Биоорганическая химия, 2020, T. 46, № 6, стр. 670-675

ВВЕДЕНИЕ

Кожа, самый большой по площади орган человека и животных, выполняет защитную функцию, участвует в дыхании, терморегуляции, обменных и многих других жизненно важных процессах. Кожа млекопитающих состоит из двух слоев: эпидермиса, который образует защитный барьер на поверхности тела, и дермы, которая представляет собой соединительную ткань, содержащую петли капилляров, нервные окончания, волосяные фолликулы, железы и мышечные волокна, придающие коже прочность и эластичность. Эпидермис представляет собой многослойный плоский эпителий, состоящий из пролиферирующих базальных и дифференцированных супрабазальных кератиноцитов, которые являются основными клетками эпидермиса [1]. Кератиноциты реагируют на различные факторы внешней среды и непосредственно участвуют в регуляции воспалительного ответа кожи. Показано, что пять провоспалительных цитокинов, продуцируемых кератиноцитами, участвуют в индукции воспаления кожи: IL-17A, IL-22, онкостатин M, TNF-α и IL-1α [2]. Установлена роль отдельных цитокинов в развитии воспалительных процессов кожи: IL-22 и онкостатин M контролируют эпидермальную гиперплазию и потерю дифференцировки, тогда как IL-1α, IL-17A и TNF-α обеспечивают активацию врожденного иммунитета [3].

Несколько лет назад мы синтезировали пептид LKEKK (Np5), соответствующий последовательностям 16–20 тимозина-α₁ (TM-α₁) и 131–135 интерферона-α₂ (IFN-α₂), и показали его способность специфически связываться с T- и B-лимфоцитами человека [4, 5], мембранами эпителиальных клеток тонкого кишечника крысы [6, 7], эпителиальными клетками линий IEC-6 крысы [8, 9] и Caco-2 человека [9], клетками линии Raw 264.7 мыши [10]. Во всех случаях обработка протеазами не влияла на связывание, что указывало на небелковую природу рецептора пептида; связывание конкурентно ингибировали TM-α₁, IFN-α₂ и B субъединица холерного токсина. Мы предположили, что рецептором Np5 может быть рецептор токсина GM1-ганглиозид [11, 12].

Недавно показано, что Np5 способен подавлять развитие воспаления в эпителиальных клетках кишечника in vitro и in vivo: в клетках линии Caco-2 человека пептид значительно снижал TNF-α-индуцированную экспрессию IL-6, IL-8, IL-1β и, в то же время, увеличивал экспрессию IL-10, а также уменьшал выраженность воспаления у мышей с экспериментальным колитом [13].

Цель данного исследования – охарактеризовать противовоспалительное действие Np5 на кератиноциты человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Основные характеристики пептидов (чистота, данные аминокислотного анализа, молекулярная масса) приведены в табл. 1.

Удельная активность [³H]Np5 составила 28 Ки/ммоль.

Эксперименты показали, что в выбранных нами условиях [³H]Np5 специфически связывается с кератиноцитами человека, связывание было обратимым и насыщаемым, динамическое равновесие в системе меченый пептид–рецептор устанавливалось примерно через 30 мин и сохранялось, по крайней мере, 1 ч. Поэтому для определения K_d, реакцию связывания проводили в течение 30 мин. Неспецифическое связывание меченого пептида в этих условиях составляло 12.6 ± 0.3% от величины его общего связывания. На рис. 1 приведен график Скэтчарда, характеризующий специфическое связывание [³H]Np5 с кератиноцитами. Линейность графика свидетельствует о наличии на клетках одного типа рецепторов к CT-B, а значение K_d = 2.6 ± 0.2 нМ – о высоком сродстве пептида к рецептору.

Рис. 1.

Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [³H]Np5 с кератиноцитами человека. B и F – молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида соответственно.

Для характеристики специфичности связывания [³H]Np5 с клетками, в качестве потенциальных конкурентов меченого пептида были протестированы немеченые TM-α₁, IFN-α₂, Np5 и iNp5. Приведенные в табл. 2 значения K_i свидетельствуют о высокой ингибирующей способности TM-α₁, IFN-α₂ и Np5 и отсутствии таковой у пептида с инвертированной последовательностью iNp5. Неспособность iNp5 ингибировать связывание указывает на высокую специфичность рецептора. Таким образом, TM-α₁, IFN-α₂ и Np5 связываются с высоким сродством и специфичностью с общим рецептором на кератиноцитах человека.

Скрининг активности 36 цитокинов позволил идентифицировать пять мощных индукторов воспаления – IL-17A, IL-22, онкостатин M, TNF-α и IL-1α, при этом IL-1α, IL-17A и TNF-α проявляли наибольшую активность [2]. Год назад мы продемонстрировали противовоспалительную активность Np5 на моделях TNF-индуцированного воспаления человеческих клеток кишечника линии Caco-2 in vitro и DSS-индуцированного колита у мышей in vivo [13]. Здесь мы исследовали противовоспалительную активность Np5, используя in vitro модель IL-17A-индуцированного воспаления кератиноцитов человека. Для этого клетки обрабатывали пептидом (10–1000 нМ) и IL-17A (20 нг/мл) добавляли для индукции воспаления. Параллельно в качестве отрицательного контроля был протестирован пептид с инвертированной последовательностью iNp5. Эксперименты показали, что обработка кератиноцитов пептидом Np5 в диапазоне концентраций 50–1000 нМ дозозависимо снижала IL-17A-индуцируемую продукцию трех провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и IL-1α) (табл. 3) и, в то же время, увеличивала выработку противовоспалительного цитокина IL-10 (табл. 4). Пептид с инвертированной последовательностью был неактивен, что указывало на высокую специфичность действия Np5.

Ранее мы установили, что действие Np5 на различные клетки (человеческие T- и B-лимфоциты, человеческие Caco-2 и крысиные IEC-6 эпителиальные клетки кишечника, мышиные Raw 264.7 макрофагоподобные клетки) реализуется cGMP-зависимым путем передачи сигнала [4, 5, 8]. Результаты настоящей работы, представленные в табл. 5, показывают, что Np5 при концентрациях 50–1000 нМ дозозависимо увеличивает активность sGC в кератиноцитах, но не влияет на активность pGC; протестированный параллельно iNp5 был неактивен. Таким образом, связывание Np5 с кератиноцитами человека приводит к увеличению активности в них sGC. Мы также исследовали действие пептида на способность кератиноцитов к IL-17A-индуцированной продукции TNF-α и IL-1α при частичной или полной потери активности sGC. Для ингибирования активности фермента был использован ODQ, специфический ингибитор sGC [14]. Данные, представленные в табл. 6, показывают, что ODQ дозозависимо снижал активность sGC и ингибирующий эффект 500 нМ Np5 на IL-17A-индуцированную продукцию кератиноцитами TNF-α и IL-1α. Таким образом, снижение активности фермента сопровождалось потерей Np5 способности ингибировать секрецию противовоспалительных цитокинов, и следовательно действие пептида опосредовано через sGC.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пептид Np5 (LKEKK) связывается с высокой специфичностью и аффинностью с кератиноцитами человека, снижает их способность к IL-17A-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и IL-1α) и, в то же время, увеличивает выработку противовоспалительного цитокина IL-10. Таким образом, Np5, короткий пептид с простой структурой, обладает значительным противовоспалительным потенциалом и пригоден для разработки на его основе лекарственного препарата.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали TM-a₁, IL-17A, TNF-α, IL-1α (“Immundiagnostik AG”, Германия), фенилметилсульфонилфторид (PMSF), Tris (“Fluka”, США), апротинин, лейпептин, пепстатин А, фетальную сыворотку теленка и Hepes (“ICN”, США); сахарозу, БСА, ЭДТА, ЭГТА, азид натрия (NaN₃) (“Serva”, Германия), среду для культивирования клеток EpiGro (“Cell Applications, Inc.”, США), все остальные реагенты и растворители были отечественного производства и использовались после соответствующей очистки.

Пептиды Np5 (LKEKK) и iNp5 (KKEKL) синтезировали на автоматических синтезаторах (модель 430A и Vega Coupler, модель C250; “Applied Biosystems”, США) с использованием Boc/Bzl-тактики наращивания пептидной цепи и очищали препаративной обращеннофазовой хроматографией (хроматограф “Gilson”, Франция), колонка Waters SymmetryPrep C18 (19 × 300 мм) (“Malva”, Греция). Синтезированные пептиды были охарактеризованы данными аналитической обращеннофазовой ВЭЖХ (хроматограф “Gilson”, Франция; колонка XТerra RP18, “Malva”, Греция), аминокислотного анализа (гидролиз 6 М HCl, 24 ч, 110°C; аминокислотный анализатор 4151 Alpha Plus, “LKB”, Швеция) и масс-спектрального анализа (масс-спектрометр “Finnigan”, США). Рекомбинантный интерферон-α₂ был получен из ФГУП “Гос, НИИ ОЧБ” ФМБА (Санкт-Петербург, Россия).

Нормальные эпидермальные кератиноциты человека (NHEK, “Cell Applications, Inc.”, США) культивировали в течение 24 ч в не содержащей сыворотку среде EpiGro, содержащей 10% эмбриональную сыворотку теленка, при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Клетки (10⁶/лунка) высевали в 6-луночные планшеты для культивирования клеток (“Nunc”, Дания). Жизнеспособность клеток оценивали по окрашиванию трипановым синим (выживаемость клеток: 95%). Клетки преинкубировали с Np5 или iNp5 (10–1000 нМ) в течение 1 ч до стимуляции IL-17A (20 нг/мл) [15].

[³H]Np5 получали реакцией высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) [16]. К раствору 2.0 мг пептида в 0.5 мл воды добавляли 50 мг окиси алюминия и упаривали на роторном испарителе. Окись алюминия с нанесенным пептидом смешивали с 10 мг катализатора (5% Rh/Al₂O₃). Полученную твердую смесь помещали в ампулу объемом 10 мл. Ампулу вакуумировали, заполняли газообразным тритием до давления 250 мм рт. ст., нагревали до 170°C и выдерживали при этой температуре в течение 20 мин. Затем ампулу охлаждали, вакуумировали, продували водородом и повторно вакуумировали. Меченый пептид экстрагировали из твердой реакционной смеси двумя порциями по 3 мл 50% водного этанола, полученный раствор объединяли и упаривали. Для удаления лабильного трития процедуру повторяли дважды. Очистку меченого пептида проводили методом ВЭЖХ со спектрофотометром “Beckman” при длинах волн 254 и 280 нм на колонке Kromasil (4 × 150 мм, зернение 5 мкм) при 20°C, элюент – 0.1% ТХУ, градиент метанола 42–70% за 20 мин, скорость потока 3 мл/мин. Включение трития в пептид рассчитывали с использованием жидкостного сцинтилляционного счета.

Реакцию связывания [³H]Np5 с кератиноцитами проводили в соответствии со следующей схемой: клеточную суспензию (10⁶ клеток/мл) инкубировали с меченым пептидом (10^–11–10^–7 М, три параллельных пробы для каждой концентрации) в 1 мл среды EpiGro, содержавшей 10 мМ Hepes, 20 мМ NaN₃ и 50 мкМ PMSF, pH 7.4, при 4°C в течение 30 мин. По окончании инкубации реакционную смесь фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/A (“Whatman”, Англия). Фильтры промывали ледяным физиологическим раствором, содержащим 10 мМ Hepes, pH 7.4 (три раза по 5 мл). Радиоактивность на фильтрах подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика LS 5801 (“Beckman”, США). Величину специфического связывания [³H]Np5 с клетками определяли по разности между его общим и неспецифическим связыванием, а величину неспецифического связывания [³H]Np5 – в присутствии 10^–4 М немеченого пептида (1000-кратный избыток по отношению к самой большой концентрации меченого пептида – 10^–7 М). Для определения равновесной константы диссоциации K_d строили график зависимости отношения молярных концентраций связанного (B) и свободного (F) меченого пептида от молярной концентрации связанного меченого пептида (B) [17].

Для оценки способности TM-α₁, IFN-α₂, пептидов Np5 и iNp5 ингибировать специфическое связывание [³H]Np5 с кератиноцитами, клетки (10⁶/мл) инкубировали с меченым пептидом (5 нМ) и одним из потенциальных конкурентов (диапазон концентраций 10^–10–10^–5 М, три повтора для каждой концентрации), как описано выше. Константу ингибирования (K_i) определяли по формуле: K_i = [IC]₅₀/(1 + [L]/K_d) [18], где [L] – молярная концентрация [³H]Np5; K_d – равновесная константа диссоциации комплекса [³H]Np5–рецептор; [IC]₅₀ – концентрация немеченого лиганда, вызывающая 50%-ное ингибирование специфического связывания меченого пептида, Величину [IC]₅₀ определяли графически на основании кривой ингибирования. Значение K_d измеряли предварительно, как описано выше.

Для определения активности растворимой (sGC) и мембраносвязанной (pGC) гуанилатциклазы в кератиноцитах, их ресуспендировали в 10 мМ Tris-HCl-буферном растворе, pH 7.5, содержащем 1 мМ MgCl₂, 1 мМ дитиотреитол, 5 мкМ пепстатин A, 50 мкМ PMSF, 10 мкМ ингибитор трипсина из сои и 1 мМ бензамидин. Полученную суспензию (2.5 × 10⁸ клеток/мл) гомогенизировали в ледяной бане и гомогенат центрифугировали при 100 000 g, (10 мин, 4°C). Супернатанты отбирали, а осадки ресуспендировали в равных объемах буферного раствора. Супернатанты и ресуспендированные осадки использовали для определения активности sGC и pGC соответственно. Гуанилатциклазную активность определяли путем мониторинга превращения α-[³²P]GTP в [³²P]cGMP и выражали в нмоль cGMP, образовавшегося за 10 мин в расчете на 1 мг белка [19], продукт выделяли преципитацией с карбонатом цинка и хроматографией на колонке с окисью алюминия [20]. Концентрацию белка определяли с помощью метода Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [21]. Для ингибирования активности sGC использовали ингибитор фермента ODQ (1H-[1,2,4]оксадиазол[4,3-α]хиноксалин-1-он) в диапазоне концентраций 5–100 мкМ [14]. Для оценки достоверности различий между средними значениями в контроле и опыте использовали t‑критерий Стьюдента.

Для определения продукции кератиноцитами цитокинов клетки гомогенизировали в тройном объеме ледяного натрий-фосфатного буферного раствора (PBS, pH 7.4), содержащего 1 мМ PMSF, апротинин, лейпептин, пепстатин А (10 мкг/мл каждого, и центрифугировали при 12 000 g (10 мин, 4°C). Концентрацию белка определяли по Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [21]. Иммуноферментный анализ проводили с помощью ELISA Kits (BD Biosciences, San Jose, CA) в соответствии с прилагаемой инструкцией.