Биоорганическая химия, 2021, T. 47, № 2, стр. 208-217

ВВЕДЕНИЕ

Африканская чума свиней (АЧС, англ. African swine fever, ASF) относится к наиболее опасным вирусным болезням домашних и диких свиней [1]. Возбудитель болезни – вирус африканской чумы свиней (African swine fever virus, ASFV) – представляет собой ДНК-содержащий вирус из рода Asfivirus, принадлежащего к семейству Asfarviridae. Высоковирулентные штаммы вируса АЧС могут приводить к 100%-ной смертности среди инфицированных животных.

АЧС эндемична в большинстве стран Африки, расположенных к югу от Сахары, где распространено свиноводство [2]. Первая вспышка АЧС в Европе была отмечена на Пиренейском полуострове в 1950-е гг., что вызвало дальнейшие спорадические вспышки в других европейских странах, таких как Франция, Италия, Бельгия, Нидерланды и Мальта [3]. В этих странах инфекция была к началу XXI века уничтожена посредством строгого контроля и программ искоренения, за исключением Сардинии, где она по-прежнему распространена среди домашних свиней. Однако АЧС вновь была занесена на европейский континент в 2007 г. через Грузию, из которой она распространилась в Армении, России, Белоруссии, Украине, Латвии, Литве и Эстонии [4].

АЧС имеет серьезные социально-экономические последствия как в случае стран с вновь обнаруженными очагами, так и в странах, где она является эндемичной в течение длительного времени. Особенно высоко ее влияние в тех странах, где значительную роль играет коммерческое свиноводство. Например, вспышки АЧС в Армении привели к огромным экономическим потерям. По данным Национальной статистической службы Республики Армения за 2014 г., в течение первого года вспышек АЧС (2007–2008 гг.) общее поголовье свиней в Армении сократилось на 56%, а объемы производства свинины снизились с 13 300 до 7500 т. Это имело серьезные последствия для продовольственной безопасности, т.к. продукция свиноводства является важным источником пищевого белка в Армении.

С 2007 г. продолжается распространение АЧС среди диких и домашних свиней на территории как европейской, так и азиатской части России. Суммарно в России было зафиксировано более 500 вспышек этого заболевания, было уничтожено более миллиона животных, а экономические потери превысили 30 млрд рублей [5, 6].

Борьба с АЧС опирается на раннее выявление очага инфекции и осуществление карантинных мероприятий, в том числе убоя зараженных свиней [7]. Однако в силу ряда социокультурных факторов, таких как традиционно свободный выгул свиней, незаконное перемещение животных и зараженного мяса, а также существование цикла с лесным природным носителем (дикий кабан), риск возникновения вспышек АЧС как в России, так и в Армении остается значительным. По данным Европейского управления по безопасности пищевых продуктов (EFSA) и Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (FAO), существует высокий риск сохранения АЧС в странах при недостаточных мерах санитарии и плохой организации борьбы с заболеванием. Таким образом, вспышки АЧС представляют собой значительную экономическую проблему как для Армении, так и для России.

Ситуация осложняется тем, что на сегодняшний день еще не создано вакцины против АЧС [8]. Из-за отсутствия эффективных вакцин применение противовирусных средств представляет собой альтернативный подход к борьбе с АЧС и снижению экономического ущерба от этого заболевания. Таким образом, поиск и разработка противовирусных препаратов, которые могут оказаться перспективным инструментом контроля за распространением АЧС, имеют особую актуальность.

Способность антисмысловых олигонуклеотидов (АСО) избирательно ингибировать экспрессию вирусных генов за счет комплементарного связывания с определенными последовательностями мРНК была впервые экспериментально продемонстрирована более 40 лет назад на примере вируса саркомы Рауса [9]. Бурное развитие химии и биологии нуклеиновых кислот в 1980–1990-е гг. предопределило возросший интерес к АСО в качестве инструментов нового терапевтического подхода к лечению не только вирусных инфекций человека, но и генетических и онкологических заболеваний, а также инфекционных болезней, вызываемых патогенными микроорганизмами [10–12]. В частности, противовирусный препарат фомивирсен (Витравен) стал первым официально одобренным лекарством на основе олигонуклеотида (1998 г.) [13].

