Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 6, стр. 701-707

ВВЕДЕНИЕ

По данным ВОЗ, в структуре смертности населения планеты смерть от онкологических заболеваний занимает вторую строчку, являясь причиной каждой шестой смерти на земле. Именно поэтому, несмотря на большое количество подходов к терапии онкологических заболеваний, поиск новых форм цитотоксических агентов, обладающих минимальными побочными эффектами при максимальной цитотоксичности, равно как и поиск способов снижения вводимых доз цитотоксического агента, продолжает оставаться актуальной задачей.

В этом свете терапия, основанная на белковых препаратах (антителах, белковых токсинах, ферментах, цитокинах), приобретает ведущую роль в современных медико-биологических исследованиях [1]. Неразрывно с этим встает вопрос доставки белкового препарата к клетке-мишени, поскольку, находясь в кровотоке, препарат может проявлять низкую стабильность, подвергаться быстрому протеолизу в плазме, обладать ограниченной способностью проникать через клеточную мембрану и т.д. Благодаря бурному развитию нанотехнологических подходов, для доставки белков к мишеням организма в руках ученых появились такие наноносители, как липосомы, полимерные наногели, наночастицы различного состава [2–6]. Несомненным лидером среди наноносителей по доставке лекарств являются липосомы. Способность липосом инкапсулировать белки, их высокая биосовместимость, низкая токсичность, регулируемый размер, определяют их уникальные свойства в качестве носителя для доставки биологически активных соединений. Кроме того, ковалентное присоединение лигандов (антител, белков, углеводов) к липосомной мембране обеспечивает специфическую доставку липидных везикул к клеткам-мишеням.

В качестве адресов, специфичных к определенным поверхностным рецепторам раковых клеток, сегодня все большее внимание уделяется инновационным рецептор-спецфичным скаффолдным белкам неиммуноглобулиновой природы – аффибоди, авимеры, аднектины, антикалины, аптамеры и DARPins-белки [7]. DARPins-белки (Design Ankyrin Repeat Proteins) являются альтернативой антителам, не уступают им в аффинности, не содержат остатков цистеина в своей структуре, отличаются высоким уровнем экспрессии в бактериальной системе, являются мономерами в растворе, не склонны к агрегации и характеризуются высокой устойчивостью к протеазам [8].

В качестве токсического компонента в противораковой терапии одними из наиболее перспективных средств на сегодняшний день являются белки различного происхождения, нарушающие метаболические процессы непосредственно внутри клетки-мишени, такие как рибонуклеазы, рицин, лектин и т.д. [9, 10]. Так, например, на основе рибонуклеазы барназы из Bacillus amyloliquefaciens получено большое количество адресных иммунотоксинов, эффективных in vitro и in vivo [11, 12].

В данной работе были получены липосомы, нагруженные рибонуклеазой барназой, обладающие специфичностью по отношению к поверхностному клеточному рецептору HER2 за счет наличия анти-HER2-адресного модуля DARPin на внешней мембране липосом. На сегодняшний день это первая работа по доставке барназы к раковым клеткам в составе липосомального препарата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее мы разработали методику синтеза моноламилярных липосомальных HER2-специфичных препаратов диаметром 100 нм, нагруженных цитотоксическим компонентом – фрагментом А псевдомонадного экзотоксина [3]. Данная методика позволяет включать в липосому большое количество молекул белка (порядка 2000) за счет электростатического взаимодействия между белком и внутренней поверхностью липосомы, а функционализация внешней поверхности липосомы HER2-специфичным модулем DARPin обеспечивает избирательную цитотоксичность препарата.

Поверхностный клеточный рецептор HER2 сверхэкспрессируется в 20–30% опухолей молочной железы и яичников [13–15]. Как правило, сверхэкспрессия этого рецептора коррелирует с агрессивным фенотипом опухоли и активным метастазированием [16, 17].

Сверхэкспрессия HER2 при злокачественной трансформации клетки делает его привлекательной мишенью для адресной терапии рака [18], поскольку в норме HER2 экспрессируется на поверхности эпителиальных клеток в небольших количествах.

В данной работе было показано, что принцип загрузки липосом белком, основанный на электростатическом взаимодействии, эффективен, в частности, для рибонуклеазы барназы.

Гены белков DARPin и барназы экспрессировали в штамме E. coli BL21(DE3) по методу автоиндукции. Автоиндукционная среда, благодаря наличию эквимолярных концентраций гидрофосфата натрия и дигидрофосфата калия, препятствует закислению культуральной среды в результате метаболизма бактерий и обеспечивает поддержание нейтрального рН даже при достижении культурой высоких плотностей (OD₆₀₀ ~ 10). Сбалансированные концентрации глюкозы, лактозы и глицерина, а также высокая интенсивность перемешивания культуры (~250 об./мин) позволяют индуцировать экспрессию гена целевого белка автоматически (при истощении в среде глюкозы), не прибегая к контролю плотности культуры.

