1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Биоорганическая химия
  4. T. 46, № 6, 2020

Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 6, стр. 719-728

Роль материнского гена pou5f3.3/oct60 в регуляции начальных этапов дифференцировки тканей в эмбриогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis

Е. А. Паршина 1, А. Г. Зарайский 1, Н. Ю. Мартынова 1, *

1 ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Россия

* E-mail: martnat61@gmail.com

Поступила в редакцию 28.04.2020
После доработки 06.05.2020
Принята к публикации 16.05.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Изучена роль материнского фактора Pou5f3.3/Oct60 шпорцевой лягушки Xenopus laevis, гомолога регулятора плюрипотентности стволовых клеток млекопитающих, белка Oct4, в раннем эмбриональном развитии. Было показано, что максимум концентрации белка Pou5f3.3/Oct60 наблюдается на стадии бластулы, а в дальнейшем происходит его деградация, стимулируемая посттрансляционными модификациями после активации генома зародыша. При помощи подхода, основанного на оверэкспрессии Pou5f3.3/Oct60 в зародышах было установлено, что этот белок активирует экспрессию ранних генов-маркеров плюрипотентности – pou5f3.2, vent2.2/2.1, klf 4/5, но ингибирует экспрессию генов цитоскелета и клеточной адгезии – actin, claudin, zyxin, ldb3. Кроме того, Pou5f3.3/Oct60 ингибирует экспрессию генов ag1/2 и agr2, участвующих в регуляции дифференцировки регенерационной бластемы ампутированных конечностей, а также в регуляции раннего развития мозга. Учитывая консервативность ранних стадий развития у позвоночных животных, данные, полученные на зародышах Xenopus laevis, могут быть использованы для лучшего понимания механизмов раннего развития млекопитающих, включая человека.

Ключевые слова: эмбриогенез, плюрипотентность, дифференцировка, транскрипционные факторы, POU5, pou5f3.3, мРНК

ВВЕДЕНИЕ

Развитие многоклеточных животных начинается с оплодотворенного яйца или зиготы, и сначала регулируется транскриптами генов, запасенных в яйцеклетке, т.н. материнскими транскриптами. Далее происходит активация генома зародыша и контроль за развитием переходит от материнских генов к генам зародыша. До и во время активации генома зародыша судьба клеток еще не определена: каждая из клеток может развиться в любую из тканей зародыша – т.н. состояние плюрипотентности клеток. В ходе дифференцировки клетки теряют это свойство. Для правильного раннего развития необходима как пространственная разметка зародыша, так и точная временная программа перехода клеток от плюрипотентного к дифференцированному статусу.

Для зародышей амфибий, рыб и Drosophila материнско-зародышевый переход происходит на стадии бластулы и поэтому называется термином “Midblastula Transition” (MBT), его обычно применяют к организмам, начинающим свою жизнь с серии быстрых делений. У этих животных удлинение клеточного цикла, начало клеточных движений, деградация материнских мРНК и начало транскрипции генов зародыша (ZGA, Zygotic Gene Activation), совпадают во времени. Генетические эксперименты последних десятилетий выявили десятки генов, определяющих судьбу клеток в развитии. Большая часть этих генов кодирует эволюционно консервативные факторы транскрипции, что делает возможным использование этих животных, развитие которых протекает во внешней среде, в качестве модельных организмов для получения знаний о молекулярных механизмах, обеспечивающих точную координацию программ дифференцировки клеток разных типов, протекающих одновременно в разных частях зародыша [1].

Классическими генами плюрипотентности, известными также как маркеры стволовых клеток млекопитающих, являются гены семейства POU. Эти гены кодируют транскрипционные регуляторы, содержащие Pou-домен, который состоит из двух ДНК-связывающих областей: С-концевая область содержит консервативный Pou-гомеодомен (POUH), а N-концевая область – уникальный Pou-специфичный домен (POUs). Обе области незаменимы для специфического связывания ДНК, при этом POUH и POUS области являются структурно независимыми доменами, соединенными гибким линкером. Такая организация доменов позволяет этим факторам участвовать в как в связывании с ДНК, так и в белок-белковых взаимодействиях. POUs домен является уникальным для POU-белков, по этому домену белки POU классифицируются на 6 семейств транскрипционных регуляторов POU1–POU6.

Белки OCT являются подсемейством POU и включают POU2, POU3 и POU5 семейства. Свое название – OCT – эти белки приобрели благодаря способности распознавать консенсусную последовательность в 8 пар нуклеотидов, называемую “октамерный мотив” [ATGC(A/T)AAT]. Известно, что 5' — область этого мотива, ATGC, связывается POU-специфичным доменом (POUs), в то время как 3'-половина сайта (A/T)AAT связана с POU-гомеодоменом (POUH). Белок OCT4 млекопитающих, кодируемый геном Pou5f1 был первым идентифицирован как фактор, который экспрессируется в плюрипотентных клетках. Показано, что активация эндогенного фактора OCT4 необходима для индукции плюрипотентных клеток из соматических в экспериментах по перепрограммированию [1, 2]. В то же время, помимо роли в поддержании плюрипотентности в клеточных культурах было показано участие OCT4 в наиболее раннем событии дифференцировки тканей – разделение внутренней клеточной массы (inner cell mass) и трофэктодермы (trophectoderm) на эмбриональных стволовых клетках мыши [2].