Однако, несмотря на значительные успехи клинического использования АСО за прошедшие два десятка лет, их широкое внедрение в медицинскую практику до сих пор во многом замедляется недостаточно эффективным проникновением АСО в клетки и, как следствие, неблагоприятной фармакокинетикой [14]. Поэтому остается актуальной разработка систем доставки АСО в клетки, в том числе с использованием современных достижений в области нанотехнологии [15]. В частности, мезопористые наночастицы диоксида кремния mSiO₂ рассматриваются как одна из наиболее перспективных наноразмерных платформ для доставки лекарственных препаратов, в том числе противовирусных [16]. К преимуществам наночастиц mSiO₂ относятся высокая емкость, биоразлагаемость и низкая токсичность [17].

Целью данной работы являлось исследование противовирусной активности нанокомплексов, состоящих из аминомодифицированных наночастиц mSiO₂ и антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на ингибирование трансляции основного капсидного белка VP72 в культуре клеток Vero, инфицированных вирусом АЧС. Работа включала в себя получение новых наночастиц mSiO₂ с повышенной плотностью положительного заряда, которые обладали бы пониженной цитотоксичностью, и их электростатически связанных нанокомплексов с АСО на основе как традиционных тиофосфатных (рис. 1а), так и новых мезилфосфорамидных олигодезоксирибонуклеотидов (рис. 1б), нацеленных на мРНК VP72. Ранее было показано, что мезилфосфорамидные аналоги ДНК в культуре клеток проявляют высокую антисмысловую активность, превосходящую активность тиофосфатных олигодезоксирибонуклеотидов [18].

Рис. 1.

Структуры антисмысловых олигодезоксирибонуклеотидов с модифицированными фосфатными группами: (а) – тиофосфатными (PS); (б) – мезилфосфорамидными (µ). В – азотистое основание: аденин, гуанин, тимин или цитозин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Антисмысловые олигонуклеотиды способны блокировать биосинтез вирусных белков путем комплементарного связывания с вирусной РНК и активации ее расщепления клеточными нуклеазами, например, РНКазой Н [19]. Была продемонстрирована противовирусная активность АСО и малых интерферирующих РНК (small interfering RNA, siРНК) в отношении ряда опасных вирусных инфекций [20, 21]. Однако до настоящего времени не было известно ни одного примера АСО, эффективных против вируса АЧС. Нам удалось найти лишь единственное сообщение об ингибировании биосинтеза вирусных белков A151R и VP72 с помощью siРНК [22]. Таким образом, выбор белка VP72 в качестве мишени для антисмыслового ингибирования был обоснован литературными данными. В настоящей работе нам удалось впервые подобрать последовательности АСО, нацеленных на мРНК VP72, которые на порядок снижали титр вируса АЧС в инфицированных клетках Vero при доставке в виде нанокомплексов с наночастицами mSiO₂.

Последовательность гена основного капсидного белка VP72 вируса АЧС (штамм BA71V) была получена с использованием базы данных PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M34142.1). При выборе длины АСО мы руководствовались оптимальной стабильностью каждого из гибридных дуплексов (значение свободной энергии Гиббса от –8 до –10 ккал/моль), образованных АСО с РНК-мишенью, которая способствует максимальной прочности связывания. Способность молекулы мРНК вируса АЧС в области, соответствующей белку VP72, формировать пространственную структуру за счет внутримолекулярных взаимодействий была смоделирована с помощью компьютерной программы, предсказывающей возможные вторичные структуры молекул ДНК и РНК (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold). Последовательности АСО были нацелены на участки мРНК VP72, не образующие выраженной вторичной структуры. Были подобраны олигонуклеотиды длиной 22–23 нт к трем участкам вирусной мРНК, которые затем были синтезированы в двух вариантах: серия S с тиофосфатными (PS) межнуклеотидными группами и серия D с мезилфосфорамидными (μ) межнуклеотидными группами (см. “Эксперим. часть”). Последовательности и обозначения АСО приведены в табл. 1.