Белки очищали с использованием металл-хелатной аффинной хроматографии, как описано в “Экспериментальной части”. Электрофоретический анализ очищенных белков показал, что их молекулярная масса соответствует расчетной (18 кДа для DARPin и 12 кДа барназы), а чистота белка удовлетворяет требованиям работы с культурами клеток эукариот (рис. 1а).

Рис. 1.

Характеристика белков DARPin и барназы. (а) результат электрофоретического разделения белков в 13.5% ПААГ после металл-хелатной аффинной хроматографии. Дорожки: 1 – маркер молекулярных масс Page Ruler Prestained Protein (“Thermo Fisher”, США), 2 – DARPin, 3 – барназа. (б) РНКазная активность барназы, определенная методом кислотно-нерастворимого осадка. Большим значениям оптической плотности (OD₂₆₀) соответствует большая ферментативная активность белка.

Поскольку методика очистки барназы включает этап денатурации и рефолдинга (для разрушения комплекса барназа-барстар), о сохранении функциональной активности барназы судили по ее способности гидролизовать РНК. РНКазную активность барназы определяли методом кислотно-нерастворимого осадка РНК [19]. Согласно [19], 1 единица рибонуклеазной активности в исследуемой пробе вызывает приращение OD₂₆₀ на 1 единицу. Таким образом, энзиматическая активность очищенного препарата барназы, определенная данным методом, составляет 93.5 × 10⁶ ед. акт./М.

Как отмечалось выше, принцип загрузки липосом белками основан на электростатическом взаимодействии положительно заряженного белка (для барназы pI 9.4, рабочий буфер для загрузки – рН 7.5) с отрицательно заряженной поверхностью мембраны липосомы. Метод инкапусляции белка в липосому включал: электростатическое связывание белка с фосфолипидами, процедуру 5-кратного замораживания-оттаивания, экструзию суспензии через 100-нм поликарбонатный фильтр, хроматографическую очистку протеолипосом от невключенного белка при умеренно щелочном рН и высокой ионной силе (рН 7.5, 200 мМ NaCl). В этих условиях молекулы белка диссоциируют от внешней поверхности липосом.

Функционализацию протеолипосом адресным модулем DARPin осуществляли в три стадии как описано в “Экспериментальной части”: 1. Введение с помощью реагента Траута (2-иминотиолан) SH-групп в липиды, содержащие первичные амины (фосфатидиламин); 2. Модификация аминогрупп DARPin кросс-сшивающим реагентом сульфо-EMCS (N-ε-малеимидокапроил-оксисульфосукцинимидный эфир); 3. Ковалентное присоединение Траут-модифицированных липосом к сульфо-EMCS-модифицированному белку.

Размер и поверхностный заряд адресных (DARPin-Lip-Bn) и безадресных (Lip-Bn) липосом, нагруженных барназой, определяли методом динамического и электрофоретического светорассеяния (рис. 2а–2в). Гидродинамический размер составил 108 ± 36 нм для Lip-Bn и 117 ± 41 нм для DARPin-Lip-Bn (рис. 2а, 2б), ζ-потенциал: ‒35.9 ± 0.3 мВ для Lip-Bn и –49.5 ± 2 мВ для DARPin-Lip-Bn (рис. 2в). Эти данные однозначно доказывают высокую эффективность химической конъюгации адресного модуля DARPin с поверхностью липосом (незначительное увеличение размера и уменьшение ζ-потенциала), а также свидетельствуют о сохранении коллоидной стабильности полученных конъюгатов в солевых растворах.

Рис. 2.

Функциональная характеристика липосомных комплексов. (а) распределение по размерам адресных и безадресных липосом, нагруженных барназой, полученное методом динамического светорассеяния. (б) распределение по ζ-потенциалам адресных и безадресных липосом, нагруженных барназой, полученное методом электрофоретического светорассеяния. (в) гидродинамический размер и ζ-потенциал адресных и безадресных липосом, нагруженных барназой. (г, д) относительная жизнеспособность клеток с различным уровнем экспрессии рецептора HER2 после их обработки липосомальными препаратами в течение 72 ч.

Способность моноламилярных липосом, загруженных барназой и функционализированных адресным модулем DARPin, селективно взаимодействовать с рецептором HER2 на поверхности HER2-положительных клеток и вызывать их гибель была изучена стандартным методом МТТ in vitro на двух клеточных линиях аденокарциномы молочной железы человека, характеризующихся различным уровнем экспрессии рецептора HER2: SK-BR-3 − высокий уровень экспрессии, MDA-MB-231 − низкий уровень экспрессии.

Показано, что адресные липосомы, нагруженные барназой, эффективно подавляют жизнеспособность HER2-положительных клеток SK-BR-3 (IC₅₀ = 47.5 нМ) (рис. 2г). Жизнеспособность клеток MDA-MB-231, характеризующихся нормальным уровнем экспрессии рецептора HER2, в проанализированном диапазоне концентраций отличается слабой чувствительностью к препарату (14.5% смертности при максимально использованной концентрации адресных липосом, нагруженных барназой). Отметим, что безадресные липосомы, нагруженные барназой, цитотоксичностью не обладают (рис. 2д). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что специфическая в отношении HER2-положительных клеток цитотоксичность определяется именно наличием адресного HER2-специфичного модуля на поверхности липосом, а выраженность цитотоксического эффекта коррелирует с уровнем экспрессии рецептора HER2 на клеточной мембране.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Экспрессия, выделение и очистка белков. Экспрессию целевых белков DARPin и барназы проводили в штамме BL21(DE3) E. coli по методу автоиндукции [20]. Свежие трансформанты (из расчета одна колония на 1 мл среды) инокулировали в 50 мл среды, содержащей 1% дрожжевого экстракта, 1% триптона, 25 мM Na₂HPO₄, 25 мM KH₂PO₄, 100 мM NaCl, 2 мM MgCl₂ и 0.1 г/л ампициллина. Растили 24 ч при 25°C в условиях интенсивной аэрации. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 6000 g и 4°С. Для того, чтобы иметь возможность очистить белки с помощью металл-аффинной хелатной хроматографии, в последовательностях белков была предусмотрена гексагистидиновая метка.

Выделение барназы проводили следующим образом. Осадок клеток ресуспендировали в буфере Т2 (200 мM NaCl, 30 мM NaH₂PO₄, 2 мM Tris-HCl, pH 8.3), клетки разрушали на ледяной бане с помощью ультразвукового дезинтегратора. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 15 000 g в течение 30 мин. Супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и наносили на колонку Ni²⁺-NTA Sepharose (GE Healthcare Life Sciences) согласно протоколу производителя. Белки, не связавшиеся с сорбентом, удаляли при промывании колонки буфером Т2. Ингибитор барназы барстар, сопутствующий всем рекомбинантным белкам, содержащим барназный модуль, удаляли раствором 6 М гуанидинхлорида в буфере Т2. Ренатурацию проводили в нисходящем градиенте гуанидинхлорида. После полного замещения буфера с гуанидинхлорида на буфер Т2, белки элюировали буфером Т2 с 150 мМ имидазолом.

Для выделения DARPin клеточный осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 0.3 M NaCl, 20 мM Na-фосфат, 30 мM имидазол, 0.5 мг/мл лизоцим (pH 8.0). Клетки разрушали ультразвуком на ледяной бане. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 15 000 g, 25 мин, 4°C. Супернатант пропускали через 0.22-мкм фильтр и наносили на колонку Ni²⁺-NTA HisTrap column (GE Healthcare, USA), уравновешенную связывающим буфером (0.3 M NaCl, 30 мM имидазол, 20 мM Na-фосфат, pH 8.0). Колонку промывали 20 объемами связывающего буфера, после чего проводили элюцию целевого белка градиентом имидазола от 0.1 до 0.5 M.

Аутентичность полученных белков доказывали с помощью электрофореза в ПААГ.

Характеристика РНКазной активности баранзы. Энзиматическую активность барназы определяли методом кислотно-нерастворимого осадка РНК [19]. Исследуемую пробу белка растворяли в концентрации 1.25 мкМ в 0.125 М Tris-HCl, pH 8.5 и затем получали серию последовательных 5-кратных разведений образца в том же буфере. В качестве контрольного образца использовали раствор 0.125 М Tris-HCl, pH 8.5. К 40 мкл каждого образца добавляли 160 мкл раствора дрожжевой РНК (в концентрации 2 г/л) в 0.125 М Tris-HCl, pH 8.5 на льду. Реакционную смесь инкубировали 15 мин при 37°С. Если исследуемая проба обладала рибонуклеазной активностью, то в реакционной смеси образовывалась смесь фрагментов РНК различной длины: в образцах с высокой концентрацией РНКазы преобладали мононуклеотиды, в образцах с низкой концентрацией РНКазы – нерасщепленные полинуклеотиды. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл холодной 6% хлорной кислоты и инкубировали смесь 15 мин при 0°С. При инкубации с хлорной кислотой большие фрагменты РНК образуют осадок, который осаждали центрифугированием при 16 000 g в течение 10 мин при 0°С. Супернатанты разбавляли в 10 раз и измеряли оптическую плотность при 260 нм (OD₂₆₀) относительно контрольного образца. Большим значениям оптической плотности соответствовала большая рибонуклеазная активность.

Получение липосом, нагруженных барназой и модифицированных адресным модулем DARPin по внешней поверхности липидной мембраны. Для приготовления суспензии липидов 0.2 г L-α-фосфатидилхолина (Avanti Polar Lipids, Soy 40%), содержащего 16% фосфатидилэтаноламина, растворяли в 10 мл воды и выдерживали 16–20 ч при комнатной температуре. Затем суспензию пропускали через 0.8 мкм фильтр и хранили при 4°C.

0.5 мл суспензии фосфолипидов смешивали с 0.5 мл барназы (40 мг/мл) в буфере 20 мM Na-фосфат (pH 7.5). Белково-липидную суспензию подвергали пятикратной процедуре замораживания-оттаивания, после чего, используя экструдер Avanti Mini Extruder, 19 раз пропускали через поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм. Липосомы отделяли от избытка барназы на колонке Sepharose CL-2B (10 × 35 мм), уравновешенной 10 мM Na-фосфатным буфером (pH 7.5), содержащим 0.2 M NaCl.

Ковалентное присоединение DARPin к внешней поверхности липосом. Ковалентное присоединение DARPin к внешней поверхности мембраны липосом включало присоединение SH-групп к первичным аминам фосфатидилэтаноламина с использованием реагента Траута (2-иминотиолан) и последующую кросс-сшивку с адресным модулем DARPin, модифицированного по аминогруппам билинкером сульфо-EMCS (N-ε-малеимидокапроил-оксисульфосукцинимидный эфир). Липосомы, нагруженные барназой, инкубировали с 6 М реагентом Траута в 100 мМ Na-фосфатном буфере (pH 8.0) в течение часа при комнатной температуре. Инкубационную смесь очищали от избытка реагента на колонке NAP-5 (GE Healthcare, USA), уравновешенной 100 мM Na-фосфатным буфером (pH 7.5).

DARPin (5 мг/мл) инкубировали с 3-кратным избытком сульфо-EMCS в течение 45 мин при комнатной температуре. От избытка сульфо-EMCS избавлялись, пропуская смесь через колонку NAP-5 (GE Healthcare, USA), уравновешенную 100 мM Na-фосфатным буфером (pH 7.5). DARPin, конъюгированный с сульфо-EMCS, смешивали с липосомами, модифицированными реагентом Траута, и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. От не связавшегося с поверхностью липосом DARPin, смесь очищали с использованием колонки Sepharose CL-2B (10 × 35 мм), уравновешенной 20 мM Na-фосфатным буфером (pH 7.5).

Измерение размера и ζ-потенциала липосом. Гидродинамический размер и ζ-потенциал адресных и безадресных липосом, нагруженных барназой, определяли с использованием анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания) в 10 мМ KNO₃ при температуре 25°C. Измерения проводили в триплетах.

Культивирование эукариотических линий. В работе использовали следующие клеточные линии: SK-BR-3 (аденокарцинома молочной железы человека, номер по каталогу ATCC – HTB-30), MDA-MB-231 (карцинома молочной железы человека, номер по каталогу ATCC – HTB-26).

Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, США) и 2 мМ L-глутамин (ПанЭко, Россия), при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Изучение цитотоксичности HER2-специфичного токсина in vitro. Для изучения цитотоксичности адресных и безадресных липосом, нагруженных барназой, клетки высевали по 100 мкл на лунку в 96-луночные планшеты (Eppendorf) из стока 3.5 × 10⁴ (SK-BR-3) или 2 × 10⁴ (MDA-MB-231) клеток/мл и культивировали в течение ночи. После этого ростовую среду в лунках заменяли на свежую, содержащую различные концентрации липосомальных препаратов, клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 72 ч.

Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ [21]. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали как отношение усредненной оптической плотности в лунках с обработанными клетками к усредненной оптической плотности в лунках с необработанными клетками (контроль), выраженное в процентах. Расчет IC₅₀ (концентрация препарата, снижающая жизнеспособность клеток в 2 раза относительно контроля) определяли методом нелинейной регрессии с использованием программы Excel.