Гораздо меньше изучена роль гомологов фактора OCT4 в переходе от состояния плюрипотентности к дифференцировкe у низших позвоночных. Известны лишь единичные работы в этом направлении, проведенные с использованием в качестве модельного объекта эмбрионов рыбы Danio rerio. В частности, на этом объекте было показано, что фактор Pou 5F1, связываясь с определенными Sox-Pou сайтами в ходе активации генома зародыша, способен активировать самые ранние зиготические гены [1, 3].

Другим перспективным модельным объектом для подобных исследований являются эмбрионы шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Известно, что у шпорцевой лягушки три гена из семейства POU5: pou5F3.1/oct91, pou5F3.2/oct25, pou5F3.3/oct60, кодируют факторы Pou5F3.1/Oct91, Pou5F3.2/Oct25, Pou5F3.3/Oct60 соответственно, которые являются гомолагами OCT4 [4, 5]. Транскрипты гена pou5F3.3/oct60 являются материнскими, запасаются в ооцитах и быстро деградируют в ходе гаструляции, при появлении активных перемещений зародышевых слоев. Кроме этого, есть данные о его экспрессии при регенерации роговицы на более поздних стадиях развития [6]. Транскрипты pou5F3.2/oct25 частично запасаются в ооцитах, но их количество возрастает после MBT в ходе гаструляции, то есть этот ген транскрибируется начиная с поздних стадий оогенеза и до стадии нейрулы. Транскрипты pou5F3.1/oct91 появляются только после активации генома зародыша на стадии гаструлы. Эти три гомологичных гена расположены в одном кластере и их комбинированная пространственно-временная картина экспрессии эквивалентна гену OCT4 у мыши [2].

Поскольку самым “ранним”, строго материнским геном у шпорцевой лягушки, является pou5F3.3/oct60, можно предположить, что его белковый продукт является тем “пусковым агентом”, который участвует в инициации начальных этапов дифференцировки. В настоящей работе мы провели исследование по пространственной (методом гибридизации in situ) и временной экспрессии гена pou5F3.3/oct60 (методами ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинга и люциферазного репортерного теста) и показали, что транскрипция этого гена запускается до оплодотворения яйцеклетки на стадиях оогенеза, а трансляция достигает своего максимума у развивающегося зародыша на стадии бластулы. В ходе гаструляции количество транскриптов гена pou5F3.3/oct60 сильно уменьшается, а белок Pou5F3.3/Oct60 в ходе гаструляции меняет свою электофоретическую подвижность, предположительно, в результате фосфорилирования и подвергается деградации. Мы показали, что оверэкспрессия фактора Pou5F3.3/Oct60 приводит к аномалиям развития эмбрионов и изучили его влияние на экспрессию некоторых генов плюрипотентности и ранней дифференцировки эмбриональных клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Пространственная и временная экспрессии гена pou5F3.3/oct60

Для исследования и подтверждения временного и пространственного профиля экспрессии pou5F3.3/oct60 мы, во-первых, методом ОТ-кПЦР показали, что в ходе развития количество транскриптов pou5F3.3/oct60 резко падает в ходе гаструляции и остается очень низким практически до формирования всех основных тканей зародыша (рис. 1а), что подтверждает данные, полученные методом тотального секвенирования транскриптомов на разных стадиях развития Xenopus laevis, представленные в работе [7].

Рис. 1.

Экспрессия мРНК и белка Pou5f3.3/Oct60 в ходе эмбрионального развития. (а) Уровень экспрессии мРНК pou5f3.3/oct60 во время оогенеза и эмбрионального развития по стадиям: оциты – стадия до плодотворения, стадия 4 – начало дробления, стадия 8 – бластула, стадия 10–12 – гаструла, начало клеточных движений, стадия 13–14 – ранняя нейрула, начало формирования нервной пластинки, стадия 15–16 – поздняя нейрула, начало смыкания нервной трубки. (б) Гибридизация in situ на мРНК pou5f3.3/oct60 в нормальном развитии X. laevis. (в) Исследование активности промотора pou5f3.3/oct60 по стадиям развития при помощи люциферазного репортерного теста. (г) Уровень экспрессии белка Pou5f3.3/Oct60 во время оогенеза и онтогенеза по стадиям, показанный методом вестерн блоттинга со специфическими антителами из лизатов ооцитов и зародышей на разных стадиях развития. В качестве референсного контроля использовали тубулин, детектируемый анти-тубулиновыми моноклональными антителами. (д) Оверэкспрессия Pou5f3.3/Oct60 приводит к дефектам развития зародышей X. laevis на поздних стадиях развития. (е) Изменение уровня экспрессии генов плюрипотентности и дифференцировки в ответ на оверэкспрессию Pou5f3.3/Oct60, показанное методом ОТ-кПЦР. Данные представлены в виде кратного изменения экспрессии генов в опытных эмбрионах по сравнению с экспрессией в контрольных эмбрионах (положительные значения – кратное усиление экспрессии, отрицательные – кратное подавление). Для нормализации данных были использованны гены ODC и EFα, показаны стандартные отклонения, полученные в результате трех независимых экспериментов.