Для улучшения доставки олигонуклеотидов в клетки были использованы аминофункционализованные мезопористые наночастицы диоксида кремния (mSiO₂) размером 60–80 нм [17], которые, как мы обнаружили, отличаются относительной устойчивостью к агрегации и меньшей цитотоксичностью для клеток Vero по сравнению с использованными ранее коммерческими аминофункционализованными наночастицами SiO₂ размером 20–30 нм (SkySpring Nanomaterials Inc., СШA) [23, 24]. Мезопористые наночастицы mSiO₂, впервые рассмотренные в работе Vallet-Regi et al. [25], привлекли внимание как средства доставки лекарств из-за высокой химической и термической стабильности, большой площади поверхности, равномерного и настраиваемого размера пор, облегченной функционализации поверхности, низкой токсичности и хорошей биосовместимости [26–30]. Аминофункционализованные наночастицы mSiO₂ (mSiO₂–NH₂) часто применялись для контролируемого высвобождения различных лекарственных препаратов: анальгетиков, антибиотиков, противоопухолевых препаратов и др. [31–39]. Функционализация поверхности аминогруппами в указанных статьях проводилась, как правило, с помощью 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES). В данной работе проводили функционализацию поверхности наночастиц mSiO₂ остатками 1,2-этилендиамина с целью увеличения плотности катионных групп для улучшения электростатического комплексообразования с анионными олигонуклеотидами, несущими модифицированные фосфатные группы: тиофосфатные или мезилфосфорамидные (рис. 1а и 1б соответственно). Для этого наночастицы обрабатывали 3-(2-аминоэтиламино)-пропилдиметоксиметилсиланом в условиях, аналогичных функционализации APTES. Данные наночастицы (mSiO₂–R2) оказались самыми эффективными по связыванию олигонуклеотида в электростатический комплекс. Наночастицы, модифицированные APTES или 3-[2-(2-аминоэтиламино)-этиламино]пропилтриметоксисиланом или содержащие золотое ядро (Au@SiO₂–NH₂) [17], показали меньшую загрузку по олигонуклеотиду в тех же условиях (табл. 2). ξ-Потенциал нанокомплекса mSiO₂–R2 с модельным 17-звенным олигонуклеотидом Т403 оставался положительным, однако его величина уменьшалась с +32.3 до +23.7, что согласуется с образованием ионного комплекса (табл. 2). Массовое отношение (mSiO₂–R2/Т403) составило 12.7, что почти вдвое выше отношения, полученного в работе Xu et al. [40]. В работе Xu et al. использовали такой же аминосилан и 18‑звенный олигонуклеотид, однако наночастицы SiO₂ не были мезопористыми.

Таким образом, в качестве эффективного носителя для доставки олигонуклеотидов для дальнейших экспериментов были выбраны модифицированные этилендиаминовыми группами наночастицы мезопористого диоксида кремния mSiO₂–R2. Полученные наночастицы, имеющие положительный ξ-потенциал при рН 7.0, были использованы для формирования ионных нанокомплексов с АСО (табл. 1), биологическая активность которых была исследована далее.

Определение цитотоксичности нанокомплексов АСО для клеток Vero с помощью МТТ-теста выявило выраженную цитотоксичность при концентрациях >500 нМ (рис. 2), в то время как свободные олигонуклеотиды без наночастиц показали меньшую цитотоксичность, что могло быть вызвано тем, что олигонуклеотиды слабее проникали в клетки вне нанокомплекса. В последующих экспериментах нанокомплексы олигонуклеотидов S054 и S055 были использованы в концентрации 500 нМ, а нанокомплексы олигонуклеотидов S056, D605, D607, D608 – в концентрации 250 нМ.

Рис. 2.

Цитотоксичность нанокомплексов антисмысловых олигонуклеотидов (АСО) для клеток Vero по результатам тестов МТТ. Последовательности АСО представлены в табл. 1.

Для изучения противовирусного эффекта клетки Vero инфицировали вирусом АЧС BA71V, после чего сразу же обрабатывали нанокомплексами указанных олигонуклеотидов. Контрольная группа клеток Vero была обработана АСО в присутствии трансфекционного реагента Липофектамин 3000 (Invitrogen, США), после чего клетки инфицировали вирусом АЧС и определяли противовирусную активность вышеупомянутых олигонуклеотидов вне нанокомплексов.

Нанокомплексы S054 и S055 уменьшали титр вируса на ~0.3 log TCID₅₀/мл, что эквивалентно ~60% подавления (рис. 3). При применении свободных АСО противовирусная активность была выражена слабее (<0.3 log TCID₅₀/мл), что свидетельствует о том, что олигонуклеотиды в составе нанокомплексов лучше проникают в клетку и, как следствие, проявляют более выраженную противовирусную активность.

Рис. 3.

Титр вируса АЧС (log  TCID₅₀/мл) после воздействия нанокомплексов АСО через 24 ч после инфицирования клеток Vero вирусом АЧС. Достоверность результатов оценивали с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента. * p < 0.05.

На следующем этапе исследований было изучено комбинированное влияние нанокомплексов олигонуклеотидов на репродукцию вируса АЧС. Для этого инфицированные клетки обрабатывали тремя группами нанокомплексов АСО: 1) по 500 нМ S054 и S055; 2) 250 нМ S054 и 500 нМ S055; и 3) 500 нМ S054 и 250 нМ S055. Максимальное падение титра вируса (~1.0 log TCID₅₀/мл) было зафиксировано в случае, когда концентрация обоих нанокомплексов составляла 500 нМ (рис. 4).

Рис. 4.

Изменение титра вируса АЧС (log TCID₅₀/мл) при комбинированном воздействии двух наиболее активных нанокомплексов АСО в различных концентрациях. Достоверность результатов оценивали с помощью двустороннего t‑критерия Стьюдента. * p < 0.05.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и оборудование. Для офВЭЖХ использовали ацетонитрил UHPLC grade Supergradient (Panreac, Испания). Раствор (2 М) ацетата триэтиламмония (ТЕАА), рН 7.0, был приготовлен из триэтиламина ACS grade (Panreac, Испания) и ледяной уксусной кислоты (осч, Россия). Дихлоруксусная кислота, иод, 0.25 М раствор 4,5-дицианимидазола (DCI) в безводном ацетонитриле, тетраэтилортосиликат, 3-(2-аминоэтиламино)пропилдиметоксиметилсилан, красители Stains-All, ксиленцианол FF и бромфеноловый синий (BP) были приобретены у компании Sigma-Aldrich (США); метансульфохлорид, азид натрия и перхлорат натрия – у Acros Organics (США), дихлорметан, тетрагидрофуран, пиридин и триэтиламин – у Panreac (Испания). Формамид, акриламид, N,N ′-метилен-бис-акриламид, мочевина, трис(гидроксиметил)-аминометан (Трис), борная кислота, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂ЭДТА) были приобретены у компании Диаэм (Россия). Концентрированный водный раствор аммиака (осч), концентрированная HCl (осч), уксусная кислота (осч), ацетон (осч), н-гексан и этанол были отечественного производства. Все реактивы были наивысшей степени чистоты, доступной у соответствующих коммерческих поставщиков. Ацетонитрил (UHPLC grade Supergradient, Panreac, Испания) для синтеза олигонуклеотидов кипятили 6 ч над CaH₂ в атмосфере аргона, затем перегоняли в атмосфере аргона и хранили под аргоном над молекулярными ситами 3 Å. Бидистиллированную воду подготавливали непосредственно в лаборатории.

Для центрифугирования небольших объемов растворов использовали микроцентрифугу MiniSpin Рlus (Eppendorf, ФРГ). Химические реакции проводили с использованием термошейкера Thermomixer Compact (Eppendorf, ФРГ). Растворы встряхивали с помощью вортекса BioVortex V1 (Biosan, Эстония). Гель-электрофорез проводили с использованием установки для электрофореза (Bio-Rad, США). Небольшие объемы растворов олигонуклеотидов (до 1.5 мл) концентрировали с помощью вакуумного концентратора Savant SpeedVac DNA120ОР (Thermo Fisher Scientific, США).

Олигонуклеотиды были получены с помощью автоматического синтезатора ДНК/РНК ASM-800 (ООО “Биоссет”, Новосибирск, Россия) согласно протоколам фосфитамидного синтеза в стандартных реакторах объемом 25–50 мкл в масштабе 0.2–0.4 мкмоль из соответствующих β-цианэтил-N,N-диизопропилфосфитамидов дезоксирибонуклеозидов и полимерных носителей на основе пористого стекла с размером пор 1000 Å с привитыми дезоксирибонуклеозидами (Sigma-Aldrich, США). Тиофосфатные (PS) олигонуклеотиды [41] синтезировали с использованием 0.05 М раствора 3‑((диметиламинометилиден)амино)-3H-1,2,4-дитиазол-3-тиона (Sulfurizing Reagent II; Glen Research, США) в смеси пиридин–ацетонитрил (1 : 1, v/v). Мезилфосфорамидные (μ) олигонуклеотиды синтезировали по оригинальной методике при помощи реакции Штаудингера на твердой фазе с использованием мезилазида (метансульфонилазида) [42]. Мезилазид получали in situ из метансульфохлорида и азида натрия в ацетонитриле согласно работе Matano et al. [43] и использовали в виде 0.5 М раствора в ацетонитриле (ОСТОРОЖНО! Мезилазид в чистом виде может быть взрывоопасен! [44]). ИК-, ¹Н- и ¹³С-ЯМР-спектры полученного мезилазида были идентичны приведенным в литературе [43].

Для аналитической ВЭЖХ использовали хроматограф Agilent 1220 (Agilent Technologies, США) c УФ-детекцией при длине волны 260 нм, колонкой ZORBAX Eclipse XDB-C18 (5 мкм, 4.6 × 150 мм; Agilent Technologies, США). Элюцию осуществляли в градиенте ацетонитрила в 20 мМ ТЕАА, рН 7.0, от 0 до 60% за 30 мин и скорости потока 1 мл/мин. Выделение олигонуклеотидов проводили с помощью хроматографа Waters 600E (Waters Corp., США) c УФ-детекцией при длинах волн 190, 260, 280 нм и колонкой ZORBAX Eclipse PrepHT XDB-C18 (7 мкм, 21.2 × 150 мм; Agilent Technologies, США) в градиенте ацетонитрила в 20 мМ ТЕАА, рН 7.0, от 0 до 60% за 30 мин при скорости потока 21 мл/мин.

PS-олигодезоксирибонуклеотиды получали с 4,4′-диметокситритильной группой (DMTr) на 5′-конце, собирали DMTr-содержащую фракцию, DMTr-группу отщепляли обработкой 80%-ной уксусной кислотой при комнатной температуре в течение 15 мин, осаждали олигонуклеотид 3%-ным NaClO₄ в ацетоне, отделяли осадок центрифугированием, промывали ацетоном, высушивали на воздухе, растворяли в бидистиллированной воде и определяли концентрацию по оптической плотности раствора с помощью УФ-спектрофотометра NanoDrop 2000с (ThermoFisher Scientific, США).

μ-Олигонуклеотиды были синтезированы в режиме без сохранения 5′-DMTr-группы (“DMTr OFF”) с выделением с помощью препаративного гель-электрофореза в 20%-ном ПААГ толщиной 2–3 мм в денатурирующих условиях и обессоливанием на колонке NAP-25 с сорбентом Sephadex G-25 (GE Healthcare, Великобритания) в виде натриевой соли. Для контроля качества олигонуклеотидов проводили аналитический электрофорез в 20%-ном ПААГ толщиной 0.4 мм в аналогичных условиях: акриламид – N,N ′-метилен-бис-акрил-амид (30 : 1), 8 М мочевина, 90 мМ Трис-борат, pH 8.3, 2 мМ Na₂ЭДTA при напряжении 50 В/см. Олигонуклеотиды наносили в растворе, содержавшем 8 М мочевину, 0.05% ксиленцианола FF и 0.05% бромфенолового синего. Визуализацию полос проводили окрашиванием геля раствором красителя Stains-All (500 мг/л) в формамиде с последующей отмывкой дистиллированной водой.

Молекулярные массы олигонуклеотидов определяли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF на приборе Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, Германия). Масс-спектры олигонуклеотидов получали в линейном режиме отрицательных ионов прибора и в диапазоне m/z от 500 до 16 000 Да. Параметры измерения включали также частоту импульсов 25 Гц, ускоряющее напряжение 25.0 кВ и время задержки экстракции ионов 120 нс. Образцы олигонуклеотидов растворяли до концентрации 0.1 мM в водном буфере, содержавшем 20 мM ТЕАА и 60% ацетонитрила. Объем анализируемого образца составлял 10 мкл. Аликвоту раствора образца объемом 0.7 мкл смешивали на подложке (Ground Steel или AnchorChip) с 0.7 мкл раствора матрицы, приготовленного согласно базовому протоколу производителя (Bruker Daltonics, Германия). Матрицей для ионизации олигонуклеотидов в отрицательном режиме служил 2,6-дигидроксиацетофенон (2,6-DHAP) с добавлением дигидроцитрата аммония. Итоговый масс-спектр получали суммированием 8–20 одиночных спектров по 100 импульсов лазера на точку. Калибровку прибора проводили с использованием калибровочных стандартов (Bruker Daltonics, Германия), а также набора олигодезоксирибонуклеотидов с известными массами. Молекулярные массы олигонуклеотидов рассчитывали, используя наборы экспериментальных значений m/z, определенных для каждого анализируемого образца.

Общая методика получения олигонуклеотидов с межнуклеотидными мезилфосфорамидными (μ) группами [42]. Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали фосфитамидным методом с использованием автоматического синтезатора ДНК/РНК. Мезилфосфорамидную группу вводили в автоматическом режиме. Для этого после удаления 5′‑DMTr-группы привитого к полимерному носителю нуклеозида или олигонуклеотида с помощью 3%-ного раствора дихлоруксусной кислоты в дихлорметане проводили конденсацию соответствующего фосфитамида (0.1 М раствор в безводном ацетонитриле) и кэпирование с использованием реагента Fast Deprotection Cap (Sigma-Aldrich, США), после чего осуществляли реакцию Штаудингера на твердой фазе с помощью 0.5 М раствора мезилазида в абсолютном ацетонитриле в течение 30 мин при комнатной температуре. После окончания автоматизированного синтеза олигонуклеотид отщепляли от полимерного носителя и деблокировали концентрированным (∼25–30%) водным раствором аммиака (200 мкл на ∼5 мг полимера) при 55°С в течение 16 ч. Аммиак упаривали в вакууме досуха с помощью вакуумного концентратора SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, США), добавляли 100 мкл 20 мМ ТЕАА, рН 7.0, отделяли супернатант от полимерного носителя, олигонуклеотид анализировали и выделяли с помощью электрофореза в ПААГ, как описано выше.

Получение ионных нанокомплексов олигонуклеотидов с мезопористыми наночастицами диоксида кремния, модифицированными остатками 1,2‑этилендиамина. Синтез исходных мезопористых наночастиц кремнезема mSiO₂ был проведен аналогично описанному в литературе [45]. Применяли следующие условия: 0.25 г бромида цетилтриметиламмония (CTAB) растворяли в 35 мл деионизованной воды при перемешивании, добавляли 1.5 мл концентрированного водного аммиака (28–30%), затем по каплям в течение 1 ч при непрерывном перемешивании прибавляли смесь н-гексана (5 мл) и тетраэтилортосиликата (1 мл). Температура реакции составляла 35°С. В результате перемешивания в течение 8 ч получали гомогенный белый коллоидный раствор. Осадок собирали центрифугированием и несколько раз промывали деионизованной водой и затем этанолом. Для удаления избытка CTAB осадок диспергировали в растворе 1 М HCl (4 мл) и этанола (120 мл) и кипятили с обратным холодильником в течение 6 ч.

Для модификации поверхности остатками 1,2‑этилендиамина наночастицы mSiO₂ (50 мг) суспендировали в абсолютном этаноле (10 мл), перемешивали 10 мин, прибавляли 20 мкл 3-(2-аминоэтиламино)пропилдиметоксиметилсилана и кипятили с обратным холодильником в течение 6 ч. Затем осадок центрифугировали и несколько раз промывали этанолом. Продукт ресуспендировали в воде. Количество аминогрупп после модификации оценивали пикратным методом [46] по УФ-поглощению пикриновой кислоты в 5% ТЕА в этаноле при 358 нм (ɛ 14 500).

Значения гидродинамического диаметра и ξ‑потенциала полученных наночастиц определяли на приборе Zetasizer Nano ZS Plus (Malvern, Великобритания) при комнатной температуре и концентрации 0.2 мг/мл в деионизованной воде с использованием кюветы DTS1070 и усредняли по трем измерениям.

Комплексообразование с олигонуклеотидами проводили в водном растворе при рН 7.0, при котором ξ-потенциал mSiO₂–R2 положителен. Положительно заряженные частицы и отрицательно заряженный олигонуклеотид вступали в электростатическое взаимодействие, в результате чего образовывался ионный комплекс. Реакцию проводили при комнатной температуре с перемешиванием на шейкере. Перед реакцией наночастицы диспергировали в воде с помощью ультразвука в течение 1–2 мин. Время реакции составляло 2 ч. Количество наночастиц рассчитывали так, чтобы соотношение числа аминогрупп mSiO₂–R2 на одну модифицированную фосфатную группу олигонуклеотида составляло 5 : 1. По окончании реакции наночастицы отделяли центрифугированием и после удаления супернатанта дважды промывали водой. Емкость нанокомплекса по олигонуклеотиду определяли по УФ-поглощению при 260 нм содержащегося в супернатанте и промывках не вступившего в комплексообразование олигонуклеотида (ɛ 159 200).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, мы показали, что антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на мРНК основного капсидного белка VP72 вируса африканской чумы свиней, в составе ионных нанокомплексов с мезопористыми наночастицами диоксида кремния, модифицированными остатками 1,2‑этилендиамина, более эффективно снижают титр вируса АЧС в инфицированных клетках Vero, чем те же олигонуклеотиды, но без наночастиц. Это можно объяснить тем, что нанокомплексы более эффективно проникают в клетки по сравнению со свободными олигонуклеотидами (даже в присутствии Липофектамина 3000). Однако максимальное снижение количества вируса (~1.0 log TCID₅₀/мл) наблюдалось только при комбинированном использовании двух наиболее эффективных АСО в концентрации 500 нМ. Следует отметить, что антисмысловые олигонуклеотиды, способные снижать репликацию вируса АЧС, до сих пор не были известны из опубликованной литературы. В то же время противовирусная активность исследованных нанокомплексов АСО, нацеленных на мРНК VP72, оказалась недостаточной для того, чтобы их можно было считать перспективными кандидатами для борьбы с АЧС. Тем не менее полученные данные могут служить отправной точкой для дальнейших исследований по повышению эффективности противовирусного действия нанокомплексов антисмысловых олигонуклеотидов в отношении вируса африканской чумы свиней.