митохондрий ‒ 0.1 мг/мл, липосом ‒ 0.5 мг/мл, меченого цитохрома с ‒ 0.26 мкМ.

О различиях в эффективности вытеснения меченого цитохрома с из комплекса фЦит/липосома (20% кардиолипин, 80% яичный лецитин) под действием немеченых мутантных вариантов цитохрома с свидетельствуют отличающиеся кажущиеся константы вытеснения, при том, что коэффициент Хилла примерно одинаков для всех вариантов цитохрома с. Основываясь на данных, представленных в табл. 2, можно сделать вывод, что мутантный цитохром с с заменой K8T, обладая повышенным сродством к кардиолипину, наиболее эффективно вытеснял флуоресцентно-меченый цитохром с из комплексов с кардиолипин-содержащими липосомами. В случае митопластов наблюдалась аналогичная картина. В то же время, этот белок заметно слабее связывался с митохондриями по сравнению с диким типом. Мутантный вариант K72E/E69K/K86E/K87E (4Мut) благодаря введению отрицательно-заряженных а.к.о. на позиции трех остатков Lys связывался хуже цитохрома с дикого типа (WT) в случае всех изучаемых типов мембран.

Согласно полученным данным, большей эффективностью связывания с митохондриями обладает цитохром с WT, тогда как эффективность связывания для 4Mut и K8T совпадала и была заметно ниже по сравнению с WT. Данный факт может свидетельствовать о том, что связывание цитохрома с с митохондриями не зависит от эффективности связывания цитохрома с с кардиолипином и осуществляется за счет других взаимодействий, нежели с митопластами и липосомами.

При помощи метода ФКС нами изучено взаимодействие флуоресцентно-меченого цитохрома с лошади с тремя видами липидных мембран: кардиолипин-содержащими липосомами, митопластами и митохондриями, полученными из препаратов печени крысы. Показано, что взаимодействие цитохрома с с митопластами характеризуется наибольшим количеством сайтов связывания, которые обладают, однако, меньшим сродством в сравнении с митохондриями. Поверхность мембраны митопластов состоит по большей части из внутренней митохондриальной мембраны, в липидный состав которой входит кардиолипин. Кроме того, внутренняя мембрана митохондрий содержит интегрированные в нее белковые комплексы – убихинол-цитохром с-оксидоредуктазу (комплекс III) и цитохром с-оксидазу (комплекс IV), являющиеся белками-партнерами цитохрома с по ЭТЦ, с которыми цитохром с образует временные функциональные комплексы в процессе переноса электрона. Таким образом, на митопластах имеются сайты связывания цитохрома с как минимум двух принципиально разных типов: 1) кардиолипин, с которым реализуется белок-липидное связывание; 2) III и IV комплексы ЭТЦ, с которыми реализуется белок-белковое связывание. По-видимому, именно этим объясняется наблюдаемое нами повышенное количество сайтов связывания на митопластах по сравнению с митохондриями. Оба рассматриваемых типа связывания цитохрома с реализуются с участием электростатических взаимодействий; с этим согласуются наши экспериментальные наблюдения уменьшения сродства цитохрома с при повышении ионной силы в среде измерения в случае комплексов с липосомами или митопластами.

Монотонное увеличение сродства фЦит к липосомам при увеличении в них процентного содержания кардиолипина свидетельствует об определяющей роли взаимодействия фЦит с кардиолипином в процессе связывания белка с кардиолипин-содержащей липосомальной мембраной.

Характер связывания фЦит с внешней митохондриальной мембраной (митохондрии) отличался от связывания с митопластами и кардиолипин-содержащими липосомами. Тем не менее, несмотря на отсутствие в составе внешней мембраны митохондрий кардиолипина и белков-партнеров ЭТЦ, связывающих цитохром с, в наших экспериментах наблюдалось устойчивое связывание. Таким образом, полученные нами экспериментальные данные могут свидетельствовать о наличии на внешней митохондриальной мембране специфических сайтов связывания цитохрома с.

Результаты эксперимента по вытеснению флуоресцентно-меченого цитохрома с из комплекса с липидными мембранами мутантными вариантами белка не противоречат предположению о том, что на внешней мембране митохондрий имеются специфические сайты связывания цитохрома с. Оба мутантных варианта одинаково эффективно (но заметно хуже по сравнению с диким типом цитохрома с) вытесняли флуоресцентно-меченый цитохром с из комплекса с митохондриями. В то же время, в случае комплексов как с липосомами, так и с митопластами вариант с заменой K8T, имеющий более высокое сродство к кардиолипину, вытеснял меченый цитохром с эффективнее варианта K72E/E69K/K86E/K87E и белка дикого типа.

Полученные нами данные представляют интерес с точки зрения понимания фундаментальных механизмов взаимодействия цитохрома с с липидными мембранами, а также влияния на эти механизмы различных внешних факторов. Понимание механизмов, в свою очередь, имеет практическую значимость, поскольку открывает широкие возможности для рационального дизайна биомедицинских препаратов, обладающих про- или антиапоптотическими свойствами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали компоненты для культуральных сред и буферных растворов для хроматографии и электрофореза фирмы AppliChem (Германия); ампициллин, эндонуклеазу рестрикции DpnI фирмы Fermentas (Литва), Pfu ДНК-полимеразу, кардиолипин бычьего сердца (Sigma, США), фосфатидилхолин яичного желтка (Avanti Polar Lipids, США), флуоресцентные красители сульфо-цианин и BDP TMR в малеимидной форме (Lumiprobe GmbH, Германия). Дистиллированную воду дополнительно очищали с помощью системы Milli-Q (Millipore, США).

Конструирование мутантных генов цитохрома с. Введение мутации в ген лошадиного цитохрома с в составе экспрессионного плазмидного вектора pBP(CYC1) осуществляли с помощью сайт-направленного мутагенеза по методу QuikChange^TM Mutagenesis Kit (Stratagene, США) [23]. После завершения реакции к смеси добавляли 10 ед. акт. рестриктазы DpnI и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Далее аликвоты полученной смеси использовали для трансформации компетентных клеток E. coli XL-1 Blue по стандартной методике. Наработку мутантной ДНК в ходе мутагенеза анализировали при помощи электрофореза в 1% агарозном геле. Определение нуклеотидной последовательности мутантных генов в составе плазмидной ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Отобранные мутантные гены переклонировали в экспрессионный вектор pBP(CYC1) [25], модифицированный для экспрессии генов лошадиного цитохрома c [24].

Экспрессию мутантных генов цитохрома с осуществляли в штамме E. coli JM109 в жидкой питательной среде SB с ампициллином (конечная концентрация 100 мкг/мл) без добавления индуктора при 37°С и интенсивном перемешивании в течение 22–24 ч [26]. По окончании роста клетки E. coli осаждали центрифугированием при 4000 g и 4°С в течение 20 мин. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в буфере 25 мМ Na–P_i, pH 6,0, 1 мМ NaN₃. Гомогенизацию клеток осуществляли продавливанием под высоким давлением на установке “French Press” (Spectronic Instruments, Inc., США) с последующим центрифугированием при 95 000 g в течение 20 мин [27].

Выделение и очистку целевых белков проводили с использованием жидкостной хроматографической системы “АКТА FPLC” (GE-HEALTHCARE, США), согласно схеме, разработанной ранее [25, 27]. Клеточный экстракт наносили на катионообменную колонку MP HS 10/10 (BIO-RAD, США), уравновешенную буфером, содержащем 25 мМ Na–P_i, pH 6.0, 1 мМ NaN₃. Цитохром с элюировали линейным градиентом 1 М NaCl в том же буфере со скоростью 3 мл/мин. Фракции, полученные после очистки на MP HS, анализировали спектрофотометрически и при помощи электрофореза в 12% SDS-ПААГ, затем диализовали против буфера для адсорбционной хроматографии (10 мМ Na–P_i, pH 7.0, 1 мМ NaN₃) и наносили на колонку с гидроксиапатитом CHT-I (BIO-RAD, США). Цитохром с элюировали линейным градиентом 500 мМ Na–P_i, рН 7.0 со скоростью 2 мл/мин. Степень очистки и концентрацию цитохрома с в полученных фракциях определяли спектрофотометрически и при помощи электрофореза в 12% SDS-ПААГ. Степень очистки цитохрома с в полученных фракциях определяли по отношению оптической плотности в максимуме поглощения в области Соре к оптической плотности при 280 нм. Фракции с отношением, равным 4.5–5.0 (что соответствует чистоте коммерческого препарата ≥95%, Sigma, США), объединяли, дважды диализовали против 10 мМ аммоний-карбонатного буфера, рН 7.9, и лиофилизовали на установке ALPHA I-5.

Получение флуоресцентно-меченого цитохрома с. Лиофилизованный препарат мутантного варианта цитохрома с с заменой G56C, растворяли в реакционном буфере (10 мМ NaH₂PO₄, 200 мМ NaCl, pH 7.0) до концентрации 1–2 мг/мл. Флуоресцентный краситель – водорастворимый сульфоцианин (Sulfo-Cyanine3) в виде малеимида – растворяли в ДМСО до концентрации (0.01 мг/мл). Раствор красителя добавляли к раствору белка в соотношении 1 : 5, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 12–14 ч. Продукт реакции очищали на гель-фильтрационной колонке (Sephadex G-25), уравновешенной реакционным буфером. По окончании гель-фильтрации фракции, содержащие флуоресцентно-меченый белок, обессоливали на этой же колонке, уравновешенной бессолевым буфером (10 мМ NaH₂PO₄, pH 7.0). Количественные и качественные характеристики модифицированного цитохрома с определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Cary50-Bio (Varian, США) в максимумах поглощения для цитохрома с (412 нм), Sulfo-Cyanine3 (549 нм).

Выделение препаратов митохондрий и митопластов из печени крыс. Митохондрии печени крыс выделяли при помощи дифференциального центрифугирования [28] в буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, 10 мМ MOPS, 1 мМ ЭГТА и 0.1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7.4. После центрифугирования препарат митохондрий промывали в том же буфере. Митопласты получали в процессе инкубирования митохондрий печени крысы в течение 10 мин в буфере (MOPS 10 мM, ЭДТА 1 мM, Tris 10 мM, pH 7.4), содержащем 25 мM KCl. После инкубирования суспензию центрифугировали при 4200 g в течение 5 мин, удаляли супернатант, а осадок суспендировали в сахарозном буфере (180 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7.4), содержащим 1 мM ЭДТА. Выравнивание концентраций частиц митопластов и митохондрий в наших опытах достигалась тем, что при приготовлении митопластов одновременно в другую пробирку отбиралось такое же количество белка митохондрий, которое суспендировалось в том же объеме буфера, который добавлялся при последнем осаждении митопластов.

Получение кардиолипин-содержащих мультиламеллярных липосом. Для приготовления липосом 5 мг липида (яичный лецитин, кардиолипин или их смесь) растворяли в 250 мкл хлороформа. После выпаривания хлороформа в атмосфере азота добавляли 0.5 мл буфера (Tris 10 мМ, MES 10 мМ, KCl 100 мМ, pH 7.4). Полученную смесь встряхивали, после чего подвергали пяти циклам замораживания-оттаивания. По приведенной схеме были получены мультиламеллярные липосомы с содержанием кардиолипина от 1 до 5 мг.

Флуоресцентная корреляционная спектроскопия. В настоящей работе был использован прибор, сконструированный на основе инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IMT-2 (Artisan Technology Group, США) [28]. Для возбуждения красителя использовался Nd:YAG твердотельный лазер 532 нм, сопряженный с вышеупомянутым микроскопом с водноиммерсионным объективом 40×, 1.2 NA (“Carl Zeiss”, Германия). Флуоресцентный сигнал проходил через соответствующий дихроический разделитель и проецировался на сердцевину световода (50 мкм), связанного с лавинным фотодиодом (SPCM-AQR-13-FC, “PerkinElmer Optoelectronics”, Канада). Сигнал преобразовывался с помощью интерфейсной карты Flex02-01D/C (“Correlator.com”, США). Для корректной работы прибора в начале эксперимента осуществлялась настройка положения световода относительно оптической оси. Все измерения проводили при перемешивании раствора лопастевидным 3-мм пластиковым стержнем, вращающимся со скоростью 600 об./мин. Для измерения к 60 мкл сахарозного буфера (180 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris, 10 мМ MES, pH 7.4) добавляли БСА до конечной концентрации 0.1 мг/мл и 1–3 мкл суспензии митохондрий, митопластов или липосом. Конечная концентрация митохондриального белка в экспериментах составляла 0.2 мг/мл, а концентрация липида в случае липосом – 0.5 мг/мл. Измеряли флуктуации флуоресценции окрашенных частиц до и после добавления флуоресцентно-меченого цитохрома с до конечной концентрации 0.26 мкМ. Время сбора данных составляло 30 с. Флуоресценцию регистрировали из конфокального объема, расположенного примерно на 50 мкм выше поверхности покровного стекла. Перед измерениями смесь меченого белка с митохондриями (а также митопластами или липосомами) инкубировали в течение 5 мин.

В эксперименте по вытеснению флуоресцентно-меченого цитохрома с немеченым цитохромом с повторяли все вышеописанные действия, дополнительно измеряя флуктуации флуоресценции каждый раз после добавления немеченого белка (концентрации варьировались от 10 нМ до 100 мкМ).

Для количественной оценки связывания белка с липосомами и митохондриями подсчитывали количество пиков сигнала флуоресценции (n(F > F₀)) с интенсивностью выше некоего порога (F₀) [22] при помощи программы WinEDR Strathclyde Electrophysiology Software, разработанной Д. Демпстером из Университета Страфклида (J. Dempster, University of Strathclyde, Glasgow, UK) или аналогичной программой Saligat, разработанной В. Козловским (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ). В настоящей работе для оценки связывания цитохрома с использовался порог F₀ равный 1.4 MГц. В типичном опыте такая величина порога позволяла регистрировать около 2000 пиков, что обеспечивало достаточную статистику и хорошую воспроизводимость измерений.

Константу вытеснения и значения коэффициента Хилла рассчитывали, решая параметрическое уравнение вида: y = (B_maxX^H)/($K_{{\text{b}}}^{H}$ + X^H), где B_max – максимальное количество пиков, нормированное для всех измерений, X – концентрация немеченого цитохрома с, K_b – константа вытеснения, H – коэффициент Хилла. Для фиттирования данных этим уравнением использовали программу GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., США). Все данные были получены в результате четырех независимых экспериментов и статистически обработаны в программе GraphPad Prism 8 (Annova test), уровень значимости P был не менее 0.05.