Во-вторых, мы подтвердили данные ПЦР методом гибридизации in situ. Было показано, что транскрипты этого гена диффузно расположены по поверхности зародыша с преобладанием в анимальном полюсе на стадии бластулы, постепенно убывают в ходе развития, очень слабо слабо детектируются на стадии гаструлы (11–13 стадия) и практически исчезают к моменту формирования нервной трубки (нейрулы) (рис. 1б).

Наконец, для выяснения временного паттерна экспрессии pou5F3.3/oct60 еще одним независимым методом мы создали люциферазную репортерную конструкцию, экспрессирующую высокочувствительную люциферазу Nanoluc (Promega) под контролем участка промотора pou5F3.3/oct60 длиной 2454 н.п. Согласно работе [8] этот участок промотора отвечает за активацию транскрипции во время оогенеза. Созданный вектор инъецировали в ооциты или зародыши шпорцевой лягушки, которые выращивали до различных стадий развития с последующим анализом активности люциферазы Nanoluc. В результате было показано, что активация транскрипции pou5F3.3/oct60 действительно происходит только в оогенезе и отсутствует на всех стадиях после начала дробления (рис. 1в).

Таким образом, мы проверили и подтвердили имеющиеся в литературе данные о материнской природе транскриптов гена pou5F3.3/oct60, полученные с использованием двух независимых количественных методов: ОТ-кПЦР и люциферазного репортера. Кроме этого, определили пространственные особенности экспрессии этого гена (в частности, увеличенное количество транскриптов в антериорной области при отсутствии четких границ локализации зоны экспрессии) при помощи гибридизации in situ. Этот метод не дает точной количественной оценки, но наглядно позволяет увидеть паттерн распределения транскриптов в целых зародышах на разных стадиях развития.

Исследование экспрессии белка Pou5F3.3/Oct60

Для изучения экспрессии белка Pou5F3.3/Oct60 важно было получить специфичные антитела, не имеющие кросс-реакции с двумя другими факторами. Согласно работе [9], наилучший результат по специфичности показал пептид 125–135 ак, расположенный в N-концевой области Pou-специфичного домена (POUs). Этот пептид в виде гибрида с GST-связывающим белком был получен в результате бактериальной экспрессии и использован для иммунизации. Этот же синтетический пептид был использован для иммобилизации на BrCN-сефарозе с целью выделения моноспецифических антител из сыворотки (см. Экспериментальную часть). Специфическая активность полученных антител в отношении белка Pou5F3.3/Оct60 была подтверждена с использованием Myc-тагированных экзогенных белков семейства pou5 (данные не приведены).

В результате исследованияс помощью полученных антител присутствия белка Pou5F3.3/Оct60 было установлено, что после оплодотворения максимальная концентрация этого белка обнаруживается на стадии средней бластулы (7–8 стадия), т.е. перед МБТ (специфическая полоса на Вестен блоте длиной 55 кДа). Начиная со стадии средней гаструлы (стадия 11), эта полоса исчезает и начинает детектироваться полоса на уровне 65 кДа. В ходе дальнейшего развития, после гаструляции, идет ослабление и этой полосы так, что к моменту нейруляции наблюдается незначительный постоянный уровень экспрессии полосы длиной 65 кДа (рис. 1г).

Можно предположить, что выявленная нами смена электрофоретической подвижности Pou5F3.3/Оct60 по ходу развития, вероятно, связана с фосфорилированием этого белка на более поздних стадиях, служащим сигналом для его деградации. Действительно, ранее другими авторами было показано, что в случае мышиного гомолога Pou5F3.3/Oct60-Oct4 именно фосфорилирование является сигналом, вызывающим его протеасомную деградацию [9, 10]. При этом изменение подвижности самого Pou5F3.3/Oct60 в результате фосфорилирования наблюдали авторы работы [11]. Таким образом, можно предложить следующий механизм регуляции уровня белка Pou5F3.3/Oct60 в эмбриогенезе шпорцевой лягушки.

На стадии, предшествующей МБТ происходит накопление фактора Pou5F3.3/Oct60, необходимого для поддержания плюрипотентного состояния зародышевых клеток в начальный период эмбриогенеза. Затем, в результате включения работы генома и началом дифференцировки клеток в дифинитивные ткани, происходит фосфорилирование Pou5F3.3/Oct60, что служит сигналом к его деградации и, как следствие, к снижению его концентрации в зародыше.

Оверэкспрессия фактора Pou5F3.3/Oct60 вызывает аномалии развития и оказывает влияние на экспрессию генов плюрипотентности и генов, участвующих в регуляции эмбриогенеза и регенерации

Для оценки необходимости деградации Pou5F3.3/Oct60 для последующего развития после прохождения начальных этапов дифференцировки мы использовали подход, основанный на оверэкспрессии тагированного Myc-эпитопом Pou5F3.3/Oct60.

В результате мы наблюдали, что на ранних стадиях отклонения развития от нормы не очень заметны. Однако, на более поздних стадиях развития (после 25–30 стадии) становиться очевидны повреждения головных структур зародыша: уменьшение глаз, мозга, деформация присоски (в 25 случаях из 30 зародышей) и реже – укорочение оси зародыша (в 15 случаях из 30) (рис. 1д).

Для изучения наблюдаемых аномалий на молекулярном уровне, мы проверили, как меняется уровень транскриптов основных генов-регуляторов плюрипотентности и дифференцировки при оверэкспрессии Pou5F3.3/Oct60. Для этой цели мы провели инъекции синтетической мРНК, кодирующей тагированный Mус-пептидом Pou5F3.3/Oct60, в зародыши шпорцевой лягушки на стадии начала дробления (стадия 2х клеток). На стадии поздней гаструлы, когда согласно полученным нами данным в нормальных условиях должно происходить уменьшение транскриптов Pou5F3.3/Oct60, проводили лизис этих зародышей и анализировали экспрессию выбранных генов методом ОТ-кПЦР.

В результате было показано, что оверэкспрессия фактора Pou5F3.3/Oct60 вызывает, во-первых: усиление экспрессия генов-маркеров плюрипотентности, которые участвуют в сдерживании процесса дифференцировки. Это гены klf4 и klf5 семейства KLF (Krüppel-Like Factor-транскрипционные факторы с цинк-содержащими доменами, регуляторы плюрипотентности и дифференцировки [12]), гены vent2.1 и vent2.2, кодирующие транскрипционные регуляторы – фукциональные гомологи известного маркера стволовых клеток NANOG [12], а так же фактора Pou5F3.2/Oct25 из семейства POU5.

Кроме того, было установлено, что важные для ранней дифференцировки гены, которые экспрессируются и как материнские и как зародышевые транскрипты, такие как sox2, рецепторы ретиноевой кислоты rxrg и rarg, wnt8 меняются незначительно в сторону уменьшения. Эти гены обеспечивают начальные этапы дифференцировки, и только sox2 рассматривается и как маркер плюрипотентности и как регулятор дифференцировки нейроэктодермы [12–14]. Так же незначительно менялась экспрессия третьего представителя POU5 семейства, зиготического фактора Pou5F3.1/Oct91.

Наконец, мы обнаружили, что гены, отвечающие за процессы дифференцировки и экспрессирующиеся активно уже после гаструляции в значительной степени подавляются. Так, в зародышах оверэкспрессирующих Pou5F3.1/Oct91 подавлялась экспрессия генов, кодирующих белки клеточной адгезии, включая гены трансмембранных рецепторов, участвующих в межклеточных взаимодействиях и связанных с ними белков – actin, claudin, zyxin, ldb3. Кроме того, ингибировалась экспрессия генов семейства AGR, участвующих в регенерации и дифференцировке клеток бластемы, а так же регулирующие развитие головных структур – ag1/2 и agr2 [15, 16] (рис. 1е).

ОБСУЖДЕНИЕ

Было показано, что pou5F3.3/oct60 является материнским геном, т.е. таким геном, транскрипты которого накапливаются в ооцитах и начинают транслироваться перед стадией МБТ. Количество мРНК и белкового продукта pou5F3.3/oct60 достигают максимума, соответственно, на стадии бластулы и ранней гаструлы. Появление фактора Pou5F3.3/Oct60 приводит к активации ранних генов развития: pou5F3.2/oct25, klf4, klf5, vent2.2, vent2.1, которые, с одной стороны, являются генами плюрипотентности, а с другой, участвуют в начальных этапах дифференцировки, когда в процессе гаструляции формируются основные типы зародышевых тканей. На этом этапе, когда клетки только начинают дифференцировку, важно сохранить тонкий баланс между плюрипотентностью и дифференцировкой, и только после того, как все клетки распределились по своим зародышевым листкам и готовы к образованию различных тканей, можно “включить” в них программы дифференцировки. Можно предположить, что фактор Pou5F3.3/Oct60, который присутствует в зародыше уже на самых ранних стадиях развития, селективно разрешает работу генов плюрипотентности и подавляет гены дифференцировки. Наиболее вероятной активируемой мишенью этого фактора является принадлежащий к этому же семейству ген Pou5F3.2/Oct25, который активируется в ходе гаструляции. В то же время, имеющиеся в литературе данные о непосредственной активации транскрипции белком Pou5F3.3/Oct60 гена pou5F3.1/oct91 [17] не подтвердились в наших экспериментах. Возможно, в активации этого гена должен участвовать каскад из факторов семейства POU5: самый ранний, материнский Pou5F3.3/Oct60 подключает зиготическую транскрипцию pou5F3.2/oct25, и уже фактор, кодируемый этим геном, или их комбинация активирует pou5F3.1/oct91, который так же является одним из наиболее ранних зиготических транскриптов [18]. Отметим, что включение всех трех факторов семейства POU5 функционально гомологично работе фактора OCT4 млекопитающих в развитии и поддержании стволового статуса клеток [18, 19].

Полученные нами данные об активации Pou5F3.3/Oct60 генов klf4, klf5, vent2.2, vent2.1 являются новыми для Xenopus laevis и являются хорошим дополнением к имеющимся в мировом научном сообществе данным о влиянии факторов POU5 на гомологи этих генов у других модельных организмов. Так, показано, что фактор Pou5f1 может усиливать экспрессию генов klf на уровне транскрипции в Danio rerio [20, 21]. Точно так же Pou5f3.2/Oct25 может активировать экспрессию Vent2b [22]. Кроме того, недавно было показано, что активация Klf4 происходит под влиянием комплекса Pou5f3/Stat3 у японской камбалы [23].

Значительный интерес и хорошую основу для дальнейших исследований представляют также данные об ингибирующем влиянии фактора Pou5F3.3/Oct60 на экспрессию генов-участников сигнальных каскадов клеточной адгезии, actin, claudin, zyxin, ldb3, и генов-регуляторов раннего развития мозга и регенерации ag1/2 и agr2. Ранее другими авторами было показано, что подавление активности генов клеточной адгезии может происходить при участии двух других факторов семейства POU5. При этом влияние генов этого семейства на регулирование адгезии происходит как на транскрипционном, так и на посттрансляционном уровне – в результате белковых взаимодействий с факторами транскрипции [24]. В ходе дальнейших исследований предстоит выяснить, какие из этих механизмов ответственны за наблюдаемые эффекты ингибирования этих генов белком Pou5F3.3/Oct60.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение векторов, использованных в работе

Стратегии создания ДНК конструкций описаны в табл. 1.

Таблица 1.

  Векторные конструкции полученные в ходе работы

ДНК-конструкция ПЦР-праймеры и стратегия клонирования
pAL2-T-pou5f3.3 ПЦР с тотальной кДНК
Прямой праймер: atgc gaattcaATGGACCAGCCCATATTGTA
Обратный праймер: atgc ctcgag TCAGCCGGTCAGGACCCC
Полученный ПЦР-фрагмент был клонирован в pAL2-T Vector (Evrogen)
В полученной конструкции кодирующая последовательность pou5f3.3 располагается перед промотором sp6, что позволяет синтезировать антисмысловой зонд
pNL1.1-pr pou5f3.3.L ПЦР с ДНК X. laevis
Прямой праймер: atgc ctcgag ATTTTATGCTTCCAGGATGTAAGC
Обратный праймер: atgc aagctt AACTCTTCCAACCCAAGGCCTG
Клонирование в pNL1.1 vector (Promega) по сайтам рестрикции XhoI-HindIII
pGEX4T1-pou5f3.3.L126-136aa Вставка была получена отжигом двух праймеров:
Прямой праймер: AATTCTGGCATTATCCCTCCTGGCAGCAGGGGAACCTAc
Обратный праймер: tcgagtaggttcccctgctgccaggagggataatgccag
Клонирование в плазмиду pGEX4T1 pCS2MT по сайтам рестрикции EcoRI-XhoI
pCS2MT-pou5f3.3 ПЦР с плазмиды pAL2-T-pou5f3.3
Прямой праймер: atgc gaattcaATGGACCAGCCCATATTGTA
Обратный праймер: atgc ctcgag TCAGCCGGTCAGGACCCC
Полученный ПЦР-фрагмент был клонирован в pCS2MT по сайтам рестрикции EcoRI-XhoI

Получение синтетической мРНК и микроинъекции мРНК в зародыши

мРНК 6myc-pou5f3.3/oct60 была синтезирована на линеаризованной рестриктазой Not1 плазмиде pCS2MT-pou5f3.3 с использованием коммерческого набора Ambion SP6 mRNA Mtssage Machine. После синтеза мРНК очищали при помощи набора CleanRNA Standard (Евроген). Экспрессия тагированного белка 6myc- Pou5f3.3/Oct60 в эмбрионах была подтверждена при помощи иммуноблоттинга с анти-myc моноклональными антителами (Sigma).

Зародышей Xenopus получали в результате оплодотворения in vitro и растворяли оболочки в 2% цистеине при рН 7.8 мРНК 6myc-pou5f3.3/oct60 смешивали с флуоресцеин-лизин-декстраном (FLD, Invitrogen, 40 кДа, 5 мкг/мкл) и микроинъецировали (250 нг/бластомер) в эмбрионы Xenopus laevis на стадии 2-х бластомеров в один или оба, в зависимости от целей эксперимента, в 0.1 × MMR c 4% фиколлом по методике, представленной в работе [25].

Гибридизация in situ

Для синтеза антисмслового зонда к pou5f3.3/oct60 использовали набор mMessage mMachine SP6 (Ambion) и digNTP. Гибридизацию in situ всех эмбрионов с антисмысловыми dig-зондами к pou5f3.3/oct60 проводили по стандартной методике [26] c небольшими дополнениями [27, 28].

Выделение тотальной РНК из эмбрионов Xenopus laevis, получение кДНК и ОТ-кПЦР

Выделение тотальной РНК из эмбрионов Xenopus laevis проводили на стадии нейрулы (стадия 13) с использованием реагента ExtractRNA (Evrogen) и набора CleanRNA (Evrogen) в соответствии с инструкциями производителя кДНК синтезировали с использованием набора MMLV RT (Evrogen) из 250 нг РНК образца, а ПЦР проводили с помощью qPCRmix-HS SYBR (Evrogen). ОТ-кПЦР проводили в амплификаторе DTPrime 4 qPCR (DNA-Technology) по методике, представленной в работе [29].

Используемые нами праймеры перечислены в табл. 2.

Таблица 2.

  Последовательности олигонуклеотидов (праймеров), использованных для анализа экспрессии исследуемых факторов (с их индентификационными номерами в системе PubMed–NCBI) методом кПЦР с указанием длины амплифицированного фрагмента

№ Название гена Идентификационный
номер белка в NCBI 		Последовательность праймера Длина амплификата, н.п.
(нуклеотидных пар)
1 Elongation factor 1
Alpha (EF-α) 		NP_001080911 Прямой: GTTCATTTACCGCACAGGTTATCA
Обратный: ACACAGGGGCATATCCAGCA 		70
2 Ornithine
decarboxylase 1
(ODC) 		NP_001080167.1 Прямой: GCCAGTTCTAACAAAGAAACCCA
Обратный: TCTACGATACGATCCAGCCCA 		93
3 Pou class 5 homeobox 3, gene3 (pou5f3.3) NP_001081583.1 Прямой: CACAAAACTGGACTTACTGGGG
Обратный: TCTCAACTGCCCTTACCTTCTC 		70
4 Pou class 5 homeobox 3, gene 2 (pou5f3.2) NP_001079832 Прямой: CCCTGTTGGACACTATGCG
Обратный: CCCTGTTGGACACTATGCG 		113
5 Xvent-2B protein (ventx2.1) NP_001081607.1 Прямой: GCACCGCAGCCCAC
Обратный: GGAGTTGAAGGGAGTCAGG 		141
6 Xbr-1a/xvent2 protein (ventx2.2) NP_001080931 Прямой: CAACAGCACCTTGGGC
Обратный: CTGCGGGAGGACAGAAGTC 		125
7 Kruppel-like factor 5 (klf5) NP_001090064.1 Прямой: ACTACCCTGGTAAGAACCTACA
Обратный: CCCTTTTCCCCATGACAGGA 		132
8 Kruppel-like factor 4 (klf4) NP_001079828.1 Прямой: ATGAACCGACCCGCCAC
Обратный: AAGCTCGATCACATCGCTGA 		171
9 Xwnt-8 protein (wnt8) AAH82627.1 Прямой: GCACAGTCAAATGCGAGCAA
Обратный: AAACAAATCCACTGGCCCGA 		167
10 Pou class 5 homeobox 3, gene1 (pou5f3.1) AFU51783.1 Прямой: ATTAGGGAGAATGGCGGGGA
Обратный: CAGTGGGACCGTGGGAAAAA 		117
11 Retinoid X receptor gamma (rxrg) NP_001088948 Прямой: AGCATTTGGAGACGCTGGAT
Обратный: TGCTCGCAGCAGAATGACTT 		160
12 SRY-box 2 (sox2) NP_001081691.1 Прямой: GCTGTGGCGGGAGAGAGAAAGT
Обратный: TGGTTGTTGGACGCAGAGTTGGA 		178
13 Retinoic acid receptor gamma (rarg) NP_001081663.1 Прямой: GTCGACGAAGGCCTGACAAA
Обратный: GAATCAGCGGAGGCATAGGT 		141
14 Anterior gradient 2 (xag2) NP_001081669.1 Прямой: TGCTGCCAAGTCTGAGCCTGC
Обратный: TCCTGAGCCAGTTTCTGTGCCA 		227
15 Zyxin (zyx) NP_001092151.1 Прямой: CATTTAAGGCCCCGGAAGAGC
Обратный: TGGGAATGAACCACCAGAGG 		245
16 Anterior gradient 1 (xag1) NP_001079667.1 Прямой: GCAGGAACAACTGATACCAAAACT
Обратный: GGACAATCTTCCAGGTGGTG 		182
17 Anterior gradient 2 (xagr2) NP_001079720.1 Прямой: TGGCCAGTATGTTCCCAAGGTTGT
Обратный: CATCACTTTAGCATACACCTCCGC 		238
18 Сlaudin 1 (cldn1) NP_001079445.1 Прямой: TCTTCACAAAACCCACACCCT
Обратный: ACCATGATTGCTGTTGCTAGT 		150
19 LIM domain binding 3 (ldb3) NP_001080237.1 Прямой: CTCCAGTGTATCAGGCGGTG
Обратный: GGGCTGTTACGTTCCGTTTC 		199

Анализ люциферазной активности

Для исследования промоторной активности плазмиду pNL1.1-pr pou5f3.3 L (62.5 пг/ооцит или 12.5 пг/бластомер) смешивали с контрольной плазмидой pRL-TK-Renilla (250 пг/ооцит или 50 пг/бластомер) и микроинъецировали в ооциты или эмбрионы Xenopus laevis на стадии 2‑х бластомеров. Ооциты инкубировали в течение суток при температуре 18°C, эмбрионы – до необходимой стадии. Затем ооциты и эмбрионы собирали, лизировали и измеряли активность люциферазы с помощью наборов Nano-Glo kit (Promega) и Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) по протоколу производителя. Для каждого из образцов подсчитывали отношение активности люциферазы Nanoluc к активности контрольной люциферазы Renilla. При описании результатов люциферазного теста за условную единицу принималось отношение активностей на стадии 9.

Получение специфических антител к Pou5f3.3/Oct60, гель-электрофорез и иммуноблоттинг

Антитела к Pou5f3.3/Oct60 получали против фрагмента, содержащего аминокислотные остатки 125–136 (WHYPSWQQGNLK). Соответствующую вставку клонировали в вектор pGEX-4T, как описано в табл. 1, экспрессировали в штамме DH-5α Escherichia coli DH-5α, адсорбировали на глутатион-агарозе (Sigma) из бактериальных лизатов, промывали PDB (Pull-Down Buffer: 25 мM Tris-HCl, pH 7.5, 175 мM NaCl, 1 мM EDTA, 1 мM EGTA, 5% глицерин, 0.5% NP-40, коктейль ингибиторов протеаз (Sigma)), элюировали 50 мМ восстановленного глутатиона и использовали для иммунизации кролика. Антитела из сыворотки выделяли на аффинной колонке, в которой синтетический пептид, соответствующий 125–136 а.а. белка Pou5f3.3/Oct60 был иммобилизован на BrCN-сефарозе (Sigma). Аффинную очистку моноспецифических антител проводили, как описано в [25]. Уровень эндогенного белка Pouf3.3/Oct60 измеряли по методике [29] на лизатах ооцитов или эмбрионов Xenopus и с помощью SDS-PAGE электрофореза с последующим вестерн-блоттингом с детектированием антител против Pou5f3.3/Oct60. Вторичные антитела представляли собой козий анти-кроличий F (ab') фрагмент, конъюгированный с щелочной фосфатазой (Sigma). Стабилизированный субстрат Western Blue (Promega) использовали для обнаружения антител, конъюгированных щелочной фосфатазой.

Статистические методики, использованные для анализа достоверности данных

Для проверки статистической достоверности данные ОТ-кПЦР, полученные от трех независимых экспериментов, были импортированы в Microsoft Excel и проанализированы с использованием метода ΔΔCt [30]. Для нормировки уровня экспрессии генов в качестве внутреннего контроля использовали уровень экспрессии гена фактора элонгации EF-1α и орнитин-декарбоксилазы (ODC) согласно работе [31] уровни экспрессии которых в данных экспериментальных условиях считались неизменными.

Эксперименты по анализу изменений в экспрессии Pou5f3.3/Oct60 на проявленных специфическими антителами PVDF мембранах проводили в более чем 5-кратном повторении.

Список литературы

  1. Onichtchouk D. // Biochimica et Biophysica Acta. 2016. V. 1859. P. 770–779. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2016.03.013

  2. Cao Y. // Cell & Bioscience 2013. V. 3 P. 15. https://doi.org/10.1186/2045-3701-3-15

  3. Leichsenring M., Maes J., Mössner R., Driever W., Onichtchouk D. // Science. 2013. V. 341. P. 1005–1009. https://doi.org/10.1126/science.1242527

  4. Hinkley C.S., Martin J.F., Leibham D., Perry M. // Mol. Cell. Biol. 1992. V. 12. P. 638–649. https://doi.org/10.1128/mcb.12.2.638

  5. Whitfield T., Heasman J., Wylie C. // Dev. Biol. 1993. V. 155. P. 361–370. https://doi.org/10.1006/dbio.1993.1035

  6. Kimberly J.P., Alvin G.T., Jonathan J.H. // Developmental Biology. 2013. V. 374. P. 281–294. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2012.12.005

  7. Briggs J.A., Weinreb C., Wagner D.E., Megason S., Peshkin L., Kirschner M.W., Klein A.M. // Science. 2018. V. 360. P. 6392. https://doi.org/10.1126/science.aar5780

  8. Morichika K., Sugimoto M., Yasuda K., Kinoshita T. // Zygote. 2014. V. 22. P. 266–274. https://doi.org/10.1017/S0967199412000536

  9. Whitfield T.T., Heasman J., Wylie C.C. // Dev. Biol. 1995. V. 169. P. 759–769. https://doi.org/10.1006/dbio.1995.1185

  10. Lippok B., Sungmin Song S., Driever W. // Dev. Dyn. 2014. V. 243. P. 468–477. https://doi.org/10.1002/dvdy.24079

  11. Bae K.B., Yu D.H., Lee K.Y., Yao K., Ryu J., Lim D.Y., Zykova T.A., Kim M.O., Bode A.M., Dong Z. // Stem Cell Reports. 2017. V. 9. P. 2050–2064. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2017.10.017

  12. Cao Y. // Sci. China Life Sci. 2015. V. 58. P. 336–342. https://doi.org/10.1007/s11427-015-4799-2

  13. Dollé P. // Nucl Recept Signal. 2009. V. 12. P. 006. https://doi.org/10.1621/nrs.07006

  14. Chu C.W., Sokol S.Y. // Elife. 2016. V. 23. P. e16 463. https://doi.org/10.7554/eLife.16463

  15. Tereshina M.B., Ermakova G.V., Ivanova A.S., Zaraisky A.G. // Biol. Open. 2014. V. 15. P. 192–203. https://doi.org/10.1242/bio.20147401

  16. Ivanova A.S., Tereshina M.B., Ermakova G.V., Belousov V.V., Zaraisky A.G. // Sci. Rep. 2013. V. 3. P. 1279. https://doi.org/10.1038/srep01279

  17. Exner C.R.T., Kim A.Y., Mardjuki S.M., Harland R.M. // Dev. Biol. 2017. V. 425. P. 33–43. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2017.03.015

  18. Venkatarama T., Lai F., Luo X., Zhou Y., Newman K., King M.L. // Development. 2010. V. 137. P. 651–660. https://doi.org/10.1242/dev.038554

  19. Morrison G.M., Brickman J.M. // Development. 2006. V. 133. P. 2011–2022. https://doi.org/10.1242/dev.02362

  20. Onichtchouk D., Geier F., Polok B., Messerschmidt D.M., Mössner R., Wendik B., Song S., Taylor V., Timmer J., Driever W. // Molecular Systems Biology. 2010. V. 6. P. 354. https://doi.org/10.1038/msb.2010.9

  21. Kotkamp K., Mössner R., Allen A., Onichtchouk D., Driever W. // Dev. Biol. 2014. V. 385. P. 433–447. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2013.10.025

  22. Cao Y., Knochel S., Donow C., Miethe J., Kaufmann E., Knochel W. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 43 735–43 743. https://doi.org/10.1074/jbc.M407544200

  23. Sun Y., Liu J.,Wang B., Liu X., Du X., Liu Y., Zhang Q. // Gene. 2019. V. 687. P. 56–63. https://doi.org/10.1016/j.gene.2018.11.029

  24. Livigni A., Peradziryi H., Sharov A.A., Chia G., Hammachi F., Portero Migueles R.P., Sukparangsi W., Pernagallo S., Bradley M., Nichols J., Ko M. S.H., Brickman J.M. // Current Biology. 2013. V. 23. P. 2233–2244. https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.09.048

  25. Martynova N.Y., Eroshkin F.M., Ermolina L.V., Ermakova G.V., Korotaeva A.L., Smurova K.M., Zaraisky A.G. // Dev. Dyn. 2008. V. 237. P. 736–749. https://doi.org/10.1002/dvdy.21471

  26. Harland R.M. // Methods. Cell. Biol. 1991. V. 36. P. 685–695. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)60307-6

  27. Ерошкин Ф.М., Байрамов А.В., Ермакова Г.В., Зарайский А.Г., Мартынова Н.Ю. // Биоорган. химия. 2018. Т. 44. С. 303–316. [Eroshkin F.M., Bayramov A.V., Ermakova G.V., Zaraisky A.G., Martynova N.Y. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2018. V. 44. P. 310–321.] https://doi.org/10.1134/S1068162018030032

  28. Мартынова Н.Ю., Ерошкин Ф.М., Зарайский А.Г. // Биоорган. химия. 2018. Т. 44. С. 353–356. [Martynova, N.Y., Eroshkin, F.M., Zaraisky, A.G. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2018. V. 44. P. 362–365.] https://doi.org/10.1134/S106816201803010X

  29. Мартынова Н.Ю., Паршина Е.А., Ерошкин Ф.М., Зарайский А.Г. // Биоорган. химия. 2020. Т. 46. С. 396–403. [Martynova N.Y., Parshina E.A., Eroshkin F.M., Zaraisky A.G. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2020. V. 46. P. 530–536.] https://doi.org/10.1134/S1068162020040147

  30. Livak K.J., Schmittgen T.D. // Methods. 2001. V. 25. P. 402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262

  31. Иванова А.С., Короткова Д.Д., Мартынова Н.Ю., Аверьянова О.В., Зарайский А.Г., Терешина М.Б. // Биоорган. химия. 2018. Т. 44. С. 348–352. [Ivanova A.S., Korotkova D.D., Martynova N.Y., Averyanova O.V., Zaraisky A.G., Tereshina M.B. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2018. V. 44. P. 358–361.] https://doi.org/10.1134/S106816201803007X

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Биоорганическая химия

